一种环孢霉素A半抗原、人工抗原及其应用的制作方法

一种环孢霉素a半抗原、人工抗原及其应用
技术领域
1.本发明涉及环孢霉素a的检测技术领域，具体地，涉及一种环孢霉素a半抗原、人工抗原及其应用。


背景技术：

2.环孢霉素a(cyclosporine a，csa)是一种真菌源性的高脂溶性环状十一肽类小分子药物，是一种强有力的免疫抑制剂。csa通过对免疫应答过程中多环节的作用，选择性抑制辅助性t淋巴细胞(th)的增殖及功能，产生免疫调节作用，是器官移植后起免疫抑制作用的主要药物之一。使用csa治疗可以显著提高皮肤、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、骨髓、肺、小肠等器官移植的存活率。此外，csa还可用于多种自身免疫疾病的治疗。csa的治疗作用、毒性反应与血药浓度密切相关，其安全范围窄，服药个体化差异大，低于其有效血药浓度无法起到治疗作用，过量使用则会引起严重的毒副作用，主要是肾毒性和肝毒性，其它的可逆性反应还包括腹泻、牙龈增生、恶心、呕吐、多毛症、震颤和高血压等。由于csa大多供长期预防性用药，而肾、肝毒性在肾、肝移植时难以和排异反应相区别。因此，环孢霉素a血药浓度的监测对于指导器官移植及自身免疫疾病患者的临床安全合理用药有着重要的意义。
3.目前检测csa主要还是依靠液质联用的色谱法，不仅设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，无法实现快速筛查检测，也不利于推广；另一检测方法为免疫学检测技术，此方法具有高特异性和高选择性的特点，非常适用于复杂基质痕量组分的检测。配合质谱检测，在血药浓度监测上起到优势互补、分层筛查的效果，更利于项目推广。
4.免疫检测产品的性能优劣是由抗原和抗体的性能决定的，而抗原和抗体的关键又是半抗原，因此，要得到性能优异的抗原和抗体，半抗原的结构设计就显得尤为重要。因此，开发高特异性的环孢霉素a半抗原或人工抗原对于环孢霉素a快速、高灵敏度、低成本检测方法具有至关重要的意义。
5.中国专利《环孢霉素a半抗原的制备方法及环孢霉素a的酶联免疫定量检测试剂盒》和《环孢霉素a免疫原、抗环孢霉素a特异性抗体和环孢霉素a检测试剂》其设计的环孢霉素a半抗原结构均从羟基的氢原子位置反应，生成带有醚键的活性手臂。由于环孢霉素a分子结构较大，羟基作为亲水基团，反应后降低了水溶性，不利于制备溶解性好的人工抗原。
6.中国专利《环孢霉素的偶联物及其制备方法与应用》中，把双键氧化成双羟基，再与丁二酸酐反应生物带有羧基的内酯结构，此结构设计有几点不足：1、含有三个羟基的结构与丁二酸酐反应存在较多不确定性，连接位置、可上1-3丁二酸；2、内酯类结构稳定性不足，长期保存时易水解。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种环孢霉素a半抗原、人工抗原及其应用。
8.本发明的第一个目的是提供一种环孢霉素a半抗原。
9.本发明的第二个目的是提供结构如式(i)所示化合物的制备方法。
10.本发明的第三个目的是提供一种环孢霉素a人工抗原。
11.本发明的第四个目的是提供权利要求1所述环孢霉素a半抗原在制备环孢霉素a人工抗原中的应用。
12.本发明的第五个目的是提供一种用于检测环孢霉素a的人工抗原组合物。
13.本发明的第六个目的是提供所述的环孢霉素a半抗原、所述的环孢霉素a人工抗原、和/或所述的人工抗原组合物，在制备环孢霉素a的免疫分析试剂盒的应用。
14.本发明的第七个目的是提供一种检测环孢霉素a的免疫分析试剂盒。
15.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
16.本发明要求保护一种环孢霉素a半抗原，所述环孢霉素a半抗原半抗原的结构如式(i)所示：
[0017][0018]
还有要求保护结构如式(i)所示化合物的制备方法，
[0019]
所述制备方法为：
[0020]
环孢霉素a和溴乙酸甲酯发生取代反应得到中间产物，水解中间产物得到结构如式(i)所示化合物。
[0021]
环孢霉素a的结构式为：
[0022]
溴乙酸甲酯的结构式为：
[0023]
得到的中间产物的结构式为：
[0024]
具体地，包括以下步骤：
[0025]
