一种双特异抗体及应用

1.本发明涉及基因工程抗体技术领域，更具体地说，它涉及一种双特异抗体及应用。


背景技术：

2.自身免疫性疾病如类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)、crohn’s病、牛皮癣型关节炎(psoriatic arthritis，psa)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，as)、新生儿多系统炎症疾病(neonatal onset multisystem inflammatory disease,nomid)等的防治是当前医学面临的重大挑战。抗细胞因子如tnf-α、il-1β、il-6及il-17的单克隆抗体仍然是治疗自身免疫性疾病最为有效的药物。参与自身免疫病理损伤的免疫效应分子主要来源于两个方面，一个是由t细胞和巨噬细胞为反应中心的炎性细胞因子如tnf-α、il-1β、il-6及il-17等，另一个是来源于b细胞免疫(体液免疫)产生的自身抗体，体液免疫的炎症效应则是通过自身抗体激活补体通路实现。目前上市或处于临床试验的抗细胞因子单克隆抗体主要针对tnf-α、il-1β、il-6及il-17。这种单靶点阻断t细胞和巨噬细胞来源细胞因子通路的治疗方式对自身免疫性疾病虽然具有较好的缓解作用，但仍有大约50％的自身免疫病患者对此不够敏感或无反应。究其原因，是因为目前的抗细胞因子治疗忽略了b细胞免疫的下游炎症因子的病理损伤作用。我们认为，只有同时阻断t细胞(巨噬细胞)和b细胞免疫的下游效应分子的信号通路才能达到对自身免疫性疾病更为彻底的治疗。
3.粒细胞单核细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，gm-csf)是一个造血生长因子，参与调节髓系细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞及树突状细胞的分化及增殖。巨噬细胞是多种自身免疫性炎症的中心效应细胞，而gm-csf则是巨噬细胞炎症效应的中心细胞因子。gm-csf刺激滑膜巨噬细胞极化成为m1型，还可诱导t细胞分化为th17，激活巨噬细胞和th17分泌细胞因子tnf-α、il-1β、il-6及il-17等。由于gm-csf能同时调节th1和th17细胞因子，其作为靶点在ra的治疗上比tnf-α、il-1β、il-6、il-17更有优势。抗gm-csf单抗mavrilimumab用于ra治疗已进入临床iib，显示出确切的疗效和安全性。因而，gm-csf是ra非常具有吸引力的一个治疗靶点。
4.补体蛋白c5a是在补体经典激活途径和替代激活途径中由c5转化酶或丝氨酸蛋白酶切割而形成的一个炎症效应分子。在自身免疫炎症中，c5a由自身抗体与抗原结合成的免疫复合物(ics)激活补体通路产生。c5a是一个重要的炎性因子，还是中性粒细胞、单核/巨噬细胞的重要趋化因子，可激活并诱导中性粒细胞或单核/巨噬细胞分泌多种炎性细胞因子如tnf-α、il-1β及il-6和基质金属蛋白酶(mmps)，参与炎症过程和组织损伤，还可吸引(诱导)中性粒细胞、单核/巨噬细胞跨血管内皮进入炎症组织。由于c5a由自身抗体-抗原免疫复合物(ics)激活补体通路形成，是一个来源于b细胞免疫(体液免疫)的炎症效应分子，其产生及作用不受t细胞或巨噬细胞炎症因子的调节，因而阻断c5a信号通路能有效抑制b细胞免疫导致的炎症效应和组织损伤，克服当前单纯阻断t细胞或巨噬细胞炎性因子信号通路在自身免疫炎症治疗上的不足，可能会产生更好的治疗指标。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种双特异抗体及应用，一种同时靶向gm-csf和c5a的双特异抗体gmc5，为了克服目前单靶点抗细胞因子治疗自身免疫性疾病的不足，同时解决小分子抗体血浆半衰期较短的问题。
6.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种双特异抗体，包括所述双特异抗体为gmc5，所述gmc5由抗gm-csf抗体、抗c5a抗体、及20t小肽依次串联连接而成。
7.本发明进一步设置为：所述抗gm-csf抗体可变区为vh1和vl1，所述抗c5a抗体可变区为vh2和vl2；所述gmc5的串联连接顺序为vh1-vl1-vh2-vl2-20t，所述vh1与vl1之间、vh2与vl2之间均用(ggggs)3作为连接肽进行连接；vl1与vh2之间用人血清白蛋白(hsa)的一个小肽(hsa linker)作为连接肽进行连接；vl2与20t之间用ggggs作为连接肽进行连接；所述20t小肽为20个氨基酸小肽，其能与新生儿受体(fcrn)相互作用，抗体c末端添加有组氨酸标签。
