一种毛尖蘑纯化多糖及其制备方法与应用

1.本发明属于真菌多糖应用技术领域，特别涉及一种毛尖蘑纯化多糖及其制备方法与应用。


背景技术：

2.毛尖蘑又名金子蘑、路基蘑，属于伞菌目(agaricales)离褶伞科(lyophyllaceae)离褶伞属(lyophyllum)烟色离褶伞(lyophyllum fumosum)种。主要产自我国大兴安岭东北部。
3.真菌多糖作为一种天然活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、免疫调节等多种活性，并且具有安全无毒的特性，在未来有广阔开发为功能性食品或保健产品的潜力。真菌多糖的提取方法会影响到真菌多糖的得率，也会对提取出的多糖结构和活性造成影响。提取得到的真菌粗多糖中往往含有蛋白质、色素等杂质，采取不同方法对其进行脱除以后才能得到纯化的多糖组分。多糖的结构也会对多糖的活性功能产生影响，在正确解析多糖结构的基础上可以更好的理解多糖的构效关系。
4.梁秀凤和胡海冰分别在《毛尖蘑林下栽培技术》(梁秀凤,李宏涛et al.2019)和《毛尖蘑室内栽培技术》(胡海冰,梁秀凤et al.2020)中报道了毛尖蘑人工种植方法，一定程度上提高了毛尖蘑的产率。罗文哲在《毛尖蘑粗多糖对h22荷瘤小鼠p53表达的影响》(罗文哲,吕冬霞et al.2016)和《毛尖蘑粗多糖对h22肝癌小鼠tnf-α和il-2表达的影响》(罗文哲,王建杰et al.2015)中报道了毛尖蘑多糖具有抗肿瘤的功效，其机制可能与调控细胞因子表达有关。
5.可见，现有研究未对毛尖蘑粗多糖进行纯化步骤，缺少对毛尖蘑纯化多糖的精细结构的研究，且未对毛尖蘑多糖进行过抗氧化、降血糖、免疫调节等活性评价。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于更合理利用毛尖蘑资源，提供一种毛尖蘑粗多糖纯化方法，并在多个纯化组分中选取得率最高，分子量更为集中的lfp-i进行结构与活性研究，提供该毛尖蘑多糖应用思路。
7.其具体方案为：
8.本发明提供一种毛尖蘑纯化多糖lfp-i，所述毛尖蘑纯化多糖lfp-i为岩藻糖fucp:甘露糖manp:葡萄糖glcp:半乳糖galp＝1.00:1.20:3.54:1.88组成的杂多糖，结构片段如下所示：
9.10.r1/r2代表此位置分别与r1、r2两种基团相连，其中r1为-α-d-glcp；r2为-α-manp-(3
→
1)-α-d-manp-(3
→
1)-α-l-fucp。
11.进一步地，所述的毛尖蘑纯化多糖lfp-i的重均分子量为8000-30000da。
12.更进一步地，所述的毛尖蘑纯化多糖lfp-i的重均分子量为13288da。
13.本发明还提供一种上述毛尖蘑纯化多糖lfp-i的制备方法，包括以下步骤：
14.(1)取毛尖蘑子实体并研磨成粉末，以热水浸提法提取得到多糖浸提液，多糖浸提液经脱色、脱蛋白、醇沉后得到毛尖蘑粗多糖lfps；
15.(2)步骤(1)所得lfps通过离子交换层析柱洗脱，收集洗脱液；
16.(3)洗脱液浓缩、透析、冻干得到毛尖蘑纯化多糖lfp-i；
17.步骤(2)中，离子交换层析柱以deae-52为填料；
18.步骤(2)中，洗脱液为浓度0-0.2mol/l的nacl溶液。
19.进一步地，步骤(1)中，热水浸提的温度为60-100℃，提取时间为100-140min；毛尖蘑子实体粉末与水的比例为1g:10-30ml；
20.步骤(1)中，脱色使用大孔树脂d354fd，将大孔树脂与多糖浸提液按照体积比1:1混匀，50
±
10℃下搅拌脱色3
±
1h；
21.步骤(1)中，脱蛋白使用sevage试剂，所述sevage试剂为正丁醇与三氯甲烷按照体积比为1:4混合的混合溶液。
22.更进一步地，步骤(1)中，热水浸提的温度为70℃，提取时间为120min；毛尖蘑子实体粉末与水的比例为1g:25ml；
23.步骤(1)中，sevage试剂与多糖浸提液的体积比为1:4。
24.进一步地，步骤(1)中，所述醇沉为将多糖浸提液与95％乙醇按照体积比1:4混合，收集沉淀物；
