一种间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法与流程

1.本发明涉及体外细胞培养技术领域，尤其涉及ipc c12n5，更具体地涉及，一种间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法。


背景技术：

2.宫腔粘连(iua)是引起育龄期女性继发性不孕的重要病因，其特征性病理改变为子宫内膜纤维化，研究表明上皮间质转化(emt)能够调控子宫内膜纤维化的形成。一些通路中的细胞因子会参与iua中的子宫内膜纤维化，且与emt相互作用，从而诱导子宫内膜上皮细胞形态转化，使细胞形态增长、变成梭形或纺锤形的间质细胞，并上调col1a2、ctgf、fibronectin等基因的表达，促进纤维化及细胞凋亡。
3.目前，体外探索间充质干细胞治疗宫腔粘连的作用机制的相关的方案比较匮乏，无高效准确快速的方案验证间充质干细胞的抑制效果。因此，需要开发一种高效、准确间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，对评价不同种类间充质干细胞的对子宫癌的抑制效果具有重要的意义。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中的问题，本发明第一方面提供了一种间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，包括以下步骤：
5.s1：rl95-2细胞接种培养：取rl95-2细胞悬液，离心，弃上清，加入rl培养基调整细胞浓度，接种1～3ml于6孔板中，置于co2培养箱中培养20～28h；所述rl95-2细胞为子宫内膜癌细胞；
6.s2：细胞因子刺激：rl95-2细胞培养20～28h后，观察细胞贴壁情况，吸弃各孔培养基，设置阴性对照组、共培养组和阳性对照组；阴性对照组加入1～3ml rl培养基，共培养组和阳性对照组加入1～3ml细胞因子工作液，置于co2培养箱中，继续培养24～72h；
7.s3：间充质干细胞培养：提前接种间充质干细胞msc，取msc悬液，离心，弃去上清，加入msc培养基调整细胞浓，取用装有transwell小室的6孔板，将0.5～2ml细胞悬液接种于小室中，接种量为：1.0～5.0
×
105个细胞/孔，下室加入2～3ml msc培养基，置于co2培养箱中培养24h；
8.s4：间充质干细胞与rl95-2细胞共培养：
9.(1)共培养组：将接种有间充质干细胞的transwell小室转移至接种有rl95-2细胞的6孔板内，将transwell小室和下室的培养基均更换为dmem/f-12培养基，小室0.5～1.5ml，下室1～3ml，至少平行3孔；
10.(2)阳性对照组：吸弃阳性对照组中各孔培养基，每孔加入1～3ml dmem/f-12培养基，至少平行3孔；
11.(3)阴性对照组：吸弃阴性对照组中各孔培养基，每孔加入1～3ml dmem/f-12培养基，至少平行3孔；
12.将准备好的共培养组、阳性对照组、阴性对照组，放入co2培养箱中培养24～72h；
13.s5：收集细胞：镜下观察s4中培养完成的细胞状态并拍照，加入重组酶消化细胞，分孔收集rl95-2细胞，离心，弃上清，将细胞沉淀放入-20℃冷冻待检。
14.优选的，所述s1、s3、s5中离心的离心力为200～600g，离心时间为3～8min；进一步优选的，离心力为400g，离心时间为5min。
15.优选的，所述rl培养基包括dmem/f-12培养基和5～15％胎牛血清；进一步优选的，包括dmem/f-12培养基和10％胎牛血清。
16.优选的，所述的细胞因子包括tgf-β1、lps、igf-1、pdgf、il-18；进一步优选的，为tgf-1β或lps。
