一种靶向肺血管内皮细胞治疗矽肺纤维化的方法及应用

1.本发明涉及一种靶向肺血管内皮细胞治疗矽肺纤维化的方法及应用。


背景技术：

2.矽肺是以肺组织弥漫性纤维化为主的疾病。目前矽肺的发病机制尚不明确且临床上缺乏有效的治疗措施来逆转尘肺纤维化病变或减缓病变的进展。因此，寻找有效治疗肺纤维化的药物是尘肺治疗的迫切需要。腺相关病毒(raav)由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点被视为是最有前途的基因治疗手段，在世界范围内得到广泛应用。有研究表明，aav9在血管内皮细胞的分布和蛋白表达方面更具优势。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,hgf)，是一种刺激肝细胞增殖的促有丝分裂因子，是目前已知最强烈的肝细胞增殖刺激因子。其在许多组织中局部表达，包括肺、肾和肝脏并可以促进正常组织再生，防止肺、心、肾和肝的纤维化重塑。hgf在调节炎症反应和伤口修复能力，减轻刺激诱导的上皮间质转化和ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡，以及抑制肌成纤维细胞分化和细胞外基质的产生中起关键作用。同时，在纤维化的发展和/或进展过程中的表达与hgf的表达呈负相关。因此，在肺纤维化疾病的发生发展过程中，hgf发挥了重要作用，并且可作为一个潜在的治疗靶点。
3.如何提供一种利用腺相关病毒9靶向肺血管内皮细胞过表达hgf治疗矽肺纤维化成为研究方向。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种靶向肺血管内皮细胞治疗矽肺纤维化的方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种靶向肺血管内皮细胞治疗矽肺纤维化的方法及应用，具体包括以下步骤：
6.1)确定hgf基因序列，构建hgf腺相关病毒骨架质粒：ncbi查找野生型小鼠hgf基因序列(hgf,nm_001289458)，根据查找的基因序列设计并合成基因扩增引物(过表达基因序列见表1)；目的基因两端设计有xhoⅰ连接位点；将扩增得到的野生型小鼠hgf基因片段使用dna ligase连接至paav-itr-cmv质粒上获得paav-itr-cmv-aav9-hgf腺相关病毒骨架质粒，质粒上带有绿色荧光标记基因(图1)；将paav-itr-cmv-aav9-hgf质粒与解冻后的dh5α感受态细胞混匀冰浴30min，42℃水浴60s，冰浴2min，加入不含抗生素的lb培养基37℃摇床震荡45min后于含抗生素的lb培养基上37℃培养12h；筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，xhoⅰ酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆进行测序，测序引物见表2；
7.2)paav-itr-cmv-aav9-hgf腺相关病毒包装：病毒包装前将3-5
×
106个293ft细胞传代接种，培养16h-24h；按照cpt高效转染试剂盒说明书，将含有paav-itr-cmv-aav9-hgf的转染体系均匀加入接种293ft细胞的培养皿中，轻微水平震荡培养皿以混匀培养6h，将培养基更换为37℃水浴预热的新鲜完全培养基；转染72h后，观察荧光并拍照，判断转染效率
并收集细胞；收集的细胞用pbs重悬，反复冻融裂解细胞，细胞裂解液中加入全能核酸酶处理半小时，随后15000rpm离心30min，取上清；细胞裂解液上清经过碘克沙醇梯度高速离心，得到初步纯化的腺相关病毒，pbs超滤除去碘克沙醇得到最终纯化的病毒液；
8.3)paav-itr-cmv-aav9-hgf病毒滴度测定：取6μl纯化后的重组腺相关病毒，去除dna污染并裂解病毒得到其基因组dna；然后进行qrt-pcr检测，检测对象为腺相关病毒载体上的wpre序列，上游引物为f:5
’‑
ccgtttcaggcaacgtg-3’；r:5
’‑
agctgacaggtggtggcaat-3’；paav-egfp质粒做10、102、103、104和105稀释后做标准曲线；qrt-pcr反应体系为20μl：2