25.步骤(3)中，透析选用5000-8000da的透析袋。
26.本发明还提供上述的毛尖蘑纯化多糖lfp-i在制备抗氧化、调控血糖、增强免疫的食品和/或保健品中的应用。
27.多糖组分可以单独使用，也可与其他营养成分联合使用。
28.对以上多糖组分进行理化性质测定，得到lfps和lfp-i总糖含量分别为84.38％和80.16％，蛋白质含量分别为5.11％和0.55％，糖醛酸含量分别为1.95％和1.23％。
29.本发明相对于现有技术，所具有优点和功效如下：
30.本发明的发明人自毛尖蘑子实体分离纯化得到了毛尖蘑纯化多糖组分lfp-i，对其一级结构进行分析，确定了单糖组成及分子量，推断其糖苷键连接方式。通过体外抗氧化实验确定该组分具有强抗氧化能力，能够有效降低α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性从而调控血糖，又通过细胞形态学观察和细胞因子分泌量检测确定该组分对于巨噬细胞免疫反应有刺激激活的作用，可以将其用于保健食品和功能性食品开发。
附图说明
31.图1为毛尖蘑粗多糖洗脱曲线。
32.图2为lfp-i的紫外扫描谱图。
33.图3为gpc标准品谱图。
34.图4为lfp-i的gpc谱图。
35.图5为lfp-i的ft-ir谱图。
36.图6为gc标准品谱图。
37.图7为lfp-i的gc谱图。
38.图8为lfp-i的总离子流图。
39.图9为lfp-i的1h核磁谱图。
40.图10为lfp-i的13c核磁谱图。
41.图11为lfp-i的hsqc谱图。
42.图12为lfp-i的hmbc谱图。
43.图13为lfp-i的noesy谱图。
44.图14为lfp-i的sem扫描电镜图。
45.图15为不同浓度的lfp-i对raw264.7小鼠巨噬细胞作用下细胞形态图。
46.图16为未经lfp-i处理的raw264.7小鼠巨噬细胞形态图。
47.图17为不同浓度的lfp-i对tnf-α细胞因子的释放量影响。
48.图18为不同浓度的lfp-i对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
49.图19为不同浓度的lfp-i对α-淀粉酶的抑制率。
50.图20为不同浓度的lfp-i的frap值。
具体实施方式
51.下面结合实例和附图对本发明作进一步阐释，但本发明有更多实施方案。在实施例中未注明具体操作条件者，按照常规或厂商推荐方式进行。试剂和仪器未注明生产厂商者，均可通过市售或其他供应商渠道获得。
52.实施例1毛尖蘑多糖lfp-i提取纯化
53.1、称取干燥的毛尖蘑子实体100g，以粉碎机打碎成粉末，再过60目筛。按照1：20(g:ml)的体积比将子实体粉末与蒸馏水混合，70℃下水浴加热120min。将提取液中的渣滓滤除，上清液浓缩至200ml。上清液与提前浸泡的大孔树脂d354fd按照1:1体积比混合，50℃下水浴加热3h脱色。脱色后的粗提液滤除大孔树脂，使用sevage试剂离心脱除蛋白。脱除蛋白后的上清液浓缩再与四倍体积的95％乙醇混合，收集沉淀物并烘干得到毛尖蘑粗多糖lfps。
54.2、提前浸泡deae-52填料。将填料缓慢均匀导入层析柱中，辅以洗耳球轻敲柱子，使填料压实平整。打开恒流泵至最大流速，对填料进行脱气处理。脱气完成后将毛尖蘑粗多糖lfps复溶至8mg/ml，将多糖溶液铺在填料上方，调节流速使至5-6s/滴，依次以0、0.025、0.05、0.1、0.2mol/l的nacl溶液作为洗脱溶液，洗脱液分别收集测定总糖量，绘制洗脱曲线如图1所示。其中0.025mol/l的nacl溶液洗脱得到的组分含量低，难以富集，0、0.05、0.1、0.2mol/l的nacl溶液洗脱分别得到纯化组分lfp-i、lfp-ii、lfp-iii、lfp-iv，得率分别为15.29％，5.54％，11.45％，8.2％。将洗脱液使用蒸馏水透析，冻干得到纯化的lfp-i。
55.3、提前浸泡g-100葡聚糖凝胶。与deae-52填料相同方法装柱与上样。使用苯酚硫酸法对lfp-i进行检测，得到的糖含量曲线为单一对称峰形，说明lfp-i纯度较高。