17.本发明中，通过选用tgf-β1、lps等细胞因子刺激rl-95细胞，能使rl-95细胞的形态向梭形转变，说明tgf-β1、lps等细胞因子能成功诱导子宫内膜癌细胞的上皮间质转化(emt)进程。本发明人意外发现，特定的细胞因子才能诱导子宫内膜癌细胞的上皮间质转化(emt)进程，从而验证间充质干细胞的能够抑制子宫内膜癌细胞的纤维化。其它的细胞因子无法诱导子宫内膜癌细胞的纤维化，难以验证间充质干细胞对子宫内膜癌纤维化的抑制作用。
18.优选的，所述s2中阴性对照还加入了1～50ng/ml细胞因子工作液。
19.优选的，所述s3中msc培养基包括dmem培养基和5～15％胎牛血清。
20.优选的，所述s1中rl95-2细胞接种量为1.0～10.0
×
105个细胞/孔；进一步优选的，为1.0～5.0
×
105个细胞/孔。
21.优选的，所述s3中间充质干细胞的接种量为1.0～10.0
×
105个细胞/孔；进一步优选的，为1.0～5.0
×
105个细胞/孔。
22.本发明中，通过控制rl-95细胞接种量和间充质干细胞接种量，抑制rl-95细胞中col1a2、ctgf、fibronectin的翻译。本发明人推测，rl-95细胞接种量和间充质干细胞接种量，会影响共培养体系中的rl-95和间充质干细胞的接种密度，不同的接种密度影响着rl-95细胞和间充质干细胞的细胞状态，合适的接种密度提高了rl-95细胞和间充质干细胞的生长活力，使间充质干细胞能分泌较多的影响因子，通过旁分泌途径抑制rl-95细胞中col1a2、ctgf、fibronectin的mrna的表达。在未进行实验前，无法确定合适的接种密度。
23.优选的，所述co2培养箱中的培养的条件为37℃，5％ co2。
24.优选的，所述间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，还包括qpcr检测及分析：采用qpcr相对定量法(2-δδ
ct法)分析阴性对照组、共培养组和阳性对照组中纤维化相关基因col1a2、ctgf、fibronectin。
25.有益效果
26.1、本发明中，通过控制rl-95细胞接种量和间充质干细胞接种量，抑制rl-95细胞中col1a2、ctgf、fibronectin的翻译。
27.2、本发明中，通过选用tgf-β1、lps等细胞因子刺激rl-95细胞，能使rl-95细胞的形态向梭形转变，说明tgf-β1、lps等细胞因子能成功诱导子宫内膜癌细胞的上皮间质转化(emt)进程。
28.3、本发明中，通过控制tgf-β1、lps细胞因子的刺激时间，提高了rl-95细胞的转化率。时间过短，无法形成诱导rl-95细胞的上皮间质进程，时间过长，细胞活力降低，细胞死
亡，数量减少，无法进行后续qpcr测定。
29.4、本发明中，提供了一种合适的rl-95细胞与msc共培养时间，抑制了子宫内膜癌细胞纤维化，能够用于各种不同种类的间充质干细胞。
30.5、本发明的方案提供了一种间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，成功在体外构建了间充质干细胞与子宫内膜癌细胞的间接共培养体系，提供了新方法验证了间充质干细胞能够通过旁分泌途径抑制由tgf-β1、lps等细胞因子诱导的子宫内膜癌细胞的纤维化，此外，本发明中的方案能快速、准确、有效的检测出间充质干细胞的抑制效果，为间充质干细胞进一步治疗子宫内膜癌提供一定的实验支撑。
附图说明
31.图1为实施例1中阴性对照组中拍摄的rl95-2细胞形态图；
32.图2为实施例1中阳性对照组中拍摄的rl95-2细胞形态图；
33.图3为实施例2中阴性对照组中拍摄的rl95-2细胞形态图；
34.图4为实施例2中阳性对照组中拍摄的rl95-2细胞形态图；
35.图5为实施例3中阴性对照组中拍摄的rl95-2细胞形态图；
36.图6为实施例3中阳性对照组中拍摄的rl95-2细胞形态图；
37.图7为对比例3中共培养对照组中拍摄的rl95-2细胞形态图；
38.图8为对比例1中阳性对照组中拍摄的rl95-2细胞形态图；
39.图9为对比例5中阴性对照组中拍摄的rl95-2细胞形态图；