8.本发明进一步设置为：所述抗gm-csf抗体为抗gm-csf的单链抗体片段、fab片段或单域抗体片段中的一种；所述抗c5a抗体为抗c5a的单链抗体片段、fab片段或单域抗体片段中的一种。
9.本发明进一步设置为：所述gm-csf抗体可变区vh1的氨基酸序列为：
10.qlqesgpgvvkpsetlsltcsvsdsairkyywswirqppgqgleyigyiyasgss fynpsfksrvsmsvdatnnqfylkltsvtaadtavyycaaitgttdlwgrgtlvtvs；
11.所述抗gm-csf抗体可变区vl1的氨基酸序列为：
12.iqmtqspssvsasvgdrvtitcrasqginrrlawyqqkpgkapkrliyavstlqs gvpsrfngsgsgtdftltvnnvqpddlamyfclqsnnypltfgggtkvei；
13.所述抗c5a抗体可变区vh2的氨基酸序列为：
14.evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsg gstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardddyeewpwyygmdvw gqgtmvtvs；
15.所述抗c5a抗体可变区vl2的氨基酸序列为：
16.qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdiggskyvswyqqhpgkapkliifdvnr rpsglsnrfsasksgntasltisglqaedeadyyctsyhptktilfgggtkltvla；
17.所述20t小肽的氨基酸序列为：
18.hgnyflsghfgglypvqgsv；
19.所述小肽(hsa linker)的氨基酸序列为：
20.alevdetyvpkefnaetftfhadi。
21.本发明进一步设置为：所述gmc5的氨基酸序列为seq id no:1；编码所述双特异抗体gmc5的基因，其dna序列为seq id no:2。
22.本发明还提供了上述双特异抗体的应用，所述双特异抗体用于制备治疗或预防自身免疫性疾病的药物。
23.本发明还提供一种双特异抗体的构建、表达、纯化方法，其方法为：所述gmc5按毕赤酵母的偏爱密码子合成gmc5编码基因，并在3
′
端添加组氨酸标签，连接入表达载体phb905m，形成gmc5的表达载体phb905m/gmc5，线性化phb905m/gmc5，转化毕赤酵母gs115
(his4)宿主细胞，筛选阳性重组子；阳性重组子经扩大培养，用甲醇诱导gmc5的表达，表达产物经饱和硫酸铵沉淀，固定化金属离子亲和层析分离，可得到纯化后的双特异抗体gmc5。
24.综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明的gmc5可同时阻断t细胞免疫的炎性细胞因子通路和b细胞免疫的炎性因子通路，与目前的抗细胞因子抗体仅仅阻断t细胞或巨噬细胞的下游炎症效应分子通路相比，对自身免疫性疾病的治疗将更为科学，具有更好的应用潜力。同时，引入的与fcrn相互作用的20t小肽具有与igg fc区相似的功能，能与fcrn以ph依赖的方式相互作用，使得gmc5具有较长的血浆半衰期，能有效的克服目前小分子抗体血浆半衰期较短的不足。
附图说明
25.图1为本发明的实施例的phb905m/gmc5质粒图谱及gmc5的结构；
26.图2为本发明的实施例的gmc5的表达、鉴定、纯化制备结果图；
27.图3为本发明的实施例的gmc5的抗原结合活性图；
28.图4为本发明的实施例的gmc5对gm-csf和c5a的中和作用图；
29.图5为本发明的实施例的双靶点阻断gm-csf和c5a作为治疗自身免疫性疾病的科学性的实验论证结果图；图6为本发明的实施例双靶点阻断gm-csf和c5a作为治疗自身免疫性疾病的论证效果图。
具体实施方式
30.以下结合附图1-6对本发明作进一步详细说明。
31.实施例：一种双特异抗体及应用，如图1-图6所示，双特异抗体为gmc5，所述gmc5由抗gm-csf抗体、抗c5a抗体、20t小肽依次串联连接而成；所述20t小肽是一个能与人新生儿受体(fcrn)结合的20个氨基酸的小肽。本实施例所用的抗gm-csf单链抗体和抗c5a单链抗体并不限于本实施例所述的这两种，也可以是其他单链抗体。
