一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料及其制备方法和应用

1.本技术涉及生物医学材料领域，尤其是涉及一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着医学、药学以及生物学等学科的不断发展，针对各种疾病的新药层出不穷，但是如何让药物在体内持续稳定地释放依旧是个难题。无论是口服给药还是静脉注射，血药浓度的变化都会出现“峰谷”现象，药物浓度太高会导致较大的毒副作用，浓度太低则达不到治疗效果。新兴的生物活性大分子药物尽管高效，但生物半衰期短，容易失活，同样也是困扰药物开放者的难题。目前解决这些问题的主要途径是采用适当的生物材料将药物包埋或吸附，形成药物控释系统，植入到组织“病灶”部位，进行局部给药。作为药物控释系统载体的生物材料需要具有生物相容性和生物降解能力，根据材料性质主要可以分为无机材料、天然高分子材料及合成高分子材料。其中人工合成的可降解高分子材料尤其是氨基化可降解聚酯可以通过改变其原材料化学组成、材料结构及表面性质等，来设计其生物应答特性。自载药微球技术被研究以来，其体内性能研究离不开与凝胶体系或支架材料的复合。
3.水凝胶是以水为分散介质的凝胶，是向具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物。水凝胶可吸收自身质量数千倍的水分，几乎可呈现出任何形状及尺寸。作为一种聚合物支架，水凝胶在组织修复及其他疾病治疗方面具有多种应用前景。由于水凝胶的网络状结构，蛋白或细胞可被包埋在网状结构内部并可控制释放包裹物。此外，水凝胶在体内降解被吸收，可与周围组织完美结合，从而可以避免手术移除的复杂性，而且还可以减少炎症反应的可能性。与人工构建的支架材料相比，脱细胞骨基质植入缺损部位后可以更好地感知“外界”环境，与周围组织、细胞建立信号联系并进行物质交换，介导细胞及各种蛋白质的粘附，主动参与组织修复的整个过程，具有较强的生物应答性。但脱细胞骨基质只能提供药物的短期释放，无法长效释放药物以持续刺激“病灶”部位，导致脱细胞骨基质难以单独治疗缺损的组织。载药微球有着良好的药物控释作用，可以长期有效地释放药物达到对组织的治疗作用，但是微球及其支架的力学性能往往达不到骨修复的要求。载药微球/脱细胞骨基质复合支架可以弥补这两种材料单独使用的缺陷，并发挥它们在药物控释、力学强度、多孔连通结构、生物相容性等方面的优点。
4.同时，脱钙脱细胞骨基质如果没有采用含醛基的试剂或材料进行交联，其将在生理环境下快速降解，达不到组织修复的功效。海藻酸钠早已被收录到美国药典和英国药典，具有可降解性、良好的生物相容性及无免疫原性。海藻酸钠可用于悬浮液、凝胶和以脂肪和油类为基质的浓缩乳剂的生产中。海藻酸钠用于一些液体药物中，可增强粘性，改善固体的悬浮。钙、镁、锌等二价金属离子可以使海藻酸钠发生交联反应，形成海藻酸盐水凝胶。但随着二价离子与其他价态离子发生交换/取代，海藻酸盐水凝胶的交联结构将会丧失。对海藻酸钠进行氧化处理，使其携带可交联脱细胞骨基质的醛基，获得可作为脱细胞骨基质交联
剂的氧化海藻酸钠。


技术实现要素：

5.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种同时拥有药物长期控释与生物活性的载药微球/脱细胞骨基质复合材料及其制备方法和应用。
6.本技术的第一方面，提供一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料，主要包括载药微球和脱细胞骨基质；所述载药微球包括治疗剂、负载治疗剂的介孔材料、包覆所述介孔材料的氨基化可降解聚酯、包覆所述介孔材料和氨基化可降解聚酯的氧化海藻酸钠。
7.根据本技术的一些实施例，所述治疗剂包括但不限于化学治疗剂、生物治疗剂，可以例举出如抗肿瘤剂、抗体、抗炎剂和免疫治疗剂以及其它一些具有特定功能的天然或人工合成药物等。
8.根据本技术的一些实施例，治疗剂为用于组织修复和/或再生的治疗剂。
9.根据本技术的一些实施例，治疗剂为骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-7、血管内皮生长因子、阿仑膦酸钠、柚皮甙、白藜芦醇中的至少一种。
10.根据本技术的一些实施例，所述氨基化可降解聚酯是指通过改性后带有氨基的可降解聚酯。