40.图10为实施例1中阴性对照组、阳性对照组、共培养组中col1a2、ctgf、fibronectin mrna表达水平图；
41.图11为实施例2中阴性对照组、阳性对照组、共培养组中col1a2、ctgf、fibronectin mrna表达水平图；
42.图12为实施例3中阴性对照组、阳性对照组、共培养组中col1a2、ctgf、fibronectin mrna表达水平图；
具体实施方式
43.实施例1
44.本实施例第一方面提供了一种间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，包括以下步骤：
45.s1：rl95-2细胞接种培养：取rl95-2细胞悬液，400g离心5min，弃上清，加入rl培养基(dmem/f-12培养基+10％胎牛血清)调整细胞浓度，接种2ml于6孔板中，接种量为：3.0
×
105个细胞/孔，置于co2培养箱中，于37℃，5％ co2条件下培养24h；
46.s2：tgf-β1刺激：rl95-2细胞培养24h后，观察细胞贴壁情况，吸弃各孔培养基，设置阴性对照组、共培养组和阳性对照组；阴性对照组加入2ml rl培养基(rl培养基中添加10ng/ml tgf-β1工作液)，共培养组和阳性对照组加入2ml tgf-β1工作液，置于co2培养箱中，继续培养48h；
47.s3：间充质干细胞培养：提前接种间充质干细胞msc，取msc悬液，400g离心5min，弃去上清，加入msc培养基调整细胞浓，取用装有transwell小室的6孔板，将1ml细胞悬液接种
于小室中，接种量为：3.0
×
105个细胞/孔，下室加入2.5ml msc培养基，置于co2培养箱中，于37℃，5％ co2条件下培养24h；
48.s4：间充质干细胞与rl95-2细胞共培养：
49.(1)共培养组：将接种有间充质干细胞的transwell小室转移至接种有rl95-2细胞的6孔板内，将transwell小室和下室的培养基均更换为dmem/f-12培养基，小室1ml，下室2ml，平行3孔；
50.(2)阳性对照组：吸弃阳性对照组中各孔培养基，每孔加入2ml dmem/f-12培养基，平行3孔；
51.(3)阴性对照组：吸弃阴性对照组中各孔培养基，每孔加入2ml dmem/f-12培养基，平行3孔；
52.将准备好的共培养组、阳性对照组、阴性对照组，放入co2培养箱中，于37℃，5％ co2条件下培养48h；
53.s5：收集细胞：镜下观察s4中培养完成的细胞状态并拍照，加入重组酶消化细胞，分孔收集rl95-2细胞，400g离心5min，弃上清，将细胞沉淀放入-20℃冷冻待检。
54.s6：qpcr检测及分析：采用qpcr相对定量法(2-δδ
ct法)分析阴性对照组、共培养组和阳性对照组中纤维化相关基因col1a2、ctgf、fibronectin；将阴性对照组rl95-2细胞中col1a2、ctgf、fibronectin mrna的表达水平设为1，利用2-δδ
ct法计算出阳性对照组rl95-2细胞中col1a2、ctgf、fibronectin mrna的表达水平和共培养组rl95-2细胞中col1a2、ctgf、fibronectin mrna的表达水平，结果见表1，图10。
55.所述dmem/f-12培养基为gibco的dmem/f-12培养基。
56.所述的胎牛血清为胎牛血清bi。
57.所述tgf-β1工作液为abcam的recombinant human tgf beta 1protein(active)。
58.所述msc培养基为hyclone的gibcodmem高糖培养基500ml。
59.所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，来源于华夏源。
60.所述重组酶购自gibco的tryple
tm
select酶(10x)，无酚红。
61.实施例2
