一种可防治棉花黄萎病且耐高温可固氮解磷的沙雷氏菌L5的制备与应用

一种可防治棉花黄萎病且耐高温可固氮解磷的沙雷氏菌l5的制备与应用
技术领域
1.本发明属于生物防治植物病害技术领域，具体涉及一种可防治棉花黄萎病且耐高温可固氮解磷的沙雷氏菌l5的制备与应用。


背景技术：

2.棉花是我国重要的经济作物，我国播种面积约 333.3万 hm2，年产量500多万吨，经济总值近400亿元。棉花黄萎病（verticillium wilt）在我国各大产棉区呈发展态势，黄萎病流行的棉田面积达到了200万 hm2，导致棉田常年减产15%~20%，造成的经济损失高达数十亿元，严重危及我国棉花产业的可持续发展。大丽轮枝菌（v .dahliae kleb）为我国棉花黄萎病的主要病原真菌。大丽轮枝菌的分生孢子能刺激棉花植株薄壁细胞产生胶状分泌物，阻断棉花运输通道，阻断营养和水分的运输，引起棉花植株萎蔫和大量叶片萎蔫脱落。
3.目前，国内外对棉花黄萎病的防治主要是采用轮作倒茬、选育抗病品种、化学防治等传统手段，但防病效果都不理想，这些方法均有一定的限制和不足之处，操作性、适应性差或者效果不理想。黄萎病微菌核在土壤中存活时间久、寄主多、非寄主作物经济价值低，轮作并不减少土壤中微菌核数量；黄萎病菌致病力变异大，抗性品种不易获得，或者获得后容易丧失。化学农药虽然在一定程度上可以减轻黄萎病对棉花的危害，但是农药的使用带来的环境问题也越来越受到社会的广泛关注。生物防治是利用农业生态系中自然界有益生物对有害生物的自然控制，植物病害的生物防治由于其安全、有效、低毒、残留少越来越引起人们的重视。生物防治被认为是最具有发展潜力的防治方法。
4.生防菌通过竞争作用、拮抗作用和诱导系统抗性等机制发挥生物防治效果，且常常是多种机制共同起作用，用于防治棉花黄萎病的生防微生物的种类很多，生防细菌己成为近年来生防菌剂研制开发的热点。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述问题，提供一种菌株易培养、对大丽轮枝菌的防治效果高、对环境污染小、且耐高温、并有固氮解磷功效等益处的的可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌的serratia sp. l5菌株的制备与应用。
6.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：本发明所提供的菌株为沙雷氏菌l5（serratia sp. l5），是从河南天冠有限公司提供的厌氧废弃物
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沼渣中筛选到的沙雷氏菌属，已于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：湖北省武汉市武昌区八一路229号武汉大学校内），保藏编号：cctcc m 20221083。其具有以下生物学特性：在lb平板培养基上菌落呈红色，圆形，光滑湿润，边缘较整齐；经革兰氏染色后置于光学显微镜下观察，菌株l5菌体呈短杆状， 革兰氏阴性菌。经 16s rrna 基因序列测定、与genbank 数据库中已收录的其他相似序列进行核酸序列同源性比较，结果表明 l5 与serratia marcescens atcc 13889相似度最高（98.19%）。该菌株
具有耐高温、拮抗大丽轮枝菌，防治棉花黄萎病、固氮、解磷的功能。
7.l5菌株的分离方法为：取河南天冠有限公司提供的厌氧废弃物
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沼渣5g，加入到含有100ml无菌水的三角瓶中于37℃、200rpm摇床中培养12h，于超净工作台中取1ml上清液稀释涂布到lb固体培养基中，于45℃恒温箱培养12h，然后用接种环挑出不同的单菌落转接于lb固体平板进行纯化用于后续的生物活性测试，由此筛选得到菌株l5。
8.本发明提供了l5菌株的培养方法：（1）试管种培养lb液体培养基配方为：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，余下为水。
9.将l5菌接种到上述培养基上，37℃下培养12h，获得试管种。
10.（2）液体扩大培养lb液体培养基配方为：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，余下为水。
11.将上述试管种培养所得试管种接种到500ml三角瓶lb液体培养基中，每瓶装200ml，于37℃下摇床培养12h，转速为200rpm。
12.（3）平皿接种培养lb固体培养基配方为：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，1.5-2%琼脂。
13.将上述液体扩大培养所得l5沙雷氏菌菌体接种到lb固体培养基上，37℃下培养12h，获得平皿菌种。
14.本发明提供了大丽轮枝菌菌饼和孢子悬液的培养方法：（1）大丽轮枝菌菌饼的培养pda液体培养基配方为：20%的马铃薯、2%的葡萄糖、1.5-2%琼脂、余下为水。
15.将大丽轮枝菌菌种用直径为1cm的打孔器转接到上述pda液体培养基上，25℃下培养72h，获得大丽轮枝菌菌饼。
16.（2）大丽轮枝菌孢子悬液的培养察氏液体培养基配方为：0.3%硝酸钠、0.1%磷酸氢二钠、0.05%硫酸镁、0.05%氯化钾、0.001%硫酸亚铁、3%蔗糖、ph7.1-7.5、余下为水。
17.将大丽轮枝菌菌种按1:100的比例转接到上述察氏液体培养基，25℃、180r/min摇床培养72h，获得大丽轮枝菌孢子悬液。
18.本发明提供了上述菌株l5在棉花黄萎病防治中的应用。
19.本发明提供了上述菌株l5用于抑制大丽轮枝菌的应用。
20.本发明提供了上述菌株l5的培养方法：在lb培养基中，37℃，培养12h。
21.本发明的有益效果是：本发明获得的l5菌株能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，用于病害防治的菌株必须能够在人工培养基上培养，以利于工厂化和推广应用。
22.本发明获得的l5菌的发酵液对大丽轮枝菌有明显抑制效果，抑菌率高达90.8%。
23.本发明利用生物技术有效的降低了棉花大丽轮枝菌对棉花的危害，同时同化学药剂相比避免了环境污染等方面的问题。
附图说明
24.图1为l5菌株在45℃下培养的平板菌落图；
图2为l5菌株拮抗大丽轮枝菌的平板对峙结果图；图3为l5菌株拮抗大丽轮枝菌的盆栽效果图；图4为l5菌株固氮能力效果图；图5为l5菌株解钾能力效果图；图6为l5菌株解磷能力效果图。