32.本实施例用不同长度的柔性连接肽的编码基因将抗gm-csf抗体可变区(vh1、vl1)、抗c5a抗体可变区(vh2、vl2)及20t小肽进行依次串联，所述gmc5的串联连接顺序为vh1-vl1-vh2-vl2-20t，其中vh1与vl1之间、vh2与vl2之间均用(ggggs)3作为连接肽进行连接，vl1与vh2之间用hsa linker作为连接肽进行连接，vl2与20t之间用ggggs作为连接肽进行连接。
33.本实施例所述的抗gm-csf抗体为抗gm-csf的单链抗体片段、fab片段或单域抗体片段中的任意一种，所述的抗c5a抗体为抗c5a的单链抗体片段、fab片段或单域抗体片段中的任意一种。
34.本实施例抗gm-csf抗体可变区vh1的氨基酸序列为：
35.qlqesgpgvvkpsetlsltcsvsdsairkyywswirqppgqgleyigyiyasgss fynpsfksrvsmsvdatnnqfylkltsvtaadtavyycaaitgttdlwgrgtlvtvs
36.本实施例抗gm-csf抗体可变区vl1的氨基酸序列为：
37.iqmtqspssvsasvgdrvtitcrasqginrrlawyqqkpgkapkrliyavstlqs gvpsrfngsgsgtdftltvnnvqpddlamyfclqsnnypltfgggtkvei
38.本实施例抗c5a抗体可变区vh2的氨基酸序列为：
39.evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardddyeewpwyygmdvwgqgtmvtvs
40.本实施例抗c5a抗体可变区vl2的氨基酸序列为：
41.qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdiggskyvswyqqhpgkapkliifdvnr rpsglsnrfsasksgntasltisglqaedeadyyctsyhptktilfgggtkltvla
42.本实施例20t小肽的氨基酸序列为：hgnyflsghfgglypvqgsv。
43.本实施例hsa linker的氨基酸序列为：
44.alevdetyvpkefnaetftfhadi
45.本实施例用上述氨基酸序列连接而成的gmc5的氨基酸序列seq id no:1：
46.qlqesgpgvvkpsetlsltcsvsdsairkyywswirqppgqgleyigyiyasgssfynpsfksrvsmsvdatnnqfylkltsvtaadtavyycaaitgttdlwgrgtlvtvsggggsggggsggggsiqmtqspssvsasvgdrvtitcrasqginrrlawyqqkpgkapkrliyavstlqsgvpsrfngsgsgtdftltvnnvqpddlamyfclqsnnypltfgggtkveialevdetyvpkefnaetftfhadievqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardddyeewpwyygmdvwgqgtmvtvsggggsggggsggggsqsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdiggskyvswyqqhpgkapkliifdvnrrpsglsnrfsasksgntasltisglqaedeadyyctsyhptktilfgggtkltvlaggggshgnyflsghfgglypvq gsvhhhhhh
47.本实施例设计了编码上述gmc5的基因，并采用全基因合成的方式合成了此编码基因，所述基因的dna序列为seq id no:2，可用于编码上述gmc5的基因并不限于本实施例公开的基因。
48.seq id no:2：
49.caattgcaagaatctggtccaggtgttgttaaaccatctgaaactttgtctttgacttgttctgtttctgattctgctattagaaaatattattggtcttggattagacaaccaccaggtcaaggtttggaatatattggttatatttatgcttctggttcttctttttataatccatcttttaaatctagagtttctatgtctgttgatgctactaataatcaattttatttgaaattgacttctgttactgctgctgatactgctgtttattattgtgctgctattactggtactactgatttgtggggtagaggtactttggttactgtttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctattcaaatgactcaatctccatcttctgtttctgcttctgttggtgatagagttactattacttgtagagcttctcaaggtattaatagaagattggcttggtatcaacaaaaaccaggtaaagctccaaaaagattgatttatgctgtttctactttgcaatctggtgttccatctagatttaatggttctggttctggtactgattttactttgactgttaataatgttcaaccagatgatttggctatgtatttttgtttgcaatctaataattatccattgacttttggtggtggtactaaagttgaaattgctttggaagttgatgaaacttatgttccaaaagaatttaatgctgaaacttttacttttcatgctgatattgaagttcaattgttggaatctggtggtggtttggttcaaccaggtggttctttgagattgtcttgtgctgcttctggttttactttttcttcttatgctatgtcttgggttagacaagctccaggtaaaggtttggaatgggtttctgctatttctggttctggtggttctacttattatgctgattctgttaaaggtagatttactatttctagagataattctaaaaat actttgtatttgcaaatgaattctttgagagctgaagatactgctgtttattattgtgctagagatgatgattatgaagaatggccatggtattatggtatggatgtttggggtcaaggtactatggttactgtttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctcaatctgctttgactcaaccagcttctgtttctggttctccaggtcaatctattactatttcttgtactggtacttcttctgatattggtggttctaaatatgt
ttcttggtatcaacaacatccaggtaaagctccaaaattgattatttttgatgttaatagaagaccatctggtttgtctaatagattttctgcttctaaatctggtaatactgcttctttgactatttctggtttgcaagctgaagatgaagctgattattattgtacttcttatcatccaactaaaactattttgtttggtggtggtactaaattgactgttttggctggtggtggtggttctcatggtaattattttttgtctggtcattttggtggtttgtatccagttcaaggttctgttcatcatcatcatcatcat
50.本实施例将上述编码基因克隆进毕赤酵母表达载体phb905m，构建成为gmc5的表达载体phb905m/gmc5，phb905m/gmc5质粒图谱见附图1，vh1与vl1缔合，vh2与vl2缔合，形成了分别结合gm-csf和c5a两个功能区，两个功能区借助hsa linker的连接，形成单链双特异抗体，同时靶向人gm-csf和c5a。
51.hsa linker具有足够的长度和柔性，便于该抗体灵活伸展与各自的抗原相互作用。20t小肽能与人fcrn相互作用，赋予gmc5与完整抗体(含fc)相似的血浆半衰期。最后折叠成如图1所示的单链双特异抗体。
52.接着，用线性化的表达载体phb905m/gmc5转化毕赤酵母细胞gs115(his4)，将含有表达载体的gs115(his4)细胞克隆接种25ml bmgy培养基(100mmol/l磷酸二氢钾，ph6.0，1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，4
×
10-5
％(w/v)生物素，1％(w/v)甘油)，30℃摇动培养至a
600
为6-8，3000g离心10min收集细胞，重悬于250ml bmmy培养基(100mmol/l磷酸二氢钾，ph6.0，1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，4
×
10-5
％(w/v)生物素，0.5％(w/v)甲醇)中，30℃继续摇动培养120h，每隔24h加入终浓度为0.5％的甲醇，保持对gmc5的连续诱导表达。10000g离心10min，收集上清，行sds-page(12％)分析。电转凝胶上的蛋白质至硝酸纤维膜(0.45μm，pall gelman)，5％的脱脂牛奶4℃封闭过夜，1
×