×
taq master mix10μl，上下游引物为10μmol/l各0.8μl，2μl纯化的病毒液，ddh2o补足至20μl；反应条件为95℃
9.30s、95℃5s、60℃34s，40个循环；每个样品设定3个重复测定管；根据标准曲线计算病毒滴度；
10.4)小鼠矽肺模型制备及分组：spf级6-8周龄c57bl/6小鼠48只，体重为20-24g，采用随机数字按体重将小鼠分为6组，分别为saline组、sio2组、sio2+aav-hgf组和sio2+aav-control组，每组6只；在通风橱中使用异氟烷麻醉机将小鼠麻醉，外接麻醉呼吸机；暴露小鼠气管后，对照组气管注射0.1ml的生理盐水，二氧化硅组气管注射200mg/ml的二氧化硅悬浊液0.1ml，按摩小鼠胸部，使液体能够肺部均匀分布，缝合皮肤后密切观察小鼠生存状况；
11.5)实验动物模型制备：sio2+aav-hgf组与sio2+aav-control组在小鼠矽肺模型手术后12h通过颈静脉分别注射aav-hgf与aav-egfp病毒，每只小鼠注射病毒为3.21
×
10
11
vg；小鼠术后28天，0.3ml10％水合氯醛腹腔注射麻醉处死小鼠，右肺下叶进行oct包埋，右中叶用4％多聚甲醛固定，其余肺组织保存于-80℃冰箱，用于后续实验；
12.6)h&e染色：
13.①
脱蜡：将石蜡切片浸于二甲苯ⅰ15min，二甲苯ⅱ5min；
14.②
水化：100％酒精3min
×
2次，95％、85％、75％梯度酒精3min
×
1次，蒸馏水摇床洗3min
×
2次；
15.③
苏木素染色：苏木素染液滴于切片上染色5min，蒸馏水冲洗30s；
16.④
1％盐酸乙醇分化5s；
17.⑤
伊红染色：伊红染液8min，蒸馏水冲洗5s；
18.⑥
脱水：依次浸入75％、85％、95％梯度酒精，每种浓度酒精3s
×
1次，100％酒精30s
×
2次；
19.⑦
透明：二甲苯溶液3min
×
2次；
20.⑧
封片：中性树脂封片后于光镜下观察；
21.7)天狼星红染色：
22.①
脱蜡水化同上；
②
天狼星红染液滴染1h，蒸馏水摇床洗5次，2min/次；
③
脱水、透明、封片同上；
23.8)masson染色：
24.①
脱蜡水化同上；
25.②
将配制好的weigert染色液滴于石蜡切片上染色5min；
26.③
盐酸乙醇分化液滴染10s，使用自来水流水冲洗1min；
27.④
使用masson蓝化液滴染5min，蒸馏水摇床清洗2次，3min/次；
lab软件进行蛋白分析；
58.12)实时荧光定量pcr：采用小鼠肺组织,提取总rna,测定浓度后进行反转录,加入扩增反应体系运用qrt-pcr法扩增,扩增引物序列见表3,反应结束后可得样品ct值，采用2-δδct法计算目的基因的相对表达水平；
59.13)统计学方法：数据分析采用用spss25.0软件，作图使用graphpad8.0软件；实验数据以x
±
s表示，多组间的数据比较采用单因素方差(one-way anova)分析，进一步进行组间两两比较时，采用snk-q检验；以p＜0.05为差异有统计学意义。
60.本发明优点在于：提供了一种利用腺相关病毒9靶向肺血管内皮细胞治疗矽肺纤维化的方法，利用aav9腺相关病毒优势过表达hgf建立靶向矽肺血管内皮细胞矽肺纤维化药物，对于肺纤维化疾病的治疗具有重要临床应用价值。
附图说明
61.图1是paav-itr-cmv-aav9-hgf过表达质粒酶切鉴定图。
62.图2是paav-itr-cmv-aav9-hgf过表达质粒测序图。
63.图3是paav-itr-cmv-aav9-hgf质粒转染293ft细胞图；[注]a:转染72h后白光图；b:转染72h后荧光图；比例尺：100μm。
[0064]
图4是各组小鼠肺组织中hgf蛋白相对表达含量图(n＝6)；[注]**:p《0.01。
[0065]
图5是各组小鼠肺组织病理学染色图像(he染色masson染色sirius red染色)(n＝6)。
[0066]
图6是各组小鼠肺组织纤维化指标表达情况(n＝6)。
[0067]
图7是各组小鼠肺组织冰冻切片免疫荧光染色图像1(n＝6)。
[0068]
图8是各组小鼠肺组织冰冻切片免疫荧光染色图像2(n＝6)。
[0069]