11.根据本技术的一些实施例，氨基化可降解聚酯选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚3-羟基烷酸酯、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)、聚三亚甲基碳酸酯、聚丁二酸丁二酯中的至少一种。
12.根据本技术的一些实施例，氨基化可降解聚酯的分子量为2～15万道尔顿。
13.根据本技术的一些实施例，介孔材料可以是介孔硅酸钙、介孔硅酸镁、介孔硅酸钙镁、介孔硅酸锌、介孔硅酸铜中的一种或其组合物。
14.根据本技术的一些实施例，介孔材料的平均孔径为2～30nm，比表面积为70～1000m2/g。
15.根据本技术的一些实施例，氧化海藻酸钠是指通过处理后具有醛基的海藻酸钠。
16.根据本技术的一些实施例，载药微球/脱细胞骨基质复合材料的治疗剂包封率为40％～70％。
17.根据本技术的一些实施例，载药微球的粒径为0.01～2mm。
18.根据本技术实施例的载药微球/脱细胞骨基质复合材料，至少具有如下有益效果：
19.本技术所提供的载药微球/脱细胞骨基质复合材料将氨基化可降解聚酯作为基体材料，并与介孔材料等结合使用，使得载药微球/脱细胞骨基质复合材料同时具有良好的药物缓释效果、生物活性及交联海藻酸盐的功能，药物释放周期可达28天以上，药物控释能力更强。
20.本技术的第二方面，提供上述载药微球/脱细胞骨基质复合材料的制备方法，包括：制备氧化海藻酸钠
→
制备负载治疗剂的介孔材料/氨基化可降解聚酯/氧化海藻酸钠复合微球
→
制备脱细胞骨基质
→
将复合微球分散于凝胶状氧化海藻酸钠和脱细胞骨基质中。具体包括如下步骤：
21.s1、首先对海藻酸钠进行氧化改性；使用介孔材料装载治疗剂，氨基化可降解聚酯
溶于有机溶剂得到氨基化可降解聚酯溶液，再将装载治疗剂的介孔材料与氨基化可降解聚酯溶液混合，加入到含乳化剂和氧化海藻酸钠的水溶液中持续搅拌，制得负载治疗剂的介孔材料/氨基化可降解聚酯/氧化海藻酸钠复合微球，即载药微球；
22.s2、采用盐酸、化学试剂、酶等对骨组织进行处理得到脱细胞骨基质，溶解于含氧化海藻酸钠的水溶液后获得凝胶状氧化海藻酸钠和脱细胞骨基质；将步骤s1所得载药微球分散于含氧化海藻酸钠和脱细胞骨基质的水溶液中反应，冷冻干燥，获得载药微球/脱细胞骨基质复合材料。
23.根据本技术的一些实施例，步骤s1中，对海藻酸钠进行氧化改性的具体操作为：将海藻酸钠溶于水与乙醇的混合液中，加入氧化剂避光反应，随后依次加入乙二醇、氯化钠、无水乙醇，过滤、冷冻干燥，获得氧化海藻酸钠。
24.根据本技术的一些实施例，水与乙醇的体积比为1:(1～4)。
25.根据本技术的一些实施例，海藻酸钠在水和乙醇混合液中的质量浓度为1％～3％。
26.根据本技术的一些实施例，氧化剂为高碘酸钠，海藻酸钠与氧化剂的质量比为(20～50):1。
27.根据本技术的一些实施例，海藻酸钠与乙二醇的质量体积比为(0.1～0.5):1g/ml。
28.根据本技术的一些实施例，乙二醇、氯化钠、无水乙醇的质量体积比为10:(1～4):(1～2)ml/g/l。
29.载药微球通过乳化溶剂挥发法进行制备，方法较为简单，对设备的要求不高，原料来源易得，成本低廉，易于实现产业化。
30.制备载药微球的方法很多，包括乳化溶剂挥发法、相分离法、乳化溶剂萃取法、喷雾干燥法、熔融法等，而乳化溶剂挥发法又进一步可以细分为o/w乳化法、s/o/w乳化法、o1/o2乳化法、复乳-液中干燥法等。本技术实施例要求制备的负载治疗剂的介孔材料/氨基化可降解聚酯复合微球以氨基化可降解聚酯为包覆介孔材料的壳层，因此通过s/o/w乳化法制备更合适。对于本技术的实施例而言，s/o/w乳化法是将负载治疗剂的介孔材料及氨基化可降解聚酯溶于有机溶剂形成共混液，随后将共混液加入到含有乳化剂的水相中，通过诸如机械搅拌、超声波等分散方式形成s/o/w型乳剂，随后通过继续分散等方式蒸发乳剂中的有机溶剂使其挥发，负载治疗剂的介孔材料与氨基化可降解聚酯沉积形成微球。形成的微球可以选择通过离心、洗涤、筛分等本领域常用的方法步骤收集，并进一步可选通过真空干燥和/或冷冻干燥的方式获得微球的干粉。