pbs洗膜3次，每次3min。将膜浸泡于含anti-his-tag hrp-igg(1:1000)的1
×
pbs中，37℃孵育2h，1
×
pbs洗膜3次，每次3min。加入dab显色剂，待显色至理想的程度，自来水冲洗终止反应。
53.见附图2，gmc5在毕赤酵母中获得了高效分泌表达，分子量大约为56kda，与理论大小一致，表达产物存在于酵母细胞培养基中，表达量与诱导时间正相关，最大表达量在120h，占整个培养上清蛋白的30％左右(图2a)；目的蛋白经转膜，进一步用hrp标记抗his-tag单抗进行western-blot鉴定，结果表明56kda蛋白条带为目的蛋白gmc5(图2b)。
54.用固定化的ni
2+
亲和层析对表达上清中gmc5进行了分离纯化，具体见下文：
55.向1000ml上述表达上清中加入等体积的100％饱和硫酸铵，置于4℃缓慢摇动过夜，确保蛋白充分沉淀。12000g离心30min收集沉淀，沉淀重悬于100ml透析缓冲液(20mmol/l tris-hcl(ph8.0)，150mmol/l nacl)中，装入透析袋，置于1000ml透析缓冲液中，4℃搅拌透析24h，每8h更换一次透析缓冲液，充分去除蛋白质中的硫酸铵及其他离子。随后，蛋白质通过固定化的ni
2+
亲和层析进行纯化。简要地，透析后的蛋白质上样于经10倍体积透析缓冲液平衡的ni
2+
亲和层析柱(ni-nta)，流速0.5ml/min。样品流穿后，用缓冲液(20mmol/l tris-hcl(ph8.0)，500mmol/l nacl，20mmol/l咪唑)洗涤至基线，流速为1ml/min，充分去除非结合的蛋白质。最后，蛋白质用缓冲液(20mmol/l tris-hcl(ph8.0)，150mmol/l nacl，500mmol/l咪唑)洗脱，流速为1ml/min。收集蛋白质峰，行sds-page检测，并用100倍体积的1
×
pbs缓冲液透析24h，每8h更换一次缓冲液，充分去除蛋白质中的咪唑及其他无机离子。透析后的蛋白质经12000g离心20min，0.22μm滤膜过滤以去除少量的蛋白沉淀物和潜在的微生物，bradford定量，冷冻干燥备用。
56.见附图2，gmc5经固定化的ni
2+
亲和层析(imac)纯化，可以达到95％以上的纯度(图2c)。用上述常规制备方法可从1l的表达上清中制备40-50mg的gmc5。
57.检测了gmc5的抗原结合活性，具体操作步骤见下文：
58.100ng/孔gm-csf及100ng/孔c5a分别包被于96孔elisa板，每孔于100μl 0.1m的碳酸盐缓冲液(ph9.6)中，4℃过夜；pbst洗板2次，用100μl含5％(w/v)的脱脂牛奶的1
×
pbs(ph7.4)缓冲液于37℃封闭2h。pbst洗板3次，于每孔中加入100μl不同浓度的gmc5或对照抗体，每个抗体浓度做3复孔，置elisa板于37℃温箱中孵育1.5h。pbst洗板3次，于每孔中加入100μl hrp-抗his-tag单抗(1：1000稀释)，置elisa板于37℃温箱中孵育1h。pbst洗板3次，于每孔中加入100μl显色液(1mm opd，0.016％v/v h2o2)，37℃避光孵育10min，酶标仪读取每孔490nm处的吸收值。亲本抗体抗gm-csf单链抗体g-scfv、抗c5a单链抗体c-scfv作为阳性对照，抗cd3单链抗体cd3-scfv作阴性对照。
59.见附图3，与其亲本抗体g-scfv和c-scfv一样，gmc5可特异性的结合gm-csf(图3a)及c5a(图3b)，而对照抗体cd3-scfv没有结合作用(图3a、b)。
60.接着，进行了gmc5对gm-csf中和作用的测试。gm-csf通过与其细胞表面受体gm-csfr相互作用，刺激人白血病细胞tf-1增殖，中和性的抗体能够阻断gm-csf与gm-csfr的相互作用，对tf-1的增殖起抑制作用。于是分析了不同剂量的gmc5对gm-csf的促增殖的抑制作用，来判断gmc5对gm-csf是否具有中和作用。具体见下文：edta消化收集培养的人白血病细胞tf-1，用rpmi-1640(10％fbs)培养基调整细胞浓度为2.5
×
105个/ml，100μl/孔加入96孔细胞培养板中，37℃、5％co2培养过夜。另取一块96孔培养板，于第3孔到第12孔加入100μl rpmi-1640(2％fbs)培养基倍比稀释的gmc5。同样的方法处理g-scfv及cd3-scfv，每种抗体浓度梯度做3复孔，剩余的孔1和孔2加入100μl的培养基；于第2孔到12孔加入100μl rpmi-1640(2％fbs)培养基稀释的gm-csf，至终浓度为1nmol/l，剩余的孔1加入100μl的培养基，置37℃温箱中孵育2h。弃掉第一块培养板中的培养液，将第二块培养板的孵育物转移100μl至第一块培养板的相应孔中，与每孔中补加放线菌素d至终浓度为1μg/ml，37℃、5％co2培养24h。于每孔中加入10μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，37℃、5％co2培养3h，弃掉培养基，pbs洗板3次，每次2min，于每孔中加入50μl dmso，摇动培养板，使细胞内结晶全部溶解，酶标仪阅读每孔的570nm的吸收值(a
