一种胰腺炎和胰腺早癌诊断和治疗的新靶标Claudin-10

一种胰腺炎和胰腺早癌诊断和治疗的新靶标claudin-10
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体来说涉及胰腺癌的诊断和治疗，claudin-10作为胰腺炎的易感因素，可作为诊断和治疗胰腺炎和胰腺癌的靶点。


背景技术：

2.胰腺癌是致死率极高的癌症之一，素有“癌症之王”的称号，胰腺癌高死亡率的主要原因是早期无症状和治疗抵抗。胰腺炎是胰腺癌的危险因素，胰腺炎是影响胰腺外分泌部分的疾病，胰腺炎的诊断和治疗是早期检测和预防胰腺癌的重要方向。目前，prss1、spink1、ctrc和cftr的致病突变与胰腺炎的风险密切相关。
3.胰腺外分泌部分由上皮细胞(腺泡和导管细胞)构成，紧密连接在上皮细胞间形成屏障和细胞旁通道。claudin-10是紧密连接蛋白claudin家族的成员之一，于1999年首次在人类基因数据库中被提及。人和鼠的cldn-10基因含有六个外显子，通过选择性剪接形成不同的亚型，claudin-10a和claudin-10b是主要的亚型。claudin-10a在肾脏中表达，具有阴离子渗透性。claudin-10b则在脑、肺、肾、唾液腺、汗腺和胰腺等器官广泛表达，claudin-10b参与形成紧密连接并具有细胞旁阳离子通道的作用，在mdck细胞中过表达claudin-10b，发现其对na
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具有强烈的偏好。claudin-10b在肾脏中参与na
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的重吸收，claudin-10的缺失会减少na
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的细胞旁重吸收，同时引起肾脏对mg
2+
和ca
2+
的过度重吸收，形成高镁血症和低钙尿症。claudin-10的致病突变还会产生少汗症、电解质失衡、泪腺功能障碍、鱼鳞病和口干症等症状。研究发现claudin-10b在汗腺、唾液腺和泪腺中的分布或功能受损会导致na
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和水分泌的受损。
4.胰腺的外分泌部分负责分泌带有消化酶的胰液进入肠道参与食物消化，人类胰腺每天分泌1-2升的胰液，胰液是碱性的等渗流体。腺泡细胞在乙酰胆碱、胆囊收缩素或其他激动剂刺激下，细胞内钙增加并刺激nacl和液体分泌，以及含酶分泌颗粒的胞吐作用。ci-通过ca
2+
激活的ci-通道进入顶端腔内，na
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通过细胞旁途径进入腔内。claudin-10在胰腺的腺泡细胞膜表达。同时，导管细胞会分泌hco3-以维持碱性胰液。cftr是胰腺炎的致病基因，cftr的缺乏会导致胰腺功能不全。同时，cftr在维持紧密连接组织和屏障功能方面发挥重要作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对目前胰腺癌早期无症状且缺乏检测靶标，而胰腺炎是胰腺癌的重要危险因素等现状。发现claudin-10的丢失使得个体对炎症的敏感度增加，并且claudin-10抑制了胰腺癌细胞的增殖，从而为胰腺癌的早期诊断和治疗提供了一个新的靶标。
6.胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，pdac)是胰腺最常见的恶性肿瘤，占胰腺癌病例的85％以上。胰腺炎是胰腺癌的重要危险因素，研究胰腺炎的发病机理是寻找胰腺癌早期诊疗靶标的重要方向，胰腺炎的致病因素以及进一步发展为胰腺癌的机
理仍不清楚。紧密连接在参与细胞连接、维持细胞极性和建立组织屏障等方面发挥功能，胰腺炎和胰腺癌的发生总伴随着细胞极性的改变、炎症细胞浸润以及组织紊乱度增加。申请人提供claudin-10在相较于正常胰腺的炎症损伤和癌组织中的表达明显下降，claudin-10的丢失增加了小鼠对炎症的易感性且不利于炎症恢复。并且，claudin-10抑制了胰腺癌细胞的增殖。随后，我们对claudin-10的促炎机制展开研究。claudin-10作为na