31.其中，有机溶剂可以例举出诸如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或丙酮等挥发性有机溶剂；乳化剂可以是非离子型乳化剂，具体可以例举出诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、明胶、聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸钠等。
32.根据本技术的一些实施例，有机溶剂为二氯甲烷。有机溶剂在水相中的溶解度等性质与形成的载药微球/脱细胞骨基质复合材料的粒径、包封率和载药量有关，使用二氯甲烷可以提高治疗剂的包封率。
33.根据本技术的一些实施例，乳化剂为聚乙烯醇。乳化剂的类型、浓度与形成的乳剂中液滴大小、负载治疗剂的介孔材料与水相的分散程度有关，本发明采用聚乙烯醇作为乳
化剂并选择1％～5％的浓度范围可以在一定程度上提高介孔材料/氨基化可降解聚酯复合微球中包封率和载药量。
34.根据本技术的一些实施例，分散的方法为200～900rpm下持续搅拌8～12h。形成乳剂和蒸发有机溶剂过程中所采用的分散方法对于微球的形成有一定影响，采用上述的分散方法可以使获得的载药微球/脱细胞骨基质复合材料的粒径增加、包封率提高。
35.根据本技术的一些实施例，治疗剂与介孔材料的质量比为1:(2～200)。
36.根据本技术的一些实施例，装载治疗剂的介孔材料与氨基化可降解聚酯的质量比为1:(20-80)。
37.根据本技术的一些实施例，步骤s1中，氨基化可降解聚酯溶液中氨基化可降解聚酯与有机溶剂的质量体积比为(0.03～0.08):1g/ml根据本技术的一些实施例，步骤s1中，氨基化可降解聚酯溶液与含乳化剂和氧化海藻酸钠的水溶液的体积比为(1～3):10。
38.根据本技术的一些实施例，步骤s1中，含乳化剂和氧化海藻酸钠的水溶液中乳化剂、氧化海藻酸钠与水溶液的质量体积比为：(0.2～3):(0.2～1):100g/g/ml。
39.根据本技术的一些实施例，步骤s2中，所述化学试剂可以是乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫酸钠、曲拉通中的一种或其组合；酶可以是胰酶、dnase、rnase中的一种或其组合。
40.根据本技术的一些实施例，步骤s1处理所得载药微球与含氧化海藻酸钠溶液的质量体积比为1:(300～2000)g/ml。
41.根据本技术的一些实施例，步骤s2中，所述含氧化海藻酸钠和脱细胞骨基质的水溶液中氧化海藻酸钠的质量浓度为5％～30％。
42.根据本技术的一些实施例，步骤s2中，所述含氧化海藻酸钠和脱细胞骨基质的水溶液中脱细胞骨基质的质量浓度为0.5％～5％。
43.根据本技术的一些实施例，步骤s2中，所述反应时间为2～10h。
44.本技术的第三方面，提供医用组合物，该医用组合物包括上述的载药微球/脱细胞骨基质复合材料。利用上述载药微球/脱细胞骨基质复合材料，可以获得进一步的医用组合物，通过微球的生物活性和药物控释效果实现基于特定治疗剂的医用目的(如用于组织损伤修复再生)。例如，包含上述载药微球/脱细胞骨基质复合材料的支架、敷料或其它复合材料等。
45.本技术的第四方面，提供医疗装置，该医疗装置包括上述的载药微球/脱细胞骨基质复合材料，或包括上述的医用组合物。例如，基于药物控释系统的可植入装置，通过上述载药微球/脱细胞骨基质复合材料的使用实现组织损伤修复。
46.本发明首先将具有优秀生物相容性的脱细胞骨基质制成水凝胶形态，添加具有介孔材料/氨基化可降解聚酯复合微球及氧化海藻酸钠，制得载药微球/脱细胞骨基质复合材料。其中，介孔材料/氨基化可降解聚酯复合微球可缓控释治疗剂；同时，从介孔材料释放出的二价钙、镁、锌等离子可维持复合材料中海藻酸盐的交联状态，有利于其力学强度的保持。氧化海藻酸钠主要起交联脱细胞骨基质的作用；由脱细胞骨基质和海藻酸盐组成的水凝胶可以进一步调控治疗剂的释放行为，并提升微球的生物相容性和生物活性，使其适于不同组织的修复需求，能有效促进组织的修复和重建。
47.与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
48.(1)本发明采用了物理化学方法相结合的手段从天然牛骨中脱除了免疫原性物
质，使得到的凝胶基体生物相容性更好。
49.(2)本发明采用了不同乳化剂/介孔材料/治疗剂的组合制备氨基化聚酯载药微球，药物包封率更高，缓释效果更好。
50.(3)本发明制备的载药微球/脱细胞骨基质复合材料，该材料拥有足够的力学性能的同时也可以对药物进行缓释，能够满足组织的修复需求。