图9是paav-itr-cmv-aav9-hgf过表达质粒图谱。
具体实施方式
[0070]
下面用具体实施例说明本发明，并不是对本发明的限制。
[0071]
实施例
[0072]
利用腺相关病毒9靶向肺血管内皮细胞治疗矽肺纤维化的药物及其应用的建立方法，具体包括以下步骤：
[0073]
1)确定hgf基因序列，构建hgf腺相关病毒骨架质粒：ncbi查找野生型小鼠hgf基因序列(hgf,nm_001289458)，根据查找的基因序列设计并合成基因扩增引物(过表达基因序列见表1)；目的基因两端设计有xhoⅰ连接位点；将扩增得到的野生型小鼠hgf基因片段使用dna ligase连接至paav-itr-cmv质粒上获得paav-itr-cmv-aav9-hgf腺相关病毒骨架质粒，质粒上带有绿色荧光标记基因(图1)；将paav-itr-cmv-aav9-hgf质粒与解冻后的dh5α感受态细胞混匀冰浴30min，42℃水浴60s，冰浴2min，加入不含抗生素的lb培养基37℃摇床震荡45min后于含抗生素的lb培养基上37℃培养12h；筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，xhoⅰ酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆进行测序，测序引物见表2；
[0074]
表1过表达基因序列
[0075][0076][0077]
表2rt-qpcr扩增引物序列
[0078][0079]
2)paav-itr-cmv-aav9-hgf腺相关病毒包装：病毒包装前将3-5
×
106个293ft细胞传代接种，培养16h-24h；按照cpt高效转染试剂盒说明书，将含有paav-itr-cmv-aav9-hgf的转染体系均匀加入接种293ft细胞的培养皿中，轻微水平震荡培养皿以混匀培养6h，将培养基更换为37℃水浴预热的新鲜完全培养基；转染72h后，观察荧光并拍照，判断转染效率并收集细胞；收集的细胞用pbs重悬，反复冻融裂解细胞，细胞裂解液中加入全能核酸酶处理半小时，随后15000rpm离心30min，取上清；细胞裂解液上清经过碘克沙醇梯度高速离心，得到初步纯化的腺相关病毒，pbs超滤除去碘克沙醇得到最终纯化的病毒液；
[0080]
3)paav-itr-cmv-aav9-hgf病毒滴度测定：取6μl纯化后的重组腺相关病毒，去除dna污染并裂解病毒得到其基因组dna；然后进行qrt-pcr检测，检测对象为腺相关病毒载体上的wpre序列，上游引物为f:5
’‑
ccgtttcaggcaacgtg-3’；r:5
’‑
agctgacaggtggtggcaat-3’；paav-egfp质粒做10、102、103、104和105稀释后做标准曲线；qrt-pcr反应体系为20μl：2
×
taq master mix10μl，上下游引物为10μmol/l各0.8μl，2μl纯化的病毒液，ddh2o补足至20μl；反应条件为95℃
[0081]
30s、95℃5s、60℃34s，40个循环；每个样品设定3个重复测定管；根据标准曲线计算病毒滴度；
[0082]
4)小鼠矽肺模型制备：spf级6-8周龄c57bl/6小鼠48只，体重为20-24g，采用随机数字按体重将小鼠分为6组，在通风橱中使用异氟烷麻醉机将小鼠麻醉，外接麻醉呼吸机；暴露小鼠气管后，对照组气管注射0.1ml的生理盐水，二氧化硅组气管注射200mg/ml的二氧化硅悬浊液0.1ml，按摩小鼠胸部，使液体能够肺部均匀分布，缝合皮肤后密切观察小鼠生存状况；sio2+aav-hgf组与sio2+aav-control组在小鼠矽肺模型手术后12h通过颈静脉分别注射aav-hgf与aav-egfp病毒，每只小鼠注射病毒为3.21
×
10
11
vg；小鼠术后28天，0.3ml10％水合氯醛腹腔注射麻醉处死小鼠，右肺下叶进行oct包埋，右中叶用4％多聚甲醛固定，其余肺组织保存于-80℃冰箱，用于后续实验；
[0083]
5)h&e染色：
[0084]
①
脱蜡：将石蜡切片浸于二甲苯ⅰ15min，二甲苯ⅱ5min；
[0085]
②
水化：100％酒精3min
×
2次，95％、85％、75％梯度酒精3min
×
1次，蒸馏水摇床洗3min
×
2次；