570
)，如下公式计算每种抗体对gm-csf促增殖的抑制率(％)：抑制率(％)＝[(a
570,g-a
570,m
)/(a
570,g-a
570,n
)]
×
100％，其中a
570,m
为加入gm-csf和抗体的3复孔平均吸收值；a
570,g
为只加gm-csf的3复孔平均吸收值；a
570,n
为既不加gm-csf又不加抗体的3复孔的平均吸收值。
[0061]
见附图4a，gmc5与其亲本抗体g-scfv一样，能够有效抑制gm-csf对tf-1促增殖作用，抑制率与gmc5及g-scfv的剂量正相关，抑制1ng/ml的gm-csf的促增殖作用，gmc5抗体50％的抑制浓度(ic
50
)为4nmol/l，100％的抑制浓度(ic
100
)为64nmol/l。
[0062]
接着，还进行了gmc5对c5a中和作用的测试。c5a是补体通路下游分子中的一个重要的炎症因子，同时也是一个重要的中性粒细胞和单核细胞的趋化因子。c5a通过与其受体c5ar的相互作用，诱导中性粒细胞、单核细胞变性、拉伸，从而透过血管内皮迁移到炎症组织，中和性抗体能够阻断c5a与c5ar的相互作用，抑制细胞的跨血管内皮迁移。于是以人中性粒细胞为模型，用transwell方法(模拟体内细胞透过血管内皮)分析了gmc5对c5a趋化性的抑制作用，来判断gmc5是否对c5a具有中和作用。具体见下文：
[0063]
取一块含12个transwell小室的细胞培养板，取出小室的膜嵌套(膜直径12mm，孔径3μm)。于第3室到12室加入1.0ml细胞迁移培养基(rpmi 1640+0.5％(v/v)fbs)倍比稀释的gmc5，并于第2室加入1.0ml迁移培养基。同样的方法处理c-scfv及cd3-scfv，每种抗体浓度做3复室。接着，于第2室到12室加入500μl迁移培养基稀释的重组人c5a，至终浓度1nmol/l，并于第1室加入1.5ml迁移培养基。于每一膜嵌套中加入1.0ml含1
×
106个人中性粒细胞(human neutrophils)的细胞悬液(rpmi 1640+0.5％(v/v)fbs+human neutrophils)，将膜嵌套分别插入每个transwell小室，置37℃、5％co2孵育3h，取出膜嵌套，将小室里的培养基转入小试管，300g离心5min，重悬于200μl迁移培养基中，进行细胞计数。如下公式计算每种抗体对c5a趋化性的抑制率(％)：[(c
c-cm)/(c
c-cn)]
×
100％，其中cm为既加c5a又加抗体小室的平均细胞数；cc为只加c5a小室的平均细胞数；cn为既不加抗体也不加c5a小室的平均细胞数。
[0064]
见图4b，在没有抗体存在的情况下，人中性粒细胞在c5a的趋化作用下，很容易从tranwell培养小室的膜嵌套中通过滤膜进入到下室，但在有亲本抗体c-scfv及gmc5的存在下，进入到培养下室的中性粒细胞明显减少，说明gmc5对c5a的趋化性具有显著的抑制作用。抑制1nmol/l c5a介导的趋化作用，gmc5抗体50％的抑制浓度(ic
50
)为8nmol/l，100％(ic
100
)抑制浓度为512nmol/l。
[0065]
以上结果说明gmc5对gm-csf和c5a都具有中和作用。
[0066]
接着，对同时靶向gm-csf和c5a治疗自身免疫性炎症的科学性进行了实验论证。巨噬细胞是多种自身免疫疾病炎症反应的中心细胞，以巨噬细胞为研究对象，分析了同时靶向gm-csf和c5a在抑制炎症效应分子上的科学性。具体见下文：
[0067]
人巨噬细胞(macrophage)以1