s1.环孢霉素a、乙腈、k2co3、fecl2、无水1,10-菲罗啉和溴乙酸甲酯，混合后充分反应，用乙酸乙酯萃取两次，减压蒸馏，去除溶剂，得到中间产物；
[0026]
s2.中间产物的甲醇溶液与氢氧化锂水溶液充分反应，加入氯化钠水溶液，用二氯甲烷萃取，水相ph值调至3～4，有固体析出，过滤，保留析出的固体，烘干既得。
[0027]
优选地，步骤s1中，环孢霉素a、乙腈、k2co3、fecl2、无水1,10-菲罗啉和溴乙酸甲酯的用量比为：0.8～1.2g：12～20ml：0.184～0.276g：0.024～0.036g：0.04～0.06g：0.2～0.3g。
[0028]
更优选地，步骤s1中，环孢霉素a、乙腈、k2co3、fecl2、无水1,10-菲罗啉和溴乙酸甲酯的用量比为：1.00g：10ml：0.23g：0.03g：0.05g：0.25g。
[0029]
优选地，步骤s1中，充分反应为96～100℃下反应16h以上。
[0030]
更优选地，步骤s1中，充分反应为100℃下反应16h以上。
[0031]
优选地，步骤s2中，中间产物与氢氧化锂的用量比为0.664～0.996mol：0.32～
0.48mol。
[0032]
更优选地，步骤s2中，中间产物与氢氧化锂的用量比为0.83mol：40mol。
[0033]
优选地，步骤s2中，充分反应为室温反应8h以上。
[0034]
优选地，步骤s2中，水相用4mol/l的稀盐酸将ph值调至3～4。
[0035]
进一步要求保护一种环孢霉素a人工抗原，所述环孢霉素a人工抗原为所述的环孢霉素a半抗原偶联载体蛋白，其结构如式(ii)所示：
[0036][0037]
优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的至少一种。
[0038]
所述环孢霉素a半抗原在制备环孢霉素a人工抗原中的应用，也属于本发明的保护范围。
[0039]
本发明还要求保护一种用于检测环孢霉素a的人工抗原组合物，含有免疫原和包被原，所述免疫原为所述的环孢霉素a人工抗原，其载体蛋白为血蓝蛋白，所述包被原为所述的环孢霉素a人工抗原，其载体蛋白为牛血清白蛋白。
[0040]
所述的环孢霉素a半抗原、所述的环孢霉素a人工抗原、和/或所述的人工抗原组合物，在制备环孢霉素a的免疫分析试剂盒的应用，也属于本发明的保护范围。
[0041]
本发明还要求保护一种检测环孢霉素a的免疫分析试剂盒，含有所述组合物。
[0042]
优选地，所述免疫分析试剂盒为化学发光免疫分析试剂盒，含有环孢霉素a人工抗
原与磁微球偶联物和示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体，
[0043]
所述环孢霉素a人工抗原与磁微球偶联物中的环孢霉素a人工抗原为所述的所述的环孢霉素a人工抗原，其载体蛋白为牛血清白蛋白，
[0044]
所述示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体中的抗环孢霉素a单克隆抗体是所述的环孢霉素a人工抗原为免疫原制备得到的，其载体蛋白为血蓝蛋白。
[0045]
更优选地，所述示踪物为吖啶盐，结构式如下所示：
[0046]
r为吖啶酯衍生(吖啶盐)的不同基团。
[0047]
更进一步地，所述吖啶盐为吖啶脂，结构式如下所示：
[0048][0049]
更优选地，所述环孢霉素a人工抗原与磁微球偶联物的制备方法为：环孢霉素a人工抗原活化羧基后，与羧基化的磁微球充分反应，既得。
[0050]
进一步优选地，所述充分反应为反应12小时。
[0051]
更优选地，所述示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体的制备方法为：抗环孢霉素
a单克隆抗体与示踪物混合均匀，充分反应。
[0052]
进一步优选地，抗环孢霉素a单克隆抗体与示踪物的质量为10:1。
[0053]
进一步优选地，所述充分反应为反应16到20小时。
[0054]
更优选地，还含有含0.05％proclin300的ph7.4的磷酸盐缓冲液、洗涤液、预激发液(pre-trigger)和激发液(trigger)的一种或几种。
[0055]