[0086]
③
苏木素染色：苏木素染液滴于切片上染色5min，蒸馏水冲洗30s；
[0087]
④
1％盐酸乙醇分化5s；
[0088]
⑤
伊红染色：伊红染液8min，蒸馏水冲洗5s；
[0089]
⑥
脱水：依次浸入75％、85％、95％梯度酒精，每种浓度酒精3s
×
1次，100％酒精
30s
×
2次；
[0090]
⑦
透明：二甲苯溶液3min
×
2次；
[0091]
⑧
封片：中性树脂封片后于光镜下观察；
[0092]
6)天狼星红染色：
[0093]
①
脱蜡水化同上；
②
天狼星红染液滴染1h，蒸馏水摇床洗5次，2min/次；
③
脱水、透明、封片同上；
[0094]
7)masson染色：
[0095]
①
脱蜡水化同上；
[0096]
②
将配制好的weigert染色液滴于石蜡切片上染色5min；
[0097]
③
盐酸乙醇分化液滴染10s，使用自来水流水冲洗1min；
[0098]
④
使用masson蓝化液滴染5min，蒸馏水摇床清洗2次，3min/次；
[0099]
⑤
使用丽春红染液滴染3min，蒸馏水摇床清洗3次，2min/次；
[0100]
⑥
使用磷钼酸溶液滴染7min，蒸馏水摇床清洗2min；
[0101]
⑦
使用苯胺蓝溶液滴染15min，蒸馏水摇床清洗2min；
[0102]
⑧
使用弱酸工作液滴染1min，自来水流水冲洗1min；
[0103]
⑨
脱水、透明、封片同上；
[0104]
8)羟脯氨酸含量测定：
[0105]
①
称取小鼠肺组织30mg放入离心管中使用组织匀浆仪破碎，加入水解液1ml，混匀，放入95℃水浴锅中20min；
[0106]
②
将各离心管流水冷却后加入ph指示剂并将ph调整至6.0-6.8左右；
[0107]
③
离心管中加蒸馏水至10ml并混匀；
[0108]
④
取3-4ml稀释的水解液加适量活性炭混匀，3500转/min离心10min，取上清1ml后续检测；
[0109]
⑤
依照说明书依次加入试剂，混匀后60℃水浴15min，冷却后3500转/min离心10min；
[0110]
⑥
离心后取上清液于波长550nm处测定各管吸光度，依照说明书计算羟脯氨酸含量；
[0111]
9)免疫荧光：
[0112]
①
冰冻切片从-80℃取出置于暗盒中，待其恢复至室温；
[0113]
②
使用4％多聚甲醛溶液固定15min，pbs溶液摇床清洗5min；
[0114]
③
免疫组化笔于组织周围画圈；
[0115]
④
0.3％triton-x100孵育打孔20min，pbs溶液摇床清洗3次，3min/次；
[0116]
⑤
5％牛血清白蛋白封闭30min；
[0117]
⑥
一抗按1：100比例稀释后滴于组织上，4℃过夜孵育；
[0118]
⑦
冰箱取出切片，待其回温后pbs溶液摇床清洗5次，3min/次；
[0119]
⑧
二抗按照1：200比例稀释后滴于组织上，37℃温箱孵育2h，pbs溶液摇床清洗5次，3min/次；
[0120]
⑨
滴加dapi溶液孵育5min，pbs溶液摇床清洗5次，3min/次；
[0121]
⑩
擦干切片上残留液体，滴加抗荧光猝灭剂后封片，于激光共聚焦显微镜下观察；
[0122]
10)western blot：
[0123]
①
将提取的蛋白与5
×
loading buffer按照4:1比例混合，95℃金属浴5min使蛋白变性；
[0124]
②
电泳与电转：用sds-page凝胶电泳，每孔准确加入30μg总蛋白，浓缩胶电压条件恒压80v，蛋白跑至分离胶后转恒压120v，恒流0.3a湿式转入聚偏二氟乙烯(pvdf)膜中；
[0125]
③
封闭：pvdf膜放入5％脱脂牛奶中封闭2h；
[0126]
④
一抗孵育：按照1:1000比例稀释一抗，将pvdf膜放入一抗中4℃过夜；使用pbst摇床漂洗5min
×
3次；
[0127]
⑤
二抗孵育：按照1:3000比例稀释二抗，根据一抗种属加入相应二抗，室温孵育2h，使用pbst漂洗10min
×
3次；
[0128]
⑥
显影：pvdf膜浸入ecl试剂中4-5s后全自动化学发光检测仪拍照；使用image lab软件进行蛋白分析；
[0129]