62.实施例2的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述rl95-2细胞的接种量为1.0
×
105个细胞/孔；
63.所述间充质干细胞的接种量为1.0
×
105个细胞/孔；
64.所述s2中刺激培养的时间为24小时。
65.所述s4中培养的时间为24小时。
66.qpcr检测及分析：采用qpcr相对定量法(2-δδ
ct法)分析阴性对照组、共培养组和阳性对照组中纤维化相关基因col1a2、ctgf、fibronectin；利用2-δδ
ct法计算出阳性对照组rl95-2细胞中col1a2、ctgf、fibronectin mrna的表达水平和共培养组rl95-2细胞中col1a2、ctgf、fibronectin mrna的表达水平，结果见表1，图11。
67.实施例3
68.实施例3的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述rl95-2细胞的接种量为5.0
×
105个细胞/孔；
69.所述间充质干细胞的接种量为5.0
×
105个细胞/孔；
70.所述的细胞因子为lps。
71.所述的lps为sigma的l4391脂多糖来源于大肠杆菌0111:b4。
72.所述s2中刺激培养的时间为72小时。
73.所述s4中培养的时间为72小时。
74.qpcr检测及分析：采用qpcr相对定量法(2-δδ
ct法)分析阴性对照组、共培养组和阳性对照组中纤维化相关基因col1a2、ctgf、fibronectin；利用2-δδ
ct法计算出阳性对照组rl95-2细胞中col1a2、ctgf、fibronectin mrna的表达水平和共培养组rl95-2细胞中col1a2、ctgf、fibronectin mrna的表达水平，结果见表1，图12。
75.对比例1
76.对比例1中具体实施方式同实施例1一样，不同之处在于，所述的细胞因子为mmp-9。其阳性对照组中rl95-2细胞形态结果见图8。
77.对比例2
78.对比例2中具体实施方式同实施例1一样，不同之处在于，所述rl95-2细胞的接种量为1.0
×
104个细胞/孔；
79.所述间充质干细胞的接种量为1.0
×
104个细胞/孔；
80.qpcr检测及分析：qpcr检测出阴性对照组、阳性对照组和共培养对照组的结果相似，推测可能原因为细胞量太少，进行qpcr检测误差太大。
81.对比例3
82.对比例3中具体实施方式同实施例1一样，不同之处在于，所述rl95-2细胞的接种量为1.0
×
106细胞/孔；
83.所述间充质干细胞的接种量为1.0
×
106个细胞/孔；
84.培养结果及分析：细胞大量死亡；原因可能为培养基营养不够。其共培养对照组结果见图7。
85.对比例4
86.对比例4中具体实施方式同实施例1一样，不同之处在于，所述s4中培养的时间为18小时。
87.qpcr检测及分析：qpcr检测出阴性对照组、阳性对照组和共培养对照组的结果相似，推测可能原因为阳性对照组未刺激成功。
88.对比例5
89.对比例5中具体实施方式同实施例1一样，不同之处在于，所述s4中培养的时间为96小时。
90.培养结果及分析：阴性对照组、阳性对照组、共培养对照组中大量细胞死亡，可能为培养体系营养不够。其阴性对照组中的rl95-2细胞结果见图9。
91.性能测试
92.在s5步骤中观察实施例1～3，对比例1中的阴性对照组和阳性对照组中的细胞形态，结果见图1～8。图1～6说明实施例1～3中，显微镜下观察各组rl95-2细胞形态，呈现如下相同特征：阴性对照组贴壁细胞形态多为不规则多角形，类似上皮细胞；阳性对照组形态多为梭形，类似间质细胞，说明实施例1～3中的tgf-β1、lps均成功诱导子宫内膜癌细胞的上皮间质转化(emt)进程。
93.对比例1中rl95-2细胞形态：阴性对照组和阳性对照组中rl95-2细胞形态多为不规则多角形，类似上皮细胞。其阳性对照组中rl95-2细胞形态结果见图8。
94.表1
95.