附图说明
51.下面结合附图和实施例对本技术做进一步的说明，其中：
52.图1是实施例1-5的体外药物释放性能检测结果。
53.图2是实施例3和对比例1-3体外药物释放性能检测结果。
54.图3是实施例3载药微球的sem图片。
55.图4是实施例3载药微球/脱细胞骨基质复合材料的sem图片。
56.图5是实施例3载药微球/脱细胞骨基质复合材料的细胞粘附情况。
具体实施方式
57.以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。
58.下面详细描述本技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
59.实施例1
60.本实施例提供一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料，该载药微球/脱细胞骨基质复合材料的制备方法如下：
61.(1)将3g海藻酸钠溶于150ml水与乙醇(v:v＝1:2)的混合液中，加入150mg高碘酸钠避光反应18h，随后依次加入10ml乙二醇、4g氯化钠、2l无水乙醇反应6h，过滤、冷冻干燥，获得氧化海藻酸钠。
62.(2)将0.2mg骨形态发生蛋白-7与20mg介孔硅酸锌混合得到药物与介孔硅酸锌的混合粉体，然后取上述20mg混合粉体分散于10ml含0.4g聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(分子量15万)的丙酮溶液中，得到载药的介孔硅酸锌/聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)共混液；配置90ml含0.8g聚乙烯醇124及0.6g氧化海藻酸钠的水溶液，然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇及氧化海藻酸钠的水溶液中，900rpm下持续搅拌10h后将容器底部的复合微球分离出来，制得载药介孔材料/可降解聚酯/海藻酸盐复合微球。
63.(3)依次采用0.4n的盐酸、二氯甲烷及乙醇、0.05％胰酶、0.1％曲拉通100对骨组织进行处理及清洗冻干等得到脱细胞骨基质；取6g脱细胞骨基质溶于200ml含10g氧化海藻酸钠的水溶液获得凝胶状的脱细胞骨基质，再将100mg步骤(2)处理所得载药微球分散于液态脱细胞骨基质中10h，冻干获得载药微球/脱细胞骨基质复合材料，药物包封率为40％。
64.实施例2
65.本实施例提供一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料，该载药微球/脱细胞骨基质
复合材料的制备方法如下：
66.(1)将3g海藻酸钠溶于100ml水与乙醇(v:v＝1:3)的混合液中，加入80mg高碘酸钠避光反应24h，随后依次加入10ml乙二醇、6g氯化钠、2l无水乙醇反应6h，过滤、冷冻干燥，获得氧化海藻酸钠。
67.(2)将0.15mg血管内皮生长因子与20mg介孔硅酸钙镁混合得到药物与介孔硅酸钙镁的混合粉体，然后取上述20mg混合粉体分散于20ml含1.6g聚三亚甲基碳酸酯(分子量2万)的二氯甲烷溶液中，得到载药的介孔硅酸钙镁/聚三亚甲基碳酸酯共混液；配置150ml含0.3g羧甲基纤维素钠及1.2g氧化海藻酸钠的水溶液，然后将上述共混液缓慢滴加到羧甲基纤维素及氧化海藻酸钠的水溶液中，600rpm下持续搅拌8h后将容器底部的复合微球分离出来，制得载药介孔材料/可降解聚酯/海藻酸盐复合微球。
68.(3)依次采用0.6n的盐酸、乙酸乙酯及乙醇、0.25％胰酶、0.2％乙二胺四乙酸二钠对骨组织进行处理及清洗冻干等得到脱细胞骨基质；取1.5g脱细胞骨基质溶于30ml含8g氧化海藻酸钠的水溶液获得凝胶状的脱细胞骨基质，再将100mg步骤(2)处理所得载药微球分散于液态脱细胞骨基质中6h，冻干获得载药微球/脱细胞骨基质复合材料。药物包封率为52％。
69.实施例3
70.本实施例提供一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料，该载药微球/脱细胞骨基质复合材料的制备方法如下：
71.(1)将3g海藻酸钠溶于200ml水与乙醇(v:v＝1:4)的混合液中，加入100mg高碘酸钠避光反应24h，随后依次加入15ml乙二醇、5g氯化钠、2l无水乙醇反应4h，过滤、冷冻干燥，获得氧化海藻酸钠。