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106个/ml重悬于含10％fbs的rpmi 1640培养基，置37℃、5％co2培养48h，弃去培养基，替换成含有如下分组成分的rpmi 1640培养基(10％fbs)继续培养48h。分组为：(1)1nmol/l gm-csf；(2)1nmol/l c5a；(3)1nmol/l gm-csf+1nmol/l c5a；(4)1nmol/l gm-csf+200nmol/l g-scfv；(5)1nmol/l gm-csf+200nmol/l c-scfv；(6)1nmol/l gm-csf+200nmol/l gmc5；(7)1nmol/l c5a+200nmol/l g-scfv；(8)1nmol/l c5a+200nmol/l c-scfv；(9)1nmol/l c5a+200nmol/l gmc5；(10)1nmol/l gm-csf+1nmol/l c5a+200nmol/l g-scfv；(11)1nmol/l gm-csf+1nmol/l c5a+200nmol/l c-scfv(12)1nmol/l gm-csf+1nmol/l c5a+200nmol/l gmc5。培养48h后，用商业化的elisa试剂盒检测细胞培养上清中的炎性细胞因子tnf-α、il-1β、il-6，趋化因子il-8、mcp-1的含量，用facs检测c5ar的表达。同时按照上述测定趋化活性的方法测定各组细胞在c5a作用下的趋化指数。
[0068]
见图5，用gm-csf或c5a单独刺激人巨噬细胞，都会诱导巨噬细胞炎性细胞因子tnf-α、il-1β、il-6及趋化因子il-8、mcp-1的分泌,而gm-csf和c5a共同刺激，炎性细胞因子和趋化因子的分泌较单独刺激显著升高。值得注意的是，gm-csf的刺激可上调巨噬细胞c5ar的表达，单独c5a刺激则不能，而gm-csf和c5a共同刺激则可使c5ar的表达水平更高。说明在自身免疫炎症中，gm-csf和c5a都是重要的炎症效应因子，两者都可强烈的诱导巨噬细胞分泌炎性细胞因子和趋化因子，在诱导细胞因子和趋化因子分泌上具有叠加效应，而且gm-csf还可与c5a协同诱导c5ar的表达。为了进一步研究同时阻断gm-csf和c5a的信号能否对巨噬细胞炎性细胞因子、趋化因子的分泌及c5ar的表达起到叠加/协同的抑制效应，用
gm-csf及c5a单独刺激或共刺激巨噬细胞，或在上述刺激过程中分别加入亲本抗体g-scfv,c-scfv或双特异抗体gmc5进行抑制，对各组细胞的炎性细胞因子和趋化因子的分泌、c5ar的表达以及趋化指数进行了分析。见图6，与上述发现一致，gm-csf及c5a诱导巨噬细胞炎性细胞因子、趋化因子分泌及c5ar表达具有叠加/协同的效应，亲本抗体g-scfv及c-scfv只抑制各自配体(gm-csf及c5a)诱导的炎症效应，而gmc5对gm-csf或c5a诱导的炎症效应都具有显著的抑制作用。尤其是用gm-csf及c5a共刺激巨噬细胞时，发现gmc5在抑制炎性细胞因子、趋化因子分泌及c5ar表达上显著优于单独的亲本抗体g-scfv或c-scfv。c5a-c5ar相互作用诱导巨噬细胞的趋化，于是对上述各组细胞进行了趋化指数的分析。与上述一致，gm-csf单独刺激或gm-csf+c5a协同刺激都可诱导c5ar的表达，使c5a对巨噬细胞的趋化指数升高，然而gmc5抑制c5a对巨噬细胞的趋化显著优于单独的亲本抗体g-scfv或c-scfv。如果进一步在transwell下室中补加500nm的gmc5，c5a对巨噬细胞的趋化作用几乎全部被抑制。
[0069]
自身免疫性炎症以t细胞、单核细胞及中性粒细胞在炎症组织的浸润及激活而分泌炎性细胞因子(tnf-α、il-1β、il-6等)、趋化因子(il-8、mcp-1等)为主要特征。炎性细胞因子诱导胶原酶和基质金属蛋白酶(mmps)的表达，造成组织的降解和损伤。趋化因子则进一步招募上述t细胞、单核细胞及中性粒细胞进入炎症组织，形成一个激活环。故此，要科学治疗自身免疫炎症，必须同时阻断炎性细胞因子和趋化因子的分泌。目前抗细胞因子治疗可显著下调细胞因子(tnf-α、il-1β、il-6、il-17等)和趋化因子(il-8、mcp-1等)的分泌，但对c5a却没有作用，而c5a本身就是一个非常重要的趋化因子和促炎因子，能够促进单核细胞和中性粒细胞进入炎症组织，并激活这些细胞分泌炎性细胞因子(tnf-α、il-1β、il-6等)。c5a是b细胞免疫(体液免疫)的下游效应分子，也是目前抗细胞因子治疗的盲点。本发明提供的双特异抗体gmc5可以通过阻断gm-csf信号途径，下调炎性细胞因子(tnf-α、il-1β、il-6等)及趋化因子(il-8、mcp-1等)的分泌，同时抑制c5a诱导的炎性细胞因子(tnf-α、il-1β、il-6等)及趋化因子(il-8、mcp-1等)的分泌和c5a对单核/巨噬细胞的趋化作用，因而在自身免疫炎症如类风湿关节炎、牛皮癣、crohn’s病、强直性脊柱炎、炎症性肠病等疾病的治疗上更具应用潜力，所以双特异抗体gmc5可用于制备治疗或预防自身免疫性疾病的药物。
[0070]