11)实时荧光定量pcr：采用小鼠肺组织,提取总rna,测定浓度后进行反转录,加入扩增反应体系运用qrt-pcr法扩增,扩增引物序列见表3,反应结束后可得样品ct值，采用2-δδct法计算目的基因的相对表达水平；
[0130]
表3所用引物序列
[0131][0132]
12)统计学方法：数据分析采用用spss25.0软件，作图使用graphpad8.0软件；实验数据以x
±
s表示，多组间的数据比较采用单因素方差(one-way anova)分析，进一步进行组间两两比较时，采用snk-q检验；以p＜0.05为差异有统计学意义。
[0133]
本发明的研究结果如下：
[0134]
1.paav-itr-cmv-aav9-hgf质粒酶切鉴定
[0135]
利用pcr获取hgf的目的基因，与paav-itr-cmv质粒xhoⅰ单酶切产物相连接构建形成重组质粒paav-itr-cmv-aav9-hgf进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示分别在2.5kb和5.0kb附近有单一的目的条带，产物片段大小与预期大小一致(图1)。测序结果与设计序列一致(图2)，证明病毒载体构建成功。
[0136]
2.paav-itr-cmv-aav9-hgf病毒包装纯化及滴度检测
[0137]
paav-itr-cmv-aav9-hgf转染体系与293ft细胞共培养后，倒置显微镜下观察显示
细胞生长状态良好，胞浆透亮，胞核隐约可见。荧光倒置显微镜下观察到293ft细胞发绿色荧光，表明腺相关病毒包装成功(图3)。纯化后使用pcr法测定aav9-hgf病毒滴度为5.22
×
10
12
vg/ml，可以满足接下来的体内外实验需求。
[0138]
3.小鼠肺组织中hgf蛋白的表达
[0139]
通过颈静脉注射给予小鼠paav-itr-cmv-aav9-hgf过表达病毒后，通过western blot检测发现小鼠肺组织中过表达组hgf蛋白相对表达水平(1.60
±
0.21)较生理盐水组(0.45
±
0.13)或阴性对照组(0.69
±
0.24)显著升高，差异具有统计学意义(p《0.01)(图5)。表明我们构建的病毒载体在动物肺组织中高表达hgf。
[0140]
4.he染色结果显示：sio2+aav-hgf组小鼠矽肺纤维化程度减轻，而sio2+aav-control组小鼠细胞外基质增多，肺泡破坏程度与sio2组相似；masson染色与天狼猩红染色结果显示：sio2+aav-hgf组小鼠肺组织胶原纤维含量明显减少，病理改变轻于sio2组，而sio2+aav-control组仍存在矽结节；羟脯氨酸含量检测结果表明：sio2+aav-hgf组小鼠羟脯氨酸含量较sio2组与sio2+aav-control组显著降低，差异具有统计学意义(p《0.05)。
[0141]
5.western blot实验结果显示：sio2+aav-hgf组小鼠肺组织α-sma、collagen
‑ⅰ
及tgf-β蛋白较sio2组及sio2+aav-control组小鼠均表达减少(p《0.05)；qrt-pcr结果显示：sio2+aav-hgf组小鼠α-sma、collagen
‑ⅰ
及tgf-βmrna表达水平较sio2组及sio2+aav-control组小鼠表达降低(p《0.05)。
[0142]
6.免疫荧光结果显示：sio2+aav-hgf组小鼠肺血管内皮细胞中hgf蛋白较sio2组小鼠荧光强度增加，tgf-β蛋白荧光强度降低。
[0143]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种靶向肺血管内皮细胞治疗矽肺纤维化的方法及应用，其特征在于，具体包括以下步骤：1)确定hgf基因序列，构建hgf腺相关病毒骨架质粒：ncbi查找野生型小鼠hgf基因序列(hgf,nm_001289458)，根据查找的基因序列设计并合成基因扩增引物(过表达基因序列见表1)；目的基因两端设计有xhoⅰ连接位点；将扩增得到的野生型小鼠hgf基因片段使用dna ligase连接至paav-itr-cmv质粒上获得paav-itr-cmv-aav9-hgf腺相关病毒骨架质粒，质粒上带有绿色荧光标记基因(图1)；将paav-itr-cmv-aav9-hgf质粒与解冻后的dh5α感受态细胞混匀冰浴30min，42℃水浴60s，冰浴2min，加入不含抗生素的lb培养基37℃摇床震荡45min后于含抗生素的lb培养基上37℃培养12h；筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，xhoⅰ酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆进行测序，测序引物见表2；2)paav-itr-cmv-aav9-hgf腺相关病毒包装：病毒包装前将3-5