56.实施例2毛尖蘑多糖lfp-i的理化性质鉴定
57.1、使用苯酚硫酸法测定总糖含量为84.25％。
58.2、使用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白质含量为0.55％。
59.3、使用硫酸咔唑法测定糖醛酸含量为1.23％。
60.4、在200-600nm范围内使用紫外全波段扫描仪对样品溶液进行扫描(如图2所示)。以波长为横坐标，od值为纵坐标，绘制得到全波段扫描曲线在260-280nm附近处有微小信号峰，说明可能含有少量核酸、多肽成分。
61.实施例3毛尖蘑多糖lfp-i的结构鉴定
62.1、测定分子量
63.用1ml的20mmol/l的磷酸二氢钾溶液溶解3mg毛尖蘑多糖lfp-i样品。仪器选用thermo ultimate 3000高效液相色谱，检测器为refractomax 521示差检测器，凝胶柱为ultrahydrogel 1000(7.8
×
300mm)和ultrahydrogel 500(7.8
×
300mm)串联，保护柱为ultrahydrogel(6
×
40mm)。流动相使用0.02mol/l的磷酸二氢钾缓冲溶液，进样量20μl，流速恒定在0.8ml/min，单个样品设置程序运行35min，柱温箱控温35℃。在此条件下进行hpgpc分析，并与标准品结果图3进行比对，lfp-i样品检测结果如图4所示，得到lfp-i重均分子量为13288da。
64.2、傅里叶红外光谱分析
65.称取2mg的lfp-i，分别与适量kbr粉末充分混匀后研磨，再通过压片方法使其均匀分布在样品台上，在4000-500cm-1
范围内进行红外扫描，得到结果如图5。分子在3445cm-1
处有-oh伸缩振动强而宽的吸收峰；在2928cm-1
处的吸收峰是h
–
c＝o基团和ch2中的c-h伸缩振动峰，1640cm-1
处的峰是多糖羰基c＝o的对称变形振动的吸收峰，以上特征吸收峰表明lfp-i为多糖类物质。
66.3、气相分析单糖组成
67.首先对lfp-i进行酸解和乙酰衍生化处理，再使用气相色谱法(gc)进行检测，对比单糖标准品(图6)的出峰情况分析lfp-i单糖组成情况(图7)。采用面积归一化法得出lfp-i主要单糖组成及其摩尔比值为岩藻糖fucp:甘露糖manp:葡萄糖glcp:半乳糖galp＝1.00:1.20:3.54:1.88。
68.4、甲基化gc-ms分析
69.将多糖的单个组分糖衍生化为部分甲基化的糖酰醇乙酸酯(pmaas)，再用气相色谱质谱联用(gc-ms)进行分析和定量。对比massbank数据库分析lfp-i总离子流图(图8)和离子碎片，得到lfp-i主要由t-fucp，t-glcp，t-manp，1,3-manp，1,6-galp，1,6-glcp，1,2,6-galp七种糖残基构成，摩尔百分数分别为15.24％，8.33％，4.62％，10.50％，8.77％，40.74％，11.78％。
70.5、核磁共振分析
71.称取60mg的lfp-i，使用1ml的d2o溶解，放入冷冻干燥机冻干，反复使用d2o溶解并冻干3次。反复冻融结束后将样品再次充分溶于1ml的d2o中，将上清液小心转移至5mm核磁管中，保证样品管内溶液高度大于3.5cm。测定多糖的1h、13c、hsqc、hmbc和noesy谱图。
72.1h谱图如图9，其中显示5个化学信号(δ5.33，δ4.99，δ4.91，δ4.70，δ4.46ppm)，
73.1c谱图如图10,，其中显示6个化学信号(δ102.93ppm，δ102.20ppm，δ101.48ppm，δ99.72ppm，δ98.03ppm和δ97.87ppm)。
74.在lfp-i的hsqc谱图(图11)中出现了六个信号交叉峰。位置分别为δ5.33/99.72，δ4.99/101.48，δ4.91/97.87，δ4.99/97.87，δ4.46/102.93以及δ1.16/15.66，它们分别归属于t-α-l-fucp，t-α-d-glcp，1,3-α-d-manp，1,6-β-d-glcp，1,2,6-α-d-galp，δ1.16/15.66处为岩藻糖h6/c6特征信号。由此得到化学位移如表1。