该试剂盒中：吖啶酯标记的抗环孢霉素a单克隆抗体，用于与样品中的环孢霉素a结合；偶联有环孢霉素a人工抗原的磁性微球，用于捕获标记抗体与环孢霉素a形成的免疫复合物；环孢霉素a标准溶液，用于制备不同浓度的标准曲线；清洗液，用于清洗反应池和移除非特异性结合物；化学发光pre-trigger和trigger，用于混合后触发吖啶酯标记物的化学发光反应。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简便、重现性好等优点，适用于临床受测者血清中的环孢霉素a水平。
[0056]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0057]
1、本发明设计的环孢霉素a半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了待测目标物的羟基和双键的特征结构，增强了识别位点。
[0058]
2、本发明中的环孢霉素a人工抗原及单克隆抗体用于化学发光检测特异性强，ic50值为87ng/ml。
[0059]
3、本发明中的环孢霉素a人工抗原及单克隆抗体用于化学发光免疫检测技术，可快速、便捷地实现环孢霉素a的检测，本发明中建立的化学发光免疫检测方法学与目前痕量血药浓度检测金标准的高效液相色谱法进行比对，两者相关性良好，具有非常明显的临床应用价值。
附图说明
[0060]
图1为环孢霉素a半抗原的合成路线。
[0061]
图2为环孢霉素a人工抗原的合成路线。
[0062]
图3为环孢霉素a标准溶液elisa抑制曲线。
[0063]
图4为环孢霉素a标准溶液抑制曲线。
具体实施方式
[0064]
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0065]
实施例1环孢霉素a半抗原的制备
[0066]
一、实验方法
[0067]
合成路线如图1所示，环孢霉素a半抗原通过以下方法制备，具体的制备步骤如下：
[0068]
(1)取1.00g(0.83mmol)化合物1(环孢霉素a，cas#：59865-13-3)于50ml圆底烧瓶中，再依次加入10ml乙腈、0.23g k2co3(1.66mmol)、0.03g fecl2(0.25mmol)、0.05g无水1,10-菲罗啉(0.25mmol)和0.25g(1.66mmol)化合物2(溴乙酸甲酯，cas#：96-32-2)，于100℃下反应16h以上。反应完毕，加入90ml纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，减压蒸馏，去除溶剂，得
1.07g化合物3。
[0069]
(2)将1.02g(0.83mmol)的化合物3溶解到10ml甲醇中，再加入10ml 4mol/l的氢氧化锂水溶液中，反应混合物在室温反应8h以上，加入90ml氯化钠水溶液，并用50ml二氯甲烷萃取两次，水相用4mol/l的稀盐酸将ph值调至3～4，有固体析出，过滤，保留析出的固体，烘干得0.72g环孢霉素a半抗原。
[0070]
其中，化合物1的结构式为
[0071]
化合物2的结构式为化合物3的结构式为合成路线为：
[0072][0073]
二、实验结果
[0074]
制备得到半抗原的结构如式(i)所示：
[0075][0076]
实施例2环孢霉素a人工抗原的制备
[0077]
一、实验方法
[0078]
合成路线如图2所示，具体的制备步骤如下：
[0079]
1、载体蛋白为牛血清白蛋白的环孢霉素a人工抗原，合成方法如下：
[0080]
(1)取10mg实施例1中制备的环孢霉素a半抗原，溶解于0.2ml二甲基甲酰胺(dmf)中，搅拌充分后，加入10mg碳二亚胺(edc)和10mg n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温下搅拌4h，即可得到半抗原活化酯；
[0081]
(2)称取35mg牛血清蛋白(bsa)，使其充分溶解在3ml 0.01mol/l的pbs溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在室温下搅拌16～24h；
[0082]
(3)步骤(2)制得的溶液用0.01mol/l的pbs室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