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种双特异抗体，其特征是：所述双特异抗体为gmc5，所述gmc5由抗gm-csf抗体、抗c5a抗体、及20t小肽依次串联连接而成。2.根据权利要求1所述的一种双特异抗体，其特征是：所述抗gm-csf抗体可变区为vh1和vl1，所述抗c5a抗体可变区为vh2和vl2；所述gmc5的串联连接顺序为vh1-vl1-vh2-vl2-20t，所述vh1与vl1之间、vh2与vl2之间均有(ggggs)3作为连接肽进行连接；vl1与vh2之间有人血清白蛋白(hsa)的一个小肽(hsalinker)作为连接肽进行连接；vl2与20t之间有ggggs作为连接肽进行连接；所述20t小肽为20个氨基酸小肽，其能与新生儿受体(fcrn)相互作用，抗体c末端添加有组氨酸标签。3.根据权利要求2所述的一种双特异抗体，其特征是：所述抗gm-csf抗体为抗gm-csf的单链抗体片段、fab片段或单域抗体片段中的一种；所述抗c5a抗体为抗c5a的单链抗体片段、fab片段或单域抗体片段中的一种。4.根据权利要求2所述的一种双特异抗体，其特征是：所述gm-csf抗体可变区vh1的氨基酸序列为：qlqesgpgvvkpsetlsltcsvsdsairkyywswirqppgqgleyigyiyasgss fynpsfksrvsmsvdatnnqfylkltsvtaadtavyycaaitgttdlwgrgtlvtvs；所述抗gm-csf抗体可变区vl1的氨基酸序列为：iqmtqspssvsasvgdrvtitcrasqginrrlawyqqkpgkapkrliyavstlqs gvpsrfngsgsgtdftltvnnvqpddlamyfclqsnnypltfgggtkvei；所述抗c5a抗体可变区vh2的氨基酸序列为：evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsg gstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardddyeewpwyygmdvw gqgtmvtvs；所述抗c5a抗体可变区vl2的氨基酸序列为：qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdiggskyvswyqqhpgkapkliifdvnr rpsglsnrfsasksgntasltisglqaedeadyyctsyhptktilfgggtkltvla；所述20t小肽的氨基酸序列为：hgnyflsghfgglypvqgsv；所述小肽(hsalinker)的氨基酸序列为：alevdetyvpkefnaetftfhadi。5.根据权利要求1-4所述的任意一种双特异抗体，其特征是：所述gmc5的氨基酸序列为seq id no:1；编码所述双特异抗体gmc5的基因，其dna序列为seq id no:2。6.根据权利要求1所述的一种双特异抗体的应用，其特征是：所述双特异抗体用于制备治疗或预防自身免疫性疾病的药物。7.根据权利要求1所述的一种双特异抗体的构建、表达、纯化方法，其特征是：所述gmc5按毕赤酵母的偏爱密码子合成gmc5编码基因，并在3
′
端添加组氨酸标签，连接入表达载体phb905m，形成gmc5的表达载体phb905m/gmc5，线性化phb905m/gmc5，转化毕赤酵母gs115(his4)宿主细胞，筛选阳性重组子；阳性重组子经扩大培养，用甲醇诱导gmc5的表达，表达产物经饱和硫酸铵沉淀，固定化金属离子亲和层析分离，得到纯化后的双特异抗体gmc5。

技术总结
本发明公开了一种双特异抗体及应用，涉及基因工程抗体技术领域。双特异抗体GMC5由抗GM-CSF抗体、抗C5a抗体、及20T小肽依次串联连接而成；抗GM-CSF抗体可变区为VH1和VL1；抗C5a抗体可变区为VH2和VL2；GMC5的串联连接顺序为VH1-VL1-VH2-VL2-20T；VH1与VL1之间、VH2与VL2之间均有(GGGGS)3作为连接肽进行连接；VL1与VH2之间有来源于人血清白蛋白的一个小肽作为连接肽进行连接；20T小肽为20个氨基酸小肽，其能与新生儿受体(FcRn)相互作用，延长抗体的血浆半衰期。本发明的GMC5可同时阻断T细胞免疫的炎性因子信号通路和B细胞免疫的炎性因子信号通路，在自身免疫性疾病的治疗上具有较好的应用潜力，同时能有效的克服目前小分子抗体血浆半衰期较短的不足。浆半衰期较短的不足。浆半衰期较短的不足。


技术研发人员：刘梦元 田鑫 何忠会 刘喜元
受保护的技术使用者：湖北大学
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/9/14