×
106个293ft细胞传代接种，培养16h-24h；按照cpt高效转染试剂盒说明书，将含有paav-itr-cmv-aav9-hgf的转染体系均匀加入接种293ft细胞的培养皿中，轻微水平震荡培养皿以混匀培养6h，将培养基更换为37℃水浴预热的新鲜完全培养基；转染72h后，观察荧光并拍照，判断转染效率并收集细胞；收集的细胞用pbs重悬，反复冻融裂解细胞，细胞裂解液中加入全能核酸酶处理半小时，随后15000rpm离心30min，取上清；细胞裂解液上清经过碘克沙醇梯度高速离心，得到初步纯化的腺相关病毒，pbs超滤除去碘克沙醇得到最终纯化的病毒液；3)paav-itr-cmv-aav9-hgf病毒滴度测定：取6μl纯化后的重组腺相关病毒，去除dna污染并裂解病毒得到其基因组dna；然后进行qrt-pcr检测，检测对象为腺相关病毒载体上的wpre序列，上游引物为f:5
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ccgtttcaggcaacgtg-3’；r:5
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agctgacaggtggtggcaat-3’；paav-egfp质粒做10、102、103、104和105稀释后做标准曲线；qrt-pcr反应体系为20μl：2
×
taq master mix10μl，上下游引物为10μmol/l各0.8μl，2μl纯化的病毒液，ddh2o补足至20μl；反应条件为95℃30s、95℃5s、60℃34s，40个循环；每个样品设定3个重复测定管；根据标准曲线计算病毒滴度；4)实验动物分组：spf级6-8周龄c57bl/6小鼠48只，体重为20-24g，采用随机数字按体重将小鼠分为6组，分别为saline组、sio2组、sio2+aav-hgf组和sio2+aav-control组，每组6只；5)小鼠矽肺模型制备：在通风橱中使用异氟烷麻醉机将小鼠麻醉，外接麻醉呼吸机；暴露小鼠气管后，对照组气管注射0.1ml的生理盐水，二氧化硅组气管注射200mg/ml的二氧化硅悬浊液0.1ml，按摩小鼠胸部，使液体能够肺部均匀分布，缝合皮肤后密切观察小鼠生存状况；6)实验动物给药：sio2+aav-hgf组与sio2+aav-control组在小鼠矽肺模型手术后12h通过颈静脉分别注射aav-hgf与aav-egfp病毒，每只小鼠注射病毒为3.21
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vg；小鼠术后28天，0.3ml10％水合氯醛腹腔注射麻醉处死小鼠，右肺下叶进行oct包埋，右中叶用4％多聚甲醛固定，其余肺组织保存于-80℃冰箱，用于后续实验；6)h&e染色：
①
脱蜡：将石蜡切片浸于二甲苯ⅰ15min，二甲苯ⅱ5min；
②
水化：100％酒精3min
×
2次，95％、85％、75％梯度酒精3min
×
1次，蒸馏水摇床洗3min
×
2次；
③
苏木素染色：苏木素染液滴于切片上染色5min，蒸馏水冲洗30s；
④
1％盐酸乙醇分化5s；
⑤
伊红染色：伊红染液8min，蒸馏水冲洗5s；
⑥
脱水：依次浸入75％、85％、95％梯度酒精，每种浓度酒精3s
×
1次，100％酒精30s
×
2次；
⑦
透明：二甲苯溶液3min
×
2次；
⑧
封片：中性树脂封片后于光镜下观察；7)天狼星红染色：
①
脱蜡水化同上；
②
天狼星红染液滴染1h，蒸馏水摇床洗5次，2min/次；
③
脱水、透明、封片同上；8)masson染色：
①
脱蜡水化同上；
②
将配制好的weigert染色液滴于石蜡切片上染色5min；
③
盐酸乙醇分化液滴染10s，使用自来水流水冲洗1min；