具体实施方式
25.下面结合图1-6及具体实施里对本发明作进一步的解释和说明。
26.本发明中使用的培养基配方，如下：lb液体培养基配方为：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl ，余下为水。
27.lb固体培养基配方为：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨；1%nacl；1.5-2%琼脂。
28.pda液体培养基配方为：20%的马铃薯、2%的葡萄糖、1.5-2%琼脂、余下为水。
29.察氏液体培养基配方为：0.3%硝酸钠、0.1%磷酸氢二钠、0.05%硫酸镁、0.05%氯化钾、0.001%硫酸亚铁、3%蔗糖、ph7.1-7.5、余下为水。
30.实施例1取河南天冠有限公司提供的厌氧废弃物
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沼渣5g，加入到含有100ml无菌水的三角瓶中于37℃、220rpm摇床中培养12h，于超净工作台中取1ml上清液稀释涂布到lb固体培养基中，于45℃恒温箱培养12h，然后用接种环挑出不同的单菌落转接于lb固体平板进行纯化用于后续的生物活性测试，由此筛选得到本发明菌株l5，如图1（l5菌株在45℃下培养的平板菌落）。
31.实施例2将l5菌体接种到lb液体培养基试管中（每管装5ml），于37℃、200rpm摇床培养12h，获得试管种。
32.将试管种转接于新鲜的lb液体培养基试管中（每管装5ml），于37℃、200rpm摇床培养12h，获得活性较强菌液。
33.取100ul上述菌液涂布于新鲜lb固体培养基上，37℃恒温箱培养12h，获得平皿菌。
34.实施例3将实施例2中的试管种接种到250ml三角瓶lb液体培养基中（每瓶装100ml），于37℃、200rpm摇床培养24h，得发酵培养物。
35.将发酵培养物于10000rpm离心15min，取上清液，用0.22um滤器过滤得到无菌发酵液。
36.实施例4l5菌株抑制大丽轮枝菌试验：利用实施例2所得菌液、平皿菌和实施例3所得发酵液，测定l5菌对大丽轮枝菌菌丝生长的抑制性试验和对大丽轮枝菌孢子萌发的试验。
37.1、准备对照组：对照组：对照组均采用相应量的lb培养基为空白对照，其余相同。
38.2、制备试验用大丽轮枝菌平板及大丽轮枝菌孢子：（1）制备大丽轮枝菌菌饼
将生长状态良好的大丽轮枝菌从原平皿上用直径为1cm的打孔器取下，在超净工作台中接种到新的pda固体培养基中，于25℃恒温培养至菌落直径为3cm，备用。
39.（2）制备大丽轮枝菌孢子悬液在100ml三角瓶中按1:100的比例在察氏液体培养基中接入大丽轮枝菌孢子菌液，在25℃、180rpm培养至孢子浓度为1
×
106~1
×
107cfu/ml备用。
40.3、试验方法：（1）抑制菌丝生长试验取实施例2中l5菌的菌饼在距离真菌菌丝边缘1.5cm处放置，在平皿的对应另一侧放置空白的lb固体培养基饼作为对照，与25℃恒温条件培养并观测抑菌圈的大小。
41.（2）发酵液抑制孢子萌发的试验取实施例3中l5菌的发酵液按1:100的比例接种到真菌孢子悬液中，于25℃、180rpm培养12h，镜检观察孢子的萌发情况。
42.（3）菌液对真菌孢子杀伤实验取实施例2培养12h后的l5菌的菌液，按1:50的比例接种到真菌孢子浓度为106cfu/ml的100ml的察氏液体培养基中，于25℃、180rpm培养12h，观察孢子数目并统计。
43.4、试验结果：（1）l5菌株高温生长状况：由图1可知，l5菌株在45℃高温下可以生长。
44.（2）l5菌菌饼抑制真菌菌丝生长试验：结果如图2（图2中平皿右侧为l5菌块，左侧为空白对照lb培养基）所示，由图2可知，l5菌饼与大丽轮枝菌共培养14天后明显看到l5菌饼对大丽轮枝菌菌丝的生长有较强的抑制作用，抑菌圈大小相对于空白对照来说达到1.5cm。
45.（3）l5菌发酵液抑制真菌孢子萌发的试验试验结果表明，l5菌发酵液抑制真菌孢子的萌发有较好的抑制作用，在l5菌发酵液与大丽轮枝菌共培养14天后抑菌圈大小达到1.1cm。
46.（4）l5菌发酵液对真菌孢子萌发的抑制实验表1l5菌发酵液对大丽轮枝菌孢子萌发的影响由表1的5平行试验结果可知，l5菌的发酵液对大丽轮枝菌孢子悬液处理12h之后的孢子萌发率仅有35.0%，对于空白的47.6%有较好的抑制效果（萌发率=萌发孢子数/孢子总数）。
47.实施例5
l5菌发酵液抑菌活性检测将待测l5菌株液体培养后，取l5菌发酵滤液备用。制备大丽轮枝菌固体培养基平板，等待平板完全冷却凝固后，抽取40 μl的1.0
×
106~107cfu/ml的大丽轮枝菌孢子悬液置于pda平板涂布，在距离培养基边缘等距处打孔每孔中分别加入200 μl的待测l5菌发酵滤液，并设置对照，对照为等体积的空白培养基。置于25℃恒温培养培养5 d，观察真菌孢子萌发的情况，重复3次，并测量抑菌圈直径。抑菌率=（对照组真菌菌落生长半径-处理组真菌生长半径）/对照组真菌菌落生长半径
×
100%。
48.结果测得l5菌发酵液对大丽轮枝菌的抑菌率高达90.8%，有明显抑制效果。
49.实施例6盆栽试验：取易感病棉种消毒后播种，于25℃条件下恒温培养，待其两片子叶完全展开后采用浇灌法浇灌由实施例2得到的l5菌液，每株棉花浇灌15ml菌液，并每隔一周浇灌一次，连续浇灌3次后接种大丽轮枝菌使其感病，并设置对照。
50.结果如图3（对照组：接种大丽轮枝菌，未浇灌l5菌液；实验组：接种大丽轮枝菌，浇灌l5菌液）所示，从图3中可以看出，浇灌l5菌液的棉花对大丽轮枝菌有较好的抗性。
51.实施例6固氮解磷解钾试验：挑选平板划线纯化好的l5菌株单菌落，采用点接法分别转接到固氮、解钾、解有机磷的培养基上。进行恒温培养并观察记录结果，发现在固氮功能菌筛选实验中，得到4株具有固氮功能的菌株。在大肠杆菌阴性对照下，菌株l5在固氮培养基上的透明圈较为明显，具有较强的固氮能力（图4）。在大肠杆菌阴性对照下，菌株l5产生的透明圈较为明显，具有较强的解钾能力（图5）。在解有机磷功能菌筛选实验中， 菌株l5 产生的透明圈较为明显，具有较强的解有机磷功能（图6）。
52.以上所述是结合具体实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明具体实施仅局限于此；对于本发明所属及相关技术领域的技术人员来说，在基于本发明技术方案思路前提下，所作的拓展以及操作方法、数据的替换，都应当落在本发明保护范围之内。