72.(2)将0.1mg骨形态发生蛋白-2与20mg介孔硅酸钙混合得到药物与介孔硅酸钙的混合粉体，然后取上述20mg混合粉体分散于30ml含1.6g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量9万)的二氯甲烷溶液中，得到载药的介孔硅酸钙/聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配置100ml含3g聚乙烯醇1799及0.9g氧化海藻酸钠的水溶液，然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799及海藻酸钠的水溶液中，400rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得载药介孔材料/可降解聚酯/海藻酸盐复合微球。
73.(3)依次采用0.5n的盐酸、二氯甲烷及乙醇、500u/ml的dnase和rnase溶液、0.1％十二烷基硫酸钠对骨组织进行处理及清洗冻干等得到脱细胞骨基质；取4g脱细胞骨基质溶于100ml含15g氧化海藻酸钠的水溶液获得凝胶状的脱细胞骨基质，再将100mg步骤(2)处理所得载药微球分散于液态脱细胞骨基质中4h，冻干获得载药微球/脱细胞骨基质复合材料。药物包封率为70％。
74.实施例4
75.本实施例提供一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料，该载药微球/脱细胞骨基质复合材料的制备方法如下：
76.(1)将3g海藻酸钠溶于250ml水与乙醇(v:v＝1:1)的混合液中，加入90mg高碘酸钠避光反应20h，随后依次加入6ml乙二醇、2g氯化钠、1l无水乙醇反应5h，过滤、冷冻干燥，获得氧化海藻酸钠。
77.(2)将8mg白藜芦醇与20mg介孔硅酸钙混合得到药物与介孔硅酸钙的混合粉体，然
后取上述20mg混合粉体分散于40ml含1.2g聚己内酯(分子量8万)的乙酸乙酯溶液中，得到载药的介孔硅酸钙/聚己内酯共混液；配置400ml含4g明胶及0.8g氧化海藻酸钠的水溶液，然后将上述共混液缓慢滴加到明胶及氧化海藻酸钠的水溶液中，200rpm下持续搅拌8h后将容器底部的复合微球分离出来，制得载药介孔材料/可降解聚酯/海藻酸盐复合微球。
78.(3)依次采用0.6n的盐酸、乙醇及乙醇、800u/ml的dnase和rnase溶液、0.15％乙二胺四乙酸二钠对骨组织进行处理及清洗冻干等得到脱细胞骨基质；取3g脱细胞骨基质溶于120ml含30g氧化海藻酸钠的水溶液获得凝胶状的脱细胞骨基质，再将100mg步骤(2)处理所得载药微球分散于液态脱细胞骨基质中2h，冻干获得载药微球/脱细胞骨基质复合材料。药物包封率为66％。
79.实施例5
80.本实施例提供一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料，该载药微球/脱细胞骨基质复合材料的制备方法如下：
81.(1)将3g海藻酸钠溶于300ml水与乙醇(v:v＝1:4)的混合液中，加入60mg高碘酸钠避光反应16h，随后依次加入30ml乙二醇、3g氯化钠、3l无水乙醇反应4h，过滤、冷冻干燥，获得氧化海藻酸钠。
82.(2)将10mg阿仑膦酸钠与20mg介孔硅酸镁混合得到药物与介孔硅酸镁的混合粉体，然后取上述20mg混合粉体分散于15ml含1.1g聚乳酸(分子量5万)的三氯甲烷溶液中，得到载药的介孔硅酸镁/聚乳酸共混液；配置100ml含1g聚乙烯醇1788及1g氧化海藻酸钠的水溶液，然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1788及氧化海藻酸钠的水溶液中，900rpm下持续搅拌9h后将容器底部的复合微球分离出来，制得载药介孔材料/可降解聚酯/海藻酸盐复合微球。
83.(3)依次采用0.8n的盐酸、三氯甲烷及乙醇、300u/ml的dnase和rnase溶液、0.15％十二烷基硫酸钠对骨组织进行处理及清洗冻干等得到脱细胞骨基质；取2g脱细胞骨基质溶于80ml含24g氧化海藻酸钠的水溶液获得凝胶状的脱细胞骨基质，再将100mg步骤(2)处理所得载药微球分散于液态脱细胞骨基质中8h，冻干获得载药微球/脱细胞骨基质复合材料。药物包封率为68％。