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的细胞旁通道与胰液的正常分泌有关，claudin-10的丢失导致na
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的细胞旁通路受阻，na
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无法正常从腺泡基底侧流向顶端管腔，从而导致酶原在胰腺提早激活，引发组织损伤和炎症。因此，claudin-10的丢失是人胰腺炎的易感因素，并可作为胰腺癌的诊断和治疗靶标。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
8.本发明的第一方面，提供紧密连接蛋白claudin-10抗体、引物、下调剂和过表达载体及其在胰腺癌早期诊断和治疗的应用。
9.进一步的，所述的紧密连接蛋白claudin-10抗体是多克隆抗体，能识别人源和鼠源的claudin-10蛋白，并且能应用于wb、免疫组化、免疫荧光和细胞免疫荧光等技术。
10.进一步的，所述的紧密连接蛋白claudin-10的引物是针对claudin-10b设计的短片段，能够利用实时荧光定量pcr技术检测claudin-10b的mrna的表达量。
11.进一步的，所述的紧密连接蛋白claudin-10的下调剂是针对claudin-10设计的短rna序列，能够特异性靶向claudin-10的mrna从而下调蛋白表达。
12.进一步的，所述的紧密连接蛋白claudin-10的过表达载体是根据人源claudin-10b构建的过表达质粒，能实现外源过表达claudin-10b蛋白。
13.进一步的，claudin-10在胰腺炎和胰腺癌的损伤部位低表达，claudin-10丢失增加了个体对炎症的敏感度。
14.进一步的，所述claudin-10丢失增加了个体对炎症的敏感度，claudin-10的丢失使得胰液分泌过程中，na
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的细胞旁通路受阻，引起液体分泌受阻从而导致消化酶提早激活，加重了炎症。
15.进一步的，发现claudin-10能抑制胰腺癌细胞的增殖。
16.本发明的优点在于，针对胰腺癌早期无症状且缺乏检测靶点这一现状提供了claudin-10这一新靶标，其低表达促进了炎症和胰腺癌的发展，claudin-10抑制胰腺癌细胞增殖。claudin-10的抗体或引物能测定其表达水平并以此分析炎症和癌症进展阶段，以claudin-10为靶点设计药物可能起到抑制胰腺癌发展的作用。
附图说明
17.图1为claudin-10在人胰腺炎和胰腺癌的表达降低图；
18.图2描述了claudin-10的转录水平在胰腺炎和胰腺癌动物模型中的表达变化，claudin-10的转录水平在炎症和胰腺癌中的表达逐渐降低，并在炎症恢复过程中逐渐恢复表达图；
19.图3描述的是claudin-10的蛋白和rna水平在胰腺炎和胰腺癌动物和细胞模型中的表达降低图；
20.图4描述的是claudin-10的敲除增加了小鼠对炎症的敏感度图；
21.图5描述的是claudin-10的敲低和过表达影响了细胞增殖图。
具体实施方式：
22.以下通过具体实施方式来进行进一步的详细描述，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本研究领域的常规技术。除非另有说明，下述实施例中所用到的试剂和材料均可由市场购得。
23.pl-45细胞购自广州市深华生物技术有限公司；panc-1细胞购自广州赛库生物技术有限公司；266-6细胞购自北京中源合聚生物科技有限公司。细胞在37℃，5％ co2条件的细胞培养箱中培养，培养基含有5％或10％的胎牛血清和青霉素/链霉素。