[0083]
(4)分装，于4℃保存备用。
[0084]
2、载体蛋白为血蓝蛋白的环孢霉素a人工抗原，合成方法如下：
[0085]
(1)取5mg实施例1中制备的环孢霉素a半抗原，溶解于0.2ml二甲基甲酰胺(dmf)中，搅拌充分后，加入10mg edc和10mg n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温下搅拌4h，即可得到半抗原活化酯；
[0086]
(2)称取15mg血蓝蛋白(klh)，使其充分溶解在3ml 0.01mol/l的pbs溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，并在
室温下搅拌16～24h；
[0087]
(3)步骤(2)制得的溶液用0.01mol/l的pbs室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
[0088]
(4)分装，于4℃保存备用。
[0089]
二、实验结果
[0090]
制备得到环孢霉素a人工抗原，其结构式如(ii)所示，其中protein为蛋白载，
[0091][0092]
实施例3抗环孢霉素a单克隆抗体的制备
[0093]
以实施例2制备得到的载体蛋白为血蓝蛋白的环孢霉素a人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫balb/c小鼠。每只鼠免疫剂量为100μg，免疫间隔2周，免疫3次后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100μg全抗原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与sp20细胞(小鼠骨髓瘤细胞)融合。融合后的细胞在hat培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成hat培养基进行培养。用elisa对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，经冷冻干燥后即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体。
[0094]
实施例4环孢霉素a人工抗原在elisa中的应用与效果评价
[0095]
一、实验方法
[0096]
用ph9.6的碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将载体蛋白为牛血清白蛋白的环孢霉素a人工抗原稀释至0.12μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按250μl/孔加入含量为1％(质量百分比)bsa的磷酸盐缓冲液中37℃封闭1h，甩干，干燥后真空包装保存。
[0097]
向包被有环孢霉素a人工抗原(偶联载体蛋白为牛血清白蛋白)的微孔酶标板中加入环孢霉素a标准溶液100μl/孔(用ph7.4的磷酸盐缓冲液进行梯度稀释)，再相应加入环孢霉素a单克隆抗体(实施例3制备得到的)溶液20μl/孔(用含质量百分比0.05％叠氮钠，ph7.4的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体稀释至0.06μg/ml，现配现用)，37℃反应0.5h；甩干后，加入洗液250μl/孔，洗涤3次后拍干；再加入酶标二抗100μl/孔，37℃反应0.5h；再次洗涤3次后拍干，加入100μl/孔显色液，37℃反应15min；加入1m硫酸50μl/孔终止，设定酶标仪于450nm波长测定每孔的od值。
[0098]
二、实验结果
[0099]
结果如下表1所示。
[0100]
表1.elisa测试不同浓度的环孢霉素a标准溶液的od值
[0101][0102]
通过表1中数据，采用elisa calc软件进行四参数logistic曲线拟合绘制标准曲线，得到的标准曲线如图3所示，环孢霉素a的线性方程为：y＝(a-d)/[1+(x/c)^b]+d，r2＝0.998，a＝2.48562，b＝0.65534，c＝263.70024，d＝-0.06506，x表示待测物浓度，y表示od值，通过计算得到ic50值为242.09μg/l，在50～4050μg/l呈较好的线性关系。