技术特征：
1.serratia sp. l5菌株，其特征在于，其保藏编号：cctcc m 20221083。2.根据权利要求1所述serratia sp. l5菌株，其特征在于，所述l5菌株的分离方法为：取河南天冠有限公司提供的厌氧废弃物
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沼渣5g，加入到含有100ml无菌水的三角瓶中于37℃、220rpm摇床中培养12h，于超净工作台中取1ml上清液稀释涂布到lb固体培养基中，于45℃恒温箱培养12h，然后用接种环挑出不同的单菌落转接于lb固体平板进行纯化用于后续的生物活性测试，由此筛选得到本发明菌株l5。3.权利要求1所述serratia sp. l5菌株的培养方法，其特征在于，在lb培养基中，37℃，培养12h。4.权利要求1-3任一所述serratia sp. l5菌株在棉花黄萎病防治中的应用。5.权利要求1-3任一所述serratia sp. l5菌株用于抑制大丽轮枝菌的应用。

技术总结
本发明公开了一种可防治棉花黄萎病且耐高温可固氮解磷的Serratia sp.L5的制备与应用。本发明所提供的菌株为Serratia sp.L5是从河南天冠有限公司提供的厌氧废弃物


技术研发人员：牛秋红 张林 韦宇平 雷绳尾 武国寒
受保护的技术使用者：南阳师范学院
技术研发日：2023.01.06
技术公布日：2023/9/13