24.抗claudin-10(38-8400)和amylase(pa5-117115)抗体购自invitrogen；抗ck-19(ab52625)抗体购自abcam；抗sox-9(ab5535)抗体从sigma购买；苏木素-伊红(he)染色试剂盒(c0105m)购自碧云天公司；gtvisiontmⅲ抗鼠兔通用型免疫组化检测试剂盒(gk500710)从dako购买；反转录试剂盒(rr047a)购自takara公司；tb green premix ex taq(rr420a)购自takara；sds-page凝胶快速配制试剂盒(kgp113k)在凯基生物购买；改良天狼星红染色试剂盒(g1472)购自solarbio公司；cck-8细胞增殖与毒性检测试剂盒(ck04)购自同仁；lipofectamine 3000脂质体(l3000-015)购自invitrogen公司；sds-page蛋白上样缓冲液(变性)(5x)(ar1112-10)购自博士德公司；recombinant human tgf-alpha protein,cf因子(239-a-100)购自r&d；雨蛙素(hy-a0190)购自mce。
25.特异性靶向sirna购自吉玛基因，序列如下表；鼠源claudin-10b的引物由生工生物工程股份有限公司合成；人源claudin-10b的过表达载体在金斯瑞生物科技公司构建，orf区克隆到pcdna3.1+c-dyk载体上。
26.sirnasense(5'-3')antisense(5'-3')mouse-claudin-10-si1ggcuguucccuguaugcaattuugcauacagggaacagccttmouse-claudin-10-si2ggauguaaauguucuuauattuauaagaacauuuacauccttmouse-claudin-10-si3ggcauguagaggacuaaugttcauuaguccucuacaugcctt
27.引物frmouse-claudin-10bcaccgactactggaaggtctctgtagcccattctgggtgtchuman-claudin-10bctgtggaaggcgtgcgttacaaagaagcccaggctgaca
28.c57bl/6j小鼠统一由华南理工大学动物实验中心代购代养，来源于广州斯嘉景达生物科技有限公司。claduin-10
flox/+
小鼠由南模生物构建，小鼠claudin-10位于14染色体。将loxp序列插入2号外显子之前和3号外显子之后，当cre酶工作后将2号和3号外显子敲除，能成功敲除claudin-10的所有亚型的表达。pdx1-cre；claudin10-/+
和pdx1-cre；claudin10-/-小鼠由pdx1-cre；claudin10-/+
小鼠和claduin-10
flox/+
小鼠交配所得。kc小鼠是由pdx1-cre小鼠和lsl-kras
g12d
小鼠交配所得。所有实验用鼠均饲养于spf级屏障内，动物实验的开展经由华南理工大学实验动物伦理委员会批准，并在实验过程中遵循动物福利原则。
29.实施例1：生信分析
30.本发明的生信分析数据均来源于gene expression omnibus(geo)数据集中单细胞转录组测序数据。数据质控与预处理：应用r的seurat包对于下载的数据集根据以下过滤标准对细胞进行质量控制：根据细胞筛选基因细胞基质的原始转录计数，以去除转录数少于200的细胞及高于6000的细胞；以及含有超过5％或10％线粒体基因的细胞。此外，将在少
于3个细胞中表达的基因从分析中移除。之后，应用normalizedata函数依据文库大小进行归一化，使用scaledata函数按所有细胞文库大小的中位数来进行数据的标准化。
31.图1中的a图、b图的结果显示：claudin-10的转录水平在人胰腺炎和胰腺癌中的表达水平降低。图1中a图生信分析claudin-10的转录水平在正常胰腺(normal)、慢性胰腺炎(cp)和肿瘤(tumor)中的表达水平，数据来源于geo数据库gse143754，数据库包含26个胰腺头部组织样本的转录组分析，26个样本中包含6个慢性胰腺炎样本，11个胰腺癌样本和9个正常样本。结果显示，与正常胰腺对比，claudin-10的转录水平在慢性胰腺炎和胰腺癌中减少，且差异具有统计学意义。