75.表1lfp-i的nmr化学位移
[0076][0077]
结合hmbc谱图(图12)和noesy谱图(图13)，在hmbc图中出现δ4.99/66.54信号，说明存在b
1-6
e连接或6e
1-6
e1重复结构。同理推断lfp-i中还存在δ4.99/78.00，δ4.46/66.54，δ3.78/102.93，δ3.55/97.87信号，说明存在b1/e
1-2
e，d
1-6
e，d
6-1
d，c
3-1
c等连接。在noesy谱图中出现δ5.33/3.55信号，说明残基a的h1与残基c的h3耦合，存在a
1-3
c连接方式。同理由noesy中存在推出lfp-i中还存在δ4.99/3.55，δ4.46/3.55，δ4.91/3.78，δ4.99/4.99，δ3.78/4.99信号，推断得出lfp-i中有b1/e
1-3
c，d
1-3
c，c
1-6
d，b1/e
1-1
e/1b，d
6-1
b/1e连接方式。最后推导出lfp-i的结构片段如下：
[0078][0079]
6、扫描电镜分析
[0080]
用镊子夹取少量lfp-i，小心粘贴到覆盖导电胶的样品台上。使用真空喷镀仪镀上导电层，之后在10kv的加速电压下，观察毛尖蘑多糖在不同放大200倍下的表面形态。得到的图像如图14所示。可看出lfp-i呈疏松多孔的网状结构，连接紧密，质地柔软。
[0081]
实施例4毛尖蘑多糖lfp-i的活性鉴定
[0082]
1、lfp-i的免疫活性鉴定
[0083]
将对数生长期的raw264.7细胞密度稀释至5
×
105个/ml，再将细胞液按照每孔100μl加入至96孔板，以完全培养基(dmem基础培养基+双抗)培养24h后弃掉原有培养基，加入不同浓度的lfp-i继续培养24h，以eclipse ti倒置显微镜观察raw264.7小鼠巨噬细胞的形态变化如图15所示，不添加lfp-i而更换新完全培养基培养24h的细胞形态如图16所示。由两组图片对比可以得到细胞在lfp-i刺激下生长出伪足，成为被激活状态，且随着浓度增大刺激作用增强。
[0084]
巨噬细胞活化时肿瘤坏死因子tnf-α的表达量也出现增加趋势。tnf-α的增多又可以反过来再诱导t细胞、b细胞等其他免疫细胞的增殖，最终完成免疫反应良性推动。按照华美生物的小鼠肿瘤坏死因子tnf-αelisa试剂盒说明书要求，完成加样、温育、洗涤、显色步骤。检测添加lfp-i后tnf-α的释放量，得到结果如图17所示。随着lfp-i浓度增大，细胞因子释放量增多，即巨噬细胞被活化。由此推断lfp-i能够刺激巨噬细胞从而增强免疫反应。
[0085]
2、lfp-i的降血糖活性鉴定
[0086]
向96孔板中每孔加入20μl的1u/ml的α-葡萄糖苷酶溶液、80μl的pbs冲液和10μl不同浓度的lfp-i溶液，37℃培养箱中反应30min，再加入50μl的pnpg溶液混合均匀，继续在37℃培养箱中反应60min。取出96孔板，加入100μl的1mol/l na2co3溶液终止水解反应，测定其a
405
。
[0087]
向96孔板中每孔加入100μl的5u/ml的α-淀粉酶溶液和50μl的不同浓度的lfp-i溶液，37℃培养箱中反应10min，再加入50μl的1％淀粉溶液混合均匀，继续37℃培养箱中反应10min，最后加入100μl的10mg/ml二硝基水杨酸溶液，测量a
540
。
[0088]
分别计算不同浓度的lfp-i对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用，其中背景组以等量pbs溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液和α-淀粉酶溶液，空白组以等量pbs代替样品，结果如图18和图19所示。由图看出随着lfp-i浓度增大，对两个酶的抑制作用均有增强，并且达到了70％以上的较高水平，说明lfp-i可以降低酶活，延缓淀粉消化，从而有效调控淀粉类食物餐后血糖水平。