④
使用masson蓝化液滴染5min，蒸馏水摇床清洗2次，3min/次；
⑤
使用丽春红染液滴染3min，蒸馏水摇床清洗3次，2min/次；
⑥
使用磷钼酸溶液滴染7min，蒸馏水摇床清洗2min；
⑦
使用苯胺蓝溶液滴染15min，蒸馏水摇床清洗2min；
⑧
使用弱酸工作液滴染1min，自来水流水冲洗1min；
⑨
脱水、透明、封片同上；9)羟脯氨酸含量测定：
①
称取小鼠肺组织30mg放入离心管中使用组织匀浆仪破碎，加入水解液1ml，混匀，放入95℃水浴锅中20min；
②
将各离心管流水冷却后加入ph指示剂并将ph调整至6.0-6.8左右；
③
离心管中加蒸馏水至10ml并混匀；
④
取3-4ml稀释的水解液加适量活性炭混匀，3500转/min离心10min，取上清1ml后续检测；
⑤
依照说明书依次加入试剂，混匀后60℃水浴15min，冷却后3500转/min离心10min；
⑥
离心后取上清液于波长550nm处测定各管吸光度，依照说明书计算羟脯氨酸含量；10)免疫荧光：
①
冰冻切片从-80℃取出置于暗盒中，待其恢复至室温；
②
使用4％多聚甲醛溶液固定15min，pbs溶液摇床清洗5min；
③
免疫组化笔于组织周围画圈；
④
0.3％triton-x100孵育打孔20min，pbs溶液摇床清洗3次，3min/次；
⑤
5％牛血清白蛋白封闭30min；
⑥
一抗按1：100比例稀释后滴于组织上，4℃过夜孵育；
⑦
冰箱取出切片，待其回温后pbs溶液摇床清洗5次，3min/次；
⑧
二抗按照1：200比例稀释后滴于组织上，37℃温箱孵育2h，pbs溶液摇床清洗5次，3min/次；
⑨
滴加dapi溶液孵育5min，pbs溶液摇床清洗5次，3min/次；
⑩
擦干切片上残留液体，滴加抗荧光猝灭剂后封片，于激光共聚焦显微镜下观察；11)western blot：
①
将提取的蛋白与5
×
loading buffer按照4:1比例混合，95℃金属浴5min使蛋白变性；
②
电泳与电转：用sds-page凝胶电泳，每孔准确加入30μg总蛋白，浓缩胶电压条件恒压80v，蛋白跑至分离胶后转恒压120v，恒流0.3a湿式转入聚偏二氟乙烯(pvdf)膜中；
③
封闭：pvdf膜放入5％脱脂牛奶中封闭2h；
④
一抗孵育：按照1:1000比例稀释一抗，将pvdf膜放入一抗中4℃过夜；使用pbst摇床漂洗5min
×
3次；
⑤
二抗孵育：按照1:3000比例稀释二抗，根据一抗种属加入相应二抗，室温孵育2h，使用pbst漂洗10min
×
3次；
⑥
显影：pvdf膜浸入ecl试剂中4-5s后全自动化学发光检测仪拍照；使用image lab软件进行蛋白分析；12)实时荧光定量pcr：采用小鼠肺组织,提取总rna,测定浓度后进行反转录,加入扩增反应体系运用qrt-pcr法扩增,扩增引物序列见表3,反应结束后可得样品ct值，采用2-δδct法计算目的基因的相对表达水平；13)统计学方法：数据分析采用用spss25.0软件，作图使用graphpad8.0软件；实验数据以x
±
s表示，多组间的数据比较采用单因素方差(one-way anova)分析，进一步进行组间两两比较时，采用snk-q检验；以p＜0.05为差异有统计学意义。

技术总结
本发明涉及一种靶向肺血管内皮细胞治疗矽肺纤维化的方法及应用，具体包括以下步骤：确定HGF基因序列，构建HGF腺相关病毒骨架质粒；pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF腺相关病毒包装及滴度测定；小鼠矽肺模型制备；H&E染色；天狼星红染色；Masson染色；羟脯氨酸含量测定；免疫荧光；Western Blot；统计学方法。本发明优点在于：提供了一种利用腺相关病毒9靶向肺血管内皮细胞治疗矽肺纤维化的方法，利用AAV9腺相关病毒优势过表达HGF建立靶向矽肺血管内皮细胞矽肺纤维化药物，对于肺纤维化疾病的治疗具有重要临床应用价值。重要临床应用价值。重要临床应用价值。


技术研发人员：杨安宁 孙岳 姜怡邓 刘志宏 陈聪 王秋实 宝瑞 张鸿文
受保护的技术使用者：宁夏医科大学
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/9/14