32.图1中b图描述的是claudin-10的转录水平在正常、原位癌和转移癌中的表达水平，数据来源于gse71729，包含145个原发性和61个转移性pdac肿瘤，17个细胞系，46个胰腺和88个远处相邻的正常样本。结果显示，与正常胰腺相比，claudin-10的转录水平在原位癌和转移癌中均降低，且具有统计学意义。
33.图2描述了claudin-10的转录水平在胰腺炎和胰腺癌动物模型中降低，claudin-10在胰腺损伤修复的过程中逐渐恢复表达水平。其中，图2中a图是利用生信分析claudin-10的转录水平在对照组(naci)和雨蛙素(cae)诱导后的小鼠胰腺中的表达变化。数据库来源于gse41418，其实验方法是在雨蛙素诱导慢性胰腺炎后(雨蛙素是一种胆囊收缩素类似物，腹腔注射时可诱发急性胰脏炎)，从8周龄的jackson和harlan小鼠的胰腺中分离出rna。以注射生理盐水的小鼠作为对照，实验采用的实验组和对照组各三只小鼠。结果显示，claudin-10的转录水平在雨蛙素诱导的胰腺炎小鼠模型中降低。
34.图2中b图描述的是生信分析claudin-10的转录水平在正常、kras
g12d-1w和kras
g12d-2w的小鼠中的表达变化。数据库来源于gse77983，其中，转基因kras
g12d
小鼠可模拟人胰腺癌的发展过程，是胰腺癌研究的常用动物模型，雨蛙素诱导的急性胰腺炎会加速kras
g12d
小鼠的疾病进程。实验共分为两组，实验组是kras
g12d
小鼠急性雨蛙素诱导的胰腺炎(n＝6)。实验组3只小鼠给予1周雨蛙素注射，其余3只小鼠给予2周的雨蛙素注射。所有实验组小鼠均于1月龄开始接受注射，并于注射后最后一天处死。对照组是无急性胰脏炎诱导的野生型小鼠(n＝6)，小鼠在1.5个月大的时候处死，收取胰腺。结果显示，claudin-10的转录水平在kras
g12d
驱动的胰腺癌模型中降低。
35.图2中c图描述的是生信分析claudin-10的单细胞转录表达水平在雨蛙素损伤后的修复再生过程中的表达变化。数据库来源于gse180212，经雨蛙素给药诱导急性炎症后，分别在处理后第一天(d1)、第七天(d7)和第28天(d28)收取样本(雨蛙素诱导急性胰腺炎后，炎症会逐渐加重然后慢慢恢复)。结果显示，claudin-10的单细胞转录水平随着炎症程度变化而经历了从降低到恢复的过程。
36.图2中d图生信分析claudin-10的单细胞转录水平在不同时期的kras
g12d
模型小鼠中的表达变化。数据库来源于gse141017，kras模型小鼠是ptf1a-creer；lsl-kras
g12d
；lsl-tdtomato，在小鼠6-8周龄时注射他莫昔芬，诱导kras
g12d
激活表达，并在他莫昔芬注射后的6个不同时间点收集胰腺用于单细胞纯化。结果显示，claudin-10的表达水平随着kras
g12d
诱导的疾病进展减少。
37.实施例2：组织芯片分析
38.胰腺癌组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司，由福尔马林固定，共有90例，含
有170点。采用免疫组化(ihc)检测claudin-10在胰腺癌、癌前病变和正常组织中的表达情况。ihc的实验步骤包括：60℃烤片30分钟，常规脱蜡水化；tris-edta(ph9.0)高火煮沸，低火维持15min，自然冷却至室温。tbst清洗三次，每次5min。用3％h2o
2-甲醇封闭内源性过氧化物酶，室温灭活10分钟，tbst洗3次，每次5分钟。10％山羊血清封闭一小时，4℃一抗孵育过夜。回收一抗，tbst清洗三次，每次5min。ihc二抗室温孵育一小时，tbst清洗3次，每次5min。dab显色，终止染色后，苏木素复染。常规脱水透明，中性树胶封片。
39.组织芯片评分标准：对组织芯片上每点的染色结果进行定位后根据细胞显色强度进行评分：评分范围0-12分，0分为不着色为阴性(-)、1-4分着浅棕色为弱阳性(+)，5-8分着棕色为阳性(++)，9-12分着棕褐色为强阳性(+++)；log-rank检验对得到的组织标本染色结果进行统计分析。