84.对比试验
85.分别对实施例1～5、对比例1～3中的产品进行体外细胞毒性评价和体外药物释放性能评价。
86.体外细胞毒性评价参考gb/t 16886.5的要求进行评价和计分。
87.体外细胞毒性评价方法如下：
88.1)制备细胞悬液，计数。
89.2)在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μl，同样的样本可做3个重复。
90.3)将培养板放入培养箱中预培养一段时间(37℃,5％co2)。
91.4)向培养板各孔中加入不同组别材料的浸提液(m
材料
：v
培养基
＝1:1)。
92.5)将培养板放入培养箱中孵育一段时间，在第5d用显微镜检测其生长状态。
93.6)依据标准中细胞毒性方法进行计分。
94.计分标准为：
[0095][0096]
体外药物释放性能评价方法如下：在37℃、60rpm条件下，在恒温摇床中将500mg的产品浸渍在200ml pbs(ph＝7.4)中，定期收集测试液，并补充等量的pbs，将收集的测试液用高效液相色谱法(hplc)测定治疗剂的含量，与产品中治疗剂的负载总量进行比较，计算得到治疗剂的累积释放率。
[0097]
其中，对比例1～3的设置如下：
[0098]
对比例1
[0099]
本对比例提供一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料，该载药微球/脱细胞骨基质复合材料与实施例3的区别在于，不包含介孔材料。具体制备方法如下：
[0100]
(1)将3g海藻酸钠溶于200ml水与乙醇(v:v＝1:4)的混合液中，加入100mg高碘酸钠避光反应24h，随后依次加入15ml乙二醇、5g氯化钠、2l无水乙醇反应4h，过滤、冷冻干燥，获得氧化海藻酸钠。
[0101]
(2)将0.1mg骨形态发生蛋白-2分散于30ml含1.6g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量9万)的二氯甲烷溶液中，得到载药的聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配置100ml含3g聚乙烯醇1799及0.9g氧化海藻酸钠的水溶液，然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799及海藻酸钠的水溶液中，400rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得载药可降解聚酯/海藻酸盐复合微球。
[0102]
(3)依次采用0.5n的盐酸、二氯甲烷及乙醇、500u/ml的dnase和rnase溶液、0.1％十二烷基硫酸钠对骨组织进行处理及清洗冻干等得到脱细胞骨基质；取4g脱细胞骨基质溶于100ml含15g氧化海藻酸钠的水溶液获得凝胶状的脱细胞骨基质，再将100mg步骤(2)处理所得载药微球分散于液态脱细胞骨基质中4h，冻干获得载药微球/脱细胞骨基质复合材料。
[0103]
对比例2
[0104]
本对比例提供一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料，该载药微球/脱细胞骨基质复合材料与实施例3的区别在于，不包含氧化海藻酸钠，具体制备方法如下：
[0105]
(1)将0.1mg骨形态发生蛋白-2与20mg介孔硅酸钙混合得到药物与介孔硅酸钙的混合粉体，然后取上述20mg混合粉体分散于30ml含1.6g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量9万)的二氯甲烷溶液中，得到载药的介孔硅酸钙/聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配置100ml含3g聚乙烯醇1799的水溶液，然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799的水溶液中，400rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得载药介孔材料/可降解聚酯复合微球。
[0106]