技术特征：
1.一种间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：rl95-2细胞接种培养：取rl95-2细胞悬液，离心，弃上清，加入rl培养基调整细胞浓度，接种1～3ml于6孔板中，置于co2培养箱中培养20～28h；所述rl95-2细胞为子宫内膜癌细胞；s2：细胞因子刺激：rl95-2细胞培养20～28h后，观察细胞贴壁情况，吸弃各孔培养基，设置阴性对照组、共培养组和阳性对照组；阴性对照组加入1～3ml rl培养基，共培养组和阳性对照组加入1～3ml细胞因子工作液，置于co2培养箱中，继续培养24～72h；s3：间充质干细胞培养：提前接种间充质干细胞msc，取msc悬液，离心，弃去上清，加入msc培养基调整细胞浓，取用装有transwell小室的6孔板，将0.5～2ml细胞悬液接种于小室中，接种量为：1.0～5.0
×
105个细胞/孔，下室加入2～3ml msc培养基，置于co2培养箱中培养24h；s4：间充质干细胞与rl95-2细胞共培养：(1)共培养组：将接种有间充质干细胞的transwell小室转移至接种有rl95-2细胞的6孔板内，将transwell小室和下室的培养基均更换为dmem/f-12培养基，小室0.5～1.5ml，下室1～3ml，至少平行3孔；(2)阳性对照组：吸弃阳性对照组中各孔培养基，每孔加入1～3ml dmem/f-12培养基，至少平行3孔；(3)阴性对照组：吸弃阴性对照组中各孔培养基，每孔加入1～3ml dmem/f-12培养基，至少平行3孔；将准备好的共培养组、阳性对照组、阴性对照组，放入co2培养箱中培养24～72h；s5：收集细胞：镜下观察s4中培养完成的细胞状态并拍照，加入重组酶消化细胞，分孔收集rl95-2细胞，离心，弃上清，将细胞沉淀放入-20℃冷冻待检。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，其特征在于，所述s1、s3、s5中离心的离心力为200～600g，离心时间为3～8min。3.根据权利要求1所述的间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，其特征在于，所述rl培养基包括dmem/f-12培养基和5～15％胎牛血清。4.根据权利要求1所述的间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，其特征在于，所述的细胞因子包括tgf-β1、lps、igf-1、pdgf、il-18。5.根据权利要求1所述的间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，其特征在于，所述s2中阴性对照还加入了1～50ng/ml细胞因子工作液。6.根据权利要求1所述的间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，其特征在于，所述s3中msc培养基包括dmem培养基和5～15％胎牛血清。7.根据权利要求1所述的间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，其特征在于，所述s1中rl95-2细胞接种量为1.0～10.0
×
105个细胞/孔。8.根据权利要求1所述的间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，其特征在于，所述s3中间充质干细胞的接种量为1.0～10.0
×
105个细胞/孔。9.根据权利要求1所述的间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，其特征在于，所述co2培养箱中的培养的条件为37℃，5％co2。
10.根据权利要求1所述的间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法，其特征在于，还包括qpcr检测及分析：采用qpcr相对定量法2-δδ
ct法分析阴性对照组、共培养组和阳性对照组中纤维化相关基因col1a2、ctgf、fibronectin。

技术总结
本发明涉及体外细胞培养技术领域，尤其涉及IPC C12N5，更具体地涉及，一种间充质干细胞与子宫内膜癌细胞在体外共培养方法。本发明中通过RL95-2细胞接种培养、细胞因子刺激、间充质干细胞培养、间充质干细胞与RL95-2细胞共培养、收集细胞、qPCR检测及分析，在体外构建间充质干细胞与子宫内膜癌细胞的间接共培养体系，成功验证了间充质干细胞可以通过旁分泌途径对细胞因子诱导的子宫内膜癌细胞纤维化产生抑制作用。抑制作用。抑制作用。


技术研发人员：朱灏 卢意 刘克 潘春荣
受保护的技术使用者：华夏源（上海）生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/9/14