40.图1中c图、d图结果显示：claudin-10在人正常胰腺的腺泡表达，在胰腺癌前体病变(panin和adm)和胰腺癌中的表达水平降低。图1中c图在胰腺癌组织芯片中检测claudin-10在正常胰腺、胰腺癌前体病变(adm和panin)和胰腺癌的表达水平对比。结果显示claudin-10在胰腺癌及癌前病变中的表达水平都降低。图1中d图是利用免疫组化染色展示claudin-10在人正常胰腺和癌变部位的表达情况。结果显示，claudin-10在胰腺的腺泡细胞膜表达，在胰腺癌病变部位丢失。
41.实施例3：胰腺炎动物模型的构建
42.pdl小鼠模型的构建：本实验所用的小鼠均为spf级屏障内小鼠，使用成年的野生型小鼠，进行导管结扎手术。结扎七天后，取小鼠胰腺组织。雨蛙素小鼠模型的构建：取成年的野生型小鼠，进行腹腔注射雨蛙素构建急性胰腺炎模型。按照80ug/kg的剂量，每天打8次，连续打两天。注射完48h后，收取胰腺组织，小鼠胰腺形成炎症病变。kc小鼠模型在胚胎期已激活kras
g12d
的表达，随着小鼠年龄增长可自发的在胰腺组织中形成adm和panin病变。
43.图3中a图的结果显示：claudin-10的表达水平在雨蛙素和pdl诱导的胰腺炎模型和kras
g12d
诱导的胰腺癌模型的损伤部位降低。图3中a图通过免疫组化检测了claudin-10的蛋白在正常、雨蛙素(caerulein)、胰腺导管结扎(pdl)和kras
g12d
小鼠(kc)模型中的表达变化。雨蛙素和pdl都是诱导胰腺炎的常用模型，kc小鼠的基因型是pdx1-cre；kras
g12d
。结果显示，在正常的小鼠胰腺中，claudin-10在腺泡细胞膜表达。在雨蛙素、pdl和kc小鼠中，claudin-10的表达水平在损伤部位丢失。
44.实施例4：claudin-10蛋白水平检测
45.蛋白提取：动物模型构建后，取出胰腺组织，在sds裂解液中低温研磨胰腺组织。高速离心10min去除碎片，吸取蛋白上清，利用bca试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性：将蛋白与5
×
sds-page蛋白上样缓冲液按照浓度混匀、于100℃中加热5min。电泳：样品加至12％聚丙烯酰胺凝胶上样孔中，设定恒压120v，电泳100min。转膜：设定恒流250ma，转膜100min，将凝胶上的蛋白转印至0.25μm的pvdf膜上。封闭：5％脱脂奶粉-tbst溶液，室温摇床封闭1h。孵育一抗：一抗于4℃中孵育过夜，回收一抗，用tbst洗膜4次，每次5min。二抗孵育：二抗(1/10000稀释)于室温中孵育一小时，回收一抗，用tbst洗膜4次，每次5min。显色：按照1：1将显色液的a液和b液混合，滴加到pvdf膜上，经显影仪显色后，得到蛋白条带。
46.图3中b图的结果显示：claudin-10的蛋白水平在pdl、雨蛙素和kc小鼠模型中的表达减少。
47.实施例5：claudin-10的mrna检测
48.提取正常、pdl、雨蛙素和kc小鼠胰腺的rna，剪取胰腺中的病变部位，加入1mltrizol，低温研磨组织，提取rna。使用反转录试剂盒将rna反转录成cdna，利用tb green premix ex taq试剂盒检测各组织中claudin-10的mrna量，根据cq值计算出claudin-10的mrna的表达量。
49.图3中c图的结果显示：与正常小鼠胰腺相比，claudin-10的mrna表达水平在pdl、雨蛙素和kc小鼠中降低。图3中b图和c图是利用wb和实时荧光定量pcr技术检测了claudin-10在三种模型(雨蛙素、pdl和kc)中的表达变化，野生型小鼠为对照。amylase是腺泡细胞的分子标记，ck-19和sox9是导管细胞的分子标记。胰腺损伤表现为腺泡细胞组织被导管样细胞所替代，所以amylase的表达降低，ck-19和sox9的表达升高是证明胰腺炎和胰腺癌模型成功的重要分子标记。结果显示，claudin-10的蛋白和rna在胰腺炎和胰腺癌模型中都降低了。
50.实施例六：tgf-α诱导266-6细胞模型的构建
51.266-6在含5％胎牛血清的dmem中培养，将266-6细胞经胰酶消化离心后接种于六孔板中，于37℃，含5％co2的培养箱中培养过夜。在50ng/ml的tgf-α诱导6h后，收取蛋白，并利用wb检测claudin-10、amylase、ck-19、sox-9的表达量。