(2)依次采用0.5n的盐酸、二氯甲烷及乙醇、500u/ml的dnase和rnase溶液、0.1％十二烷基硫酸钠对骨组织进行处理及清洗冻干等得到脱细胞骨基质；取4g脱细胞骨基质溶于100ml水溶液获得凝胶状的脱细胞骨基质，再将100mg步骤(2)处理所得载药微球分散于
液态脱细胞骨基质中4h，冻干获得载药微球/骨脱细胞骨基质复合材料。
[0107]
对比例3
[0108]
本对比例提供一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料，该载药微球/脱细胞骨基质复合材料与实施例3的区别在于，不包含介孔材料和氧化海藻酸钠，具体制备方法如下：
[0109]
(1)将0.1mg骨形态发生蛋白-2分散于30ml含1.6g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：9万)的二氯甲烷溶液中，得到载药的聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配置100ml含3g聚乙烯醇1799的水溶液，然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799的水溶液中，400rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得载药可降解聚酯复合微球。
[0110]
(2)依次采用0.5n的盐酸、二氯甲烷及乙醇、500u/ml的dnase和rnase溶液、0.1％十二烷基硫酸钠对骨组织进行处理及清洗冻干等得到脱细胞骨基质；取4g脱细胞骨基质溶于100ml水溶液获得凝胶状的脱细胞骨基质，再将100mg步骤(2)处理所得载药微球分散于液态脱细胞骨基质中4h，冻干获得载药微球/脱细胞骨基质复合材料。
[0111]
表1.体外细胞毒性评价结果
[0112][0113]
体外细胞毒性评价的结果见表1，从表中可以看出，本技术中所提供的制备方法制得的载药微球/脱细胞骨基质复合材料均无细胞毒性。
[0114]
体外药物释放性能检测结果见图1和图2，实施例3与对比例1、2、3都是装载骨形态发生蛋白-2的载药微球/脱细胞骨基质复合材料；但对比例1中不包含介孔材料，对比例2中不包含氧化海藻酸钠，对比例3中不包含介孔材料和氧化海藻酸钠。从图2可以看出，与实施例3相比，对比例1缺少介孔材料对药物的预装载和控制释放作用，药物释放速率显著增加、突释增大；对比例2缺少氧化海藻酸钠对微球的预包裹及对脱细胞骨基质的交联，但仍存在介孔材料对药物的预装载和控制释放作用，因此，药物的释放速率介于实施例3和对比例1，突释相对对比例1较小；对比例3既缺少介孔材料对药物的预装载和控制释放作用，也缺少氧化海藻酸钠对微球的预包裹及对脱细胞骨基质的交联，药物的突释最大、且释放速率最快、释放周期最短。相较于对比例1，实施例3在28天内的释放量减少了对比例1的75％，说明复合材料的药物缓释作用更好。
[0115]
图3是实施例3的载药微球形貌，微球的整体粒径在100μm左右，且为多孔结构，利于载药和药物缓释。图4是实施例3的载药微球/脱细胞骨基质复合材料整体形貌，材料整体在宏观上仍然呈现多孔结构，并且有部分微球变形后附着在材料表面，这种结构有利于细胞的长入。图5是实施例3的载药微球/脱细胞骨基质复合材料的细胞粘附情况，白色区域代表活细胞，由图可知，该材料有着良好的细胞活性，且细胞长势良好。
[0116]
综合上述结果可以看出，本技术实施例所要求保护的载药微球/脱细胞骨基质复合材料将介孔材料、氨基化可降解聚酯和脱细胞骨基质复合后，可以1)保持良好的生物相容性，2)赋予材料中所负载药物良好的缓控释功能，使之更适于修复和再生组织，也更加适用于组织缺损、细菌感染、炎症等疾病的治疗。
[0117]
上面结合附图对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在