[0103]
实施例5化学发光(clia)法检测环孢霉素a的方法的建立和标准曲线的建立
[0104]
一、实验方法
[0105]
1、环孢霉素a人工抗原与磁微球偶联物的制备
[0106]
浓缩抗原：将0.1～0.15mg实施例2制备得到的环孢霉素a人工抗原(偶联载体蛋白为牛血清白蛋白)加入超滤离心管(10～30kd)中，在4℃冷冻离心机8000r/min离心5～6min进行浓缩。
[0107]
洗脱浓缩纯化的抗原：将浓缩后的环孢霉素a人工抗原加入200μl洗涤液(ph9.6的碳酸盐缓冲液)进行洗涤，8000～9000r/min离心5～6min，弃掉滤液；再加入200μl上述洗涤液进行洗涤液，8000～9000r/min离心5～6min；重复洗涤和离心的步骤5～6次；之后把离心柱反转，2000～3000r/min离心1min，收集滤液，收集截留物，即为经过浓缩纯化的环孢霉素a人工抗原(偶联载体蛋白为牛血清白蛋白)。
[0108]
偶联：经过浓缩纯化的环孢霉素a人工抗原(偶联载体蛋白为牛血清白蛋白)0.1～0.5mg加入10mg碳二亚胺(edc)和10mg n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温下搅拌4h，即可得到活化的环孢霉素a人工抗原(偶联载体蛋白为牛血清白蛋白)；加入直径4μm，浓度为10mg/ml羧基化的磁微球200μl，采用漩涡混合器充分混匀悬浮磁微球与活化的环孢霉素a人工抗原，室温下反应12h，得到环孢霉素a人工抗原(偶联载体蛋白为牛血清白蛋白)与磁微球的偶联物。
[0109]
2、示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体的制备
[0110]
利用实施例3中制备的单克隆抗体进行示踪物标记，具体实验操作如下：
[0111]
浓缩抗体：将1.0mg实施例3制备所得单克隆抗体加入超滤离心管(30kd)中，8000r/min离心5～6min进行浓缩。
[0112]
洗脱浓缩纯化的抗体：将浓缩后的实施例3制备所得单克隆抗体加入200μl磷酸盐缓冲液(pb buffer，ph7.4)进行洗涤，8000～9000r/min离心5～6min，弃掉滤液；再加入200μl pb buffer进行洗涤，按上述方8000～9000r/min离心5～6min，弃掉滤液；重复洗涤和离心的步骤5～6次；之后把离心柱反转，2000～3000r/min离心1min，收集滤液，收集截留物约200μl，即为经过浓缩纯化的抗环孢霉素a单克隆抗体。
[0113]
示踪物标记抗环孢霉素a单克隆抗体：将收集的单克隆抗体与吖啶盐(示踪物)按10：1质量比充分混匀，静置16～20小时后进行分子筛过柱方式的纯化处理，即得示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体。
[0114]
3、化学发光(clia)法检测环孢霉素a的方法和标准曲线的建立
[0115]
实验步骤如下：
[0116]
用去激素人血清对环孢霉素a标准物进行梯度稀释，配置成不同浓度的标准溶液，浓度分别为：0、10、50、100、500、1000、2000ng/ml；
[0117]
开始实验时，先往反应管中加入环孢霉素a人工抗原与磁微球偶联物50μl(浓度为400μg/ml，按磁珠浓度计算)，接着加入环孢霉素a标准溶液100μl；再相应加入示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体溶液20μl(用含质量百分比0.05％proclin300，ph7.4的磷酸盐缓冲液，将示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体稀释至0.1μg/ml，现配现用)，37℃封闭环境下反应0.5h；
[0118]
进行清洗：把反应管置于磁场中，在磁场力作用下反应后的磁微球吸附在反应管壁上，吸去上清液，脱离磁场后加入洗涤液(ph9.6的碳酸盐缓冲液)250μl进行混匀，再次通过磁场吸附磁微球，吸去上清液。重复上述清洗步骤3次；最后加入激发液与预激发液各100μl/管，立即进行光值测定所得rlu值。