52.图3中d图结果显示：与正常的266-6细胞相比，claudin-10的表达量在tgf-α诱导后明显减少。图3中d图表示的是claudin-10的蛋白水平在tgf-α诱导的266-6细胞中的表达变化。266-6是腺泡细胞系，在tgf-α诱导后会转变为导管样细胞。结果显示，与正常的266-6细胞相比，tgf-α诱导后，claudin-10的表达明显降低。amylase的表达降低，ck-19和sox9的表达升高证明模型构建成功。
53.实施例7：雨蛙素诱导claudin-10敲除鼠
54.pdx1-cre；claudin10-/+
和pdx1-cre；claudin10-/-小鼠在spf级屏障内饲养，在8周龄时注射雨蛙素诱导胰腺炎。48小时后，取出胰腺组织，10％福尔马林固定过夜。逐级酒精脱水，二甲苯透明，将组织浸于石蜡中，包埋成蜡块。将玻片60℃烤30分钟，常规脱蜡复水，苏木素染色2分钟，水洗10分钟。80％乙醇浸泡2分钟，伊红染色10秒，逐级脱水，透明后用中性树胶封片。免疫组化染色，检测amylase和ck-19的表达。
55.图4中a图、b图、c图的结果显示：与正常小鼠对比，claudin-10的敲除导致雨蛙素诱导后的炎症更加严重。
56.实施例八：天狼星红染色
57.60℃烤片30分钟，常规脱蜡水化。按照1：1配置铁苏木素染色液，滴加染色液于玻片上，染色5-10min。流水清洗5-10min，除去多余染色液。滴加天狼星红染色液染色15-30min，流水冲洗，去除表面染液。逐级脱水，二甲苯透明后，中性树胶封片。
58.图4中d图结果显示：claudin-10敲除后，胰腺纤维化程度增加，炎症加重。图4中a图通过he染色检测claudin-10的敲除在雨蛙素诱导胰腺炎后的病变程度。结果显示，在雨蛙素诱导后，与normal小鼠相比，pdx1-cre；claudin10-/+
和pdx1-cre；claudin10-/+
小鼠胰腺的病变面积明显增多。且与pdx1-cre；claudin10-/+
相比，pdx1-cre；claudin10-/+
小鼠的病变更多。
59.图4中b图、c图通过免疫组化检测amylase和ck-19在雨蛙素处理后的normal、
pdx1-cre；claudin10-/+
和pdx1-cre；claudin10-/+
小鼠胰腺中的表达，反映claudin-10的敲除对炎症的敏感程度。结果显示，与正常小鼠相比，amylase的表达在pdx1-cre；claudin10-/+
和pdx1-cre；claudin10-/+
小鼠胰腺中丢失的更多，与之相反，ck-19则明显表达增高。图4中d图天狼星红染色检测雨蛙素处理后的normal、pdx1-cre；claudin10-/+
和pdx1-cre；claudin10-/+
小鼠胰腺纤维化的变化。天狼星红是强酸性染料，易与胶原分子中的碱性基团结合，在普通光学显微镜下胶原纤维被染成红色。染色后，细胞核呈棕褐色或黑色，肌纤维呈黄色，基质呈红色。雨蛙素诱导炎症，引起胰腺纤维化，红色的纤维染色可反映纤维化程度。结果显示，与正常小鼠相比，pdx1-cre；claudin10-/+
和pdx1-cre；claudin10-/+
小鼠胰腺在雨蛙素诱导后纤维化更加严重，说明炎症加重。
60.实施例9：细胞生长实验
61.claudin-10的敲低采用瞬转体系，按照实验例六所述培养266-6细胞。将266-6胰酶消化离心后按照每孔5000个接种于96孔板中，培养过夜。使用lipo3000配置sirna混液，加入到96孔板中。转染后，在含1％fbs的细胞培养基中培养5天，每一天在固定的时间加入cck-8，在37℃，含5％ co2的培养箱中反应两小时后，使用酶标仪测定450nm波长下的吸光度，吸光度反映了细胞的相对生长情况。将266-6接种于六孔板中，转染sirna后，培养两天。收取蛋白，wb检测敲减效果。