所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料，其特征在于，主要包括载药微球和脱细胞骨基质；所述载药微球包括治疗剂、负载治疗剂的介孔材料、包覆所述介孔材料的氨基化可降解聚酯、包覆所述介孔材料和氨基化可降解聚酯的氧化海藻酸钠。2.根据权利要求1所述的载药微球/脱细胞骨基质复合材料，其特征在于，所述介孔材料为介孔硅酸钙、介孔硅酸镁、介孔硅酸钙镁、介孔硅酸锌、介孔硅酸铜中的一种或其组合物；所述介孔材料的平均孔径为2～30nm，比表面积为70～1000m2/g；所述氧化海藻酸钠是指通过处理后具有醛基的海藻酸钠。3.根据权利要求1所述的载药微球/脱细胞骨基质复合材料，其特征在于，所述氨基化可降解聚酯是指通过改性后带有氨基的可降解聚酯，氨基化可降解聚酯选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚3-羟基烷酸酯、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)、聚三亚甲基碳酸酯、聚丁二酸丁二酯中的至少一种；所述氨基化可降解聚酯的分子量为2～15万道尔顿。4.根据权利要求1所述的载药微球/脱细胞骨基质复合材料，其特征在于，所述治疗剂为骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-7、血管内皮生长因子、阿仑膦酸钠、柚皮甙、白藜芦醇中的至少一种；所述载药微球/脱细胞骨基质复合材料的治疗剂包封率为40％～70％。5.根据权利要求1所述的载药微球/脱细胞骨基质复合材料，其特征在于，所述载药微球的粒径为0.01～2mm。6.权利要求1所述的载药微球/脱细胞骨基质复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、首先对海藻酸钠进行氧化改性；使用介孔材料装载治疗剂，氨基化可降解聚酯溶于有机溶剂得到氨基化可降解聚酯溶液，再将装载治疗剂的介孔材料与氨基化可降解聚酯溶液混合，加入到含乳化剂和氧化海藻酸钠的水溶液中持续搅拌，制得负载治疗剂的介孔材料/氨基化可降解聚酯/氧化海藻酸钠复合微球，即载药微球；s2、对骨组织进行处理得到脱细胞骨基质，溶解于含氧化海藻酸钠的水溶液后获得凝胶状氧化海藻酸钠和脱细胞骨基质；将步骤s1所得载药微球分散于含氧化海藻酸钠和脱细胞骨基质的水溶液中反应，冷冻干燥，获得载药微球/脱细胞骨基质复合材料。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，治疗剂与介孔材料的质量比为1:(2～200)；装载治疗剂的介孔材料与氨基化可降解聚酯的质量比为1:(20-80)；氨基化可降解聚酯溶液中氨基化可降解聚酯与有机溶剂的质量体积比为(0.03～0.08):1g/ml；氨基化可降解聚酯溶液与含乳化剂和氧化海藻酸钠的水溶液的体积比为(1～3):10；含乳化剂和氧化海藻酸钠的水溶液中乳化剂、氧化海藻酸钠与水溶液的质量体积比为：(0.2～3):(0.2～1):100g/g/ml。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述化学试剂是乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫酸钠、曲拉通中的一种或其组合；酶是胰酶、dnase、rnase中的一种或其组合。9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s1处理所得载药微球与含氧化海藻酸钠溶液的质量体积比为1:(300～2000)g/ml；含氧化海藻酸钠和脱细胞骨基质的水溶液中氧化海藻酸钠的质量浓度为5％～30％；含氧化海藻酸钠和脱细胞骨基质的水溶液中脱细胞骨基质的质量浓度为0.5％～5％；所述反应时间为2～10h。
10.权利要求1～5任一项所述的载药微球/脱细胞骨基质复合材料或权利要求6～9任一项所述制备方法制备得到的载药微球/脱细胞骨基质复合材料作为组织修复与再生材料或疾病治疗材料的应用。

技术总结
本申请公开了一种载药微球/脱细胞骨基质复合材料及其制备方法和应用。该复合材料主要包括载药微球和脱细胞骨基质；所述载药微球包括负载治疗剂的介孔材料、包覆所述介孔材料的氨基化可降解聚酯、包覆所述介孔材料和氨基化可降解聚酯的氧化海藻酸钠。本申请实施例的载药微球/脱细胞骨基质复合材料，至少具有如下有益效果：本申请所提供的载药微球/脱细胞骨基质复合材料将介孔材料和氨基化可降解聚酯作为载药微球的基体材料，并和脱细胞骨基质结合使用，使得载药微球/脱细胞骨基质复合材料同时具有良好的药物缓释效果和生物活性，药物控释能力更加可调。控释能力更加可调。控释能力更加可调。


技术研发人员：叶建东 党兆晖 许为康
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/9/14