[0119]
二、实验结果
[0120]
结果如下表1所示，
[0121]
表1化学发光(clia)测试不同浓度的环孢霉素a标准溶液的rlu值：
[0122][0123]
通过表1中数据，采用统计学软件进行四参数boltzmann曲线拟合绘制标准曲线，得到的标准曲线如图4所示，环孢霉素a的标准曲线的线性方程为：y＝a2+(a1-a2)/(1+exp((x-x0)/dx))，r2＝0.9978，a1＝4054839794，a2＝115376，x0＝-883.66，dx＝113.68，x表示待测物浓度，y表示rlu值，通过计算得到ic50值为87ng/ml，在10～2000ng/ml呈良好的线性关系。
[0124]
实施例6一种化学发光(clia)法检测环孢霉素a的方法
[0125]
采用竞争免疫分析法，利用化学发光磁微球免疫技术，定量测定待测样本中环孢霉素a的含量。样本中的环孢霉素a和包被有环孢霉素a人工抗原的磁微球偶联物同时竞争示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体，经过反应，形成磁微球-环孢霉素a人工抗原-示踪
物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体的免疫复合物。经过洗涤分离，最后在免疫复合物中加入预激发液(pre-trigger)和激发液(trigger)；最后测量化学发光反应的相对光单位(rlu/s)，样本中环孢霉素a的量和光学系统所测量出的相对光单位(rlu/s)成反比关系。
[0126]
具体步骤如下：
[0127]
1、反应管中加入实施例5制备的环孢霉素a人工抗原与磁微球偶联物50μl(浓度为400μg/ml，按磁珠浓度计算)；
[0128]
2、接着加入待测样本100μl，或梯度浓度的用去激素人血清对环孢霉素a标准物；
[0129]
3、再相应加入实施例5制备的示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体溶液20μl(用含质量百分比0.05％proclin300，ph7.4的磷酸盐缓冲液，将示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体稀释至0.1μg/ml，现配现用)；
[0130]
4、37℃封闭环境下反应0.5h；
[0131]
5、反应管置于磁场中，在磁场力作用下反应后的磁微球吸附在反应管壁上，吸去上清液，脱离磁场后加入洗涤液250μl进行混匀；
[0132]
6、再次通过磁场吸附磁微球，吸去上清液；
[0133]
7、重复5和6步骤3次；
[0134]
8、加入激发液与预激发液各100μl/管，立即进行光值测定所得rlu值；
[0135]
9、所得rlu值通过环孢霉素a的标准曲线的线性方程得到相应浓度。
[0136]
实施例7一种化学发光(clia)法检测环孢霉素a的试剂盒
[0137]
一、组成
[0138]
实施例5制备得到的环孢霉素a人工抗原与磁微球偶联物、实施例5制备得到的示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体、含质量百分比0.05％proclin300的ph7.4的磷酸盐缓冲液、洗涤液(ph9.6的碳酸盐缓冲液)、预激发液(pre-trigger)和激发液(trigger)。
[0139]
二、使用方法
[0140]
同实施例6。
[0141]
实施例8化学发光(clia)法检测环孢霉素a的方法的对人全血样本的检测
[0142]
一、实验方法
[0143]
使用实施例5的试剂盒检测了43例人全血样本中环孢霉素a的含量，同时以高效液相色谱法定量测定的结果作为对照，其中高效液相色谱法定量测定的具体方法为：
[0144]
流动相采用乙腈-冰醋酸混合溶液(8:2)，流速为0.9～1.1ml/min，过柱后分流比7:3，温度控制在65℃，进样量10μl/针，运行时间15min。电喷雾离子源(esi)，选择正离子方式进行离子监测，毛细管电压4000v；环孢霉素a的m/z＝1203.2
→
425.5，内标物子囊霉素809.4
→
756.4。
[0145]