[0089]
3、lfp-i的抗氧化活性鉴定
[0090]
抗氧化剂是通过还原作用给出电子从而清除自由基，还原力越强，则抗氧化性越强。利用fe
3+
可被抗氧化剂还原成fe
2+
，再与tptz形成蓝色三吡啶三嗪络合物的特性检测lfp-i的总抗氧化能力。向96孔板中吸取180μl的tptz工作液，再分别加入1-5mg/ml的lfp-i溶液20μl，充分混匀后室温避光反应10min，测定a
595
，再根据标准曲线计算各样品的frap值。结果如图20所示，随lfp-i的浓度增大，frap值增高，则抗氧化能力增强。
[0091]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种毛尖蘑纯化多糖lfp-i，其特征在于，所述毛尖蘑纯化多糖lfp-i为岩藻糖fucp:甘露糖manp:葡萄糖glcp:半乳糖galp＝1.00:1.20:3.54:1.88组成的杂多糖，结构片段如下所示：r1/r2代表此位置分别与r1、r2两种基团相连，其中r1为-α-d-glcp；r2为-α-manp-(3
→
1)-α-d-manp-(3
→
1)-α-l-fucp。2.根据权利要求1所述的毛尖蘑纯化多糖lfp-i，其特征在于：所述的毛尖蘑纯化多糖lfp-i的重均分子量为8000-30000da。3.根据权利要求2所述的毛尖蘑纯化多糖lfp-i，其特征在于：所述的毛尖蘑纯化多糖lfp-i的重均分子量为13288da。4.一种根据权利要求1-3任一项所述的毛尖蘑纯化多糖lfp-i的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取毛尖蘑子实体并研磨成粉末，以热水浸提法提取得到多糖浸提液，多糖浸提液经脱色、脱蛋白、醇沉后得到毛尖蘑粗多糖lfps；(2)步骤(1)所得lfps通过离子交换层析柱洗脱，收集洗脱液；(3)洗脱液浓缩、透析、冻干得到毛尖蘑纯化多糖lfp-i；步骤(2)中，离子交换层析柱以deae-52为填料；步骤(2)中，洗脱液为浓度0-0.2mol/l的nacl溶液。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，热水浸提的温度为60-100℃，提取时间为100-140min；毛尖蘑子实体粉末与水的比例为1g:10-30ml；步骤(1)中，脱色使用大孔树脂d354fd，将大孔树脂与多糖浸提液按照体积比1:1混匀，50
±
10℃下搅拌脱色3
±
1h；步骤(1)中，脱蛋白使用sevage试剂，所述sevage试剂为正丁醇与三氯甲烷按照体积比为1:4混合的混合溶液。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，热水浸提的温度为70℃，提取时间为120min；毛尖蘑子实体粉末与水的比例为1g:25ml；步骤(1)中，sevage试剂与多糖浸提液的体积比为1:4。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醇沉为将多糖浸提液与95％乙醇按照体积比1:4混合，收集沉淀物；步骤(3)中，透析选用5000-8000da的透析袋。8.权利要求1-3任一项所述的毛尖蘑纯化多糖lfp-i在制备抗氧化、调控血糖、增强免疫的食品和/或保健品中的应用。

技术总结
本发明属于真菌多糖领域，公开了一种毛尖蘑纯化多糖及其制备方法与应用。该毛尖蘑多糖中的单糖组成摩尔比为岩藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖＝1.00:1.20:3.54:1.88。该多糖从毛尖蘑子实体中由热水浸提得到粗多糖，再由粗多糖纯化制得。实验证明该纯化多糖具有抗氧化、增强免疫、调控血糖的功效，可用于保健食品与功能性食品开发，提高毛尖蘑的利用价值。提高毛尖蘑的利用价值。


技术研发人员：陈健 孙文临 张新飞 杨雨菁 马芸皓
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/9/14