62.pl-45和panc-1在含5％胎牛血清的dmem中培养，将pl-45和panc-1胰酶消化离心后接种于96孔板中，培养过夜。claudin-10的过表达采用瞬转体系，利用lipo3000配置pcdna3.1-claudin-10b载体的混液，加入到96孔板中。转染成功后，继续培养5天。每一天在固定时间添加cck-8，反应2小时后，利用酶标仪测定450nm波长下的吸光度，吸光度反应细胞的相对生长情况。将pl-45和panc-1接种于六孔板中，转染质粒后，培养两天。收取蛋白后，利用wb检测过表达效果。
63.图5的结果显示：claudin-10在266-6细胞中成功敲低，在pl-45和panc-1细胞中成功过表达。claudin-10的敲低抑制了266-6细胞的增殖，其过表达抑制了pl-45和panc-1的增殖。图5中a图、d图是在266-6细胞中敲低claudin-10，然后通过cck-8检测claudin-10敲低后细胞增殖情况的变化，结果显示claudin-10的敲低促进了腺泡细胞的增殖。在panc-1(b图、e图)和pl-45(c图、f图)细胞中利用pcdna3.1-claudin-10b过表达载体过表达claudin-10b,然后利用cck-8检测细胞增殖。结果显示，claudin-10过表达抑制了胰腺癌细胞的增殖。

技术特征：
1.紧密连接蛋白claudin-10抗体、引物、下调剂和过表达载体在胰腺癌早期病变的检测和发病机理研究中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述claudin-10包括claudin-10a和claudin-10b两个亚型。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，claudin-10的抗体为多克隆抗体，能识别人源和鼠源的claudin-10蛋白，应用于免疫组化、免疫荧光、wb和细胞免疫荧光。4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，claudin-10b特异性引物能够利用实时荧光定量pcr技术分析claudin-10b的mrna表达水平。5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，claudin-10特异性的下调剂在转染进细胞后能靶向claudin-10的mrna并降低claudin-10蛋白的表达。6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，人源claudin-10b的过表达载体能外源维持claudin-10b蛋白的表达。7.根据权利要求1所述的紧密连接蛋白claudin-10抗体、引物、下调剂和过表达载体在胰腺癌检测和治疗的应用，其特征在于，claudin-10在胰腺炎和胰腺癌的病变部位低表达。8.根据权利要求1所述紧密连接蛋白claudin-10抗体、引物、下调剂和过表达载体在胰腺癌检测和治疗的应用，其特征在于，claudin-10的丢失增加了个体对炎症的易感性，claudin-10的过表达抑制了恶性肿瘤细胞的增殖。9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，claudin-10的丢失增加了个体对炎症的易感性，claudin-10敲除小鼠在炎症诱导模型下表现出更强的损伤。10.根据权利要求6所述应用，其特征在于，claudin-10敲除小鼠在炎症诱导模型下表现出更强的损伤，claudin-10的丢失导致na
+
的细胞旁通路受阻，从而影响了胰液的正常分泌，导致消化酶的提早激活进而加重了炎症。

技术总结
本发明公开了一种胰腺炎和胰腺早癌诊断和治疗的新靶标Claudin-10。本发明中，紧密连接蛋白claudin-10抗体、引物、下调剂和过表达载体在胰腺癌早期病变的检测和发病机理研究中的应用。本发明的优点在于，针对胰腺癌早期无症状且缺乏检测靶点这一现状提供了claudin-10这一新靶标，其低表达促进了炎症和胰腺癌的发展，claudin-10抑制胰腺癌细胞增殖。claudin-10的抗体或引物能测定其表达水平并以此分析炎症和癌症进展阶段，以claudin-10为靶点设计药物可能起到抑制胰腺癌发展的作用。用。用。


技术研发人员：谢克平 李淑
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/9/14