分别取全血样本100μl加入板孔中，加入20μl红细胞破碎剂及内标物，12000r/min，5min，取上清液转移到另一板孔中，氮气吹干，乙腈-冰醋酸混合溶液复溶后，12000r/min，5min，取上清液按进样量10μl/针进样分析。
[0146]
二、实验结果
[0147]
结果如表2所示，
[0148]
表2：
[0149] n极小值极大值均值标准差
clia(实施例5的试剂盒)4352.00784.00319.9767180.74139色谱法4337.00858.00331.5581200.00099有效例数n43
ꢀꢀꢀꢀ
[0150]
对2两种方法获得的数据进行相关性分析，结果显示化学发光免疫分析法(实施例5的试剂盒)与色谱法相关性为0.952，在p＝0.01水平上显著相关。结果见表3，说明两种方法学在定量检测结果上相关性良好。
[0151]
表3：
[0152][0153]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一种环孢霉素a半抗原，其特征在于，所述环孢霉素a半抗原的结构如式(i)所示：2.结构如式(i)所示化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：环孢霉素a和溴乙酸甲酯发生取代反应得到中间产物，水解中间产物得到结构如式(i)所示化合物。3.一种环孢霉素a人工抗原，其特征在于，所述环孢霉素a人工抗原为权利要求1所述的环孢霉素a半抗原偶联载体蛋白，其结构如式(ii)所示：
4.根据权利要求3所述的环孢霉素a人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的至少一种。5.权利要求1所述环孢霉素a半抗原在制备环孢霉素a人工抗原中的应用。6.一种用于检测环孢霉素a的人工抗原组合物，其特征在于，含有免疫原和包被原，所述免疫原为权利要求3所述的环孢霉素a人工抗原，其载体蛋白为血蓝蛋白，所述包被原为权利要求3所述的环孢霉素a人工抗原，其载体蛋白为牛血清白蛋白。7.权利要求1所述的环孢霉素a半抗原、权利要求3所述的环孢霉素a人工抗原、和/或权利要求6所述的人工抗原组合物，在制备环孢霉素a的免疫分析试剂盒的应用。8.一种检测环孢霉素a的免疫分析试剂盒，其特征在于，含有权利要求6所述组合物。9.根据权利要求8所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述免疫分析试剂盒为化学发光免疫分析试剂盒，含有环孢霉素a人工抗原与磁微球偶联物，以及示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体，所述环孢霉素a人工抗原与磁微球偶联物中的环孢霉素a人工抗原为权利要求3所述的所述的环孢霉素a人工抗原，其载体蛋白为牛血清白蛋白，所述示踪物标记的抗环孢霉素a单克隆抗体中的抗环孢霉素a单克隆抗体是权利要求3所述的环孢霉素a人工抗原为免疫原制备得到的，其载体蛋白为血蓝蛋白。10.根据权利要求9所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，还含有含0.05％proclin300的ph7.4的磷酸盐缓冲液、洗涤液、预激发液和激发液的一种或几种。

技术总结
本发明公开了一种环孢霉素A半抗原、人工抗原及其应用，本发明设计的环孢霉素A半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了待测目标物的羟基和双键的特征结构，增强了识别位点；本发明中的环孢霉素A人工抗原及单克隆抗体用于化学发光检测特异性强，IC50值为87ng/mL；本发明中的环孢霉素A人工抗原及单克隆抗体用于化学发光免疫检测技术，可快速、便捷地实现环孢霉素A的检测，本发明中建立的化学发光免疫检测方法学与目前痕量血药浓度检测金标准的高效液相色谱法进行比对，两者相关性良好，具有非常明显的临床应用价值。具有非常明显的临床应用价值。具有非常明显的临床应用价值。


技术研发人员：李志雄 董志宁 王红翠 何玲
受保护的技术使用者：广州市达瑞生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/9/14