一种利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法与流程

一种利用
γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化
γ-聚谷氨酸的方法
技术领域
1.本发明属于γ-聚谷氨酸生产技术领域，特别是涉及一种利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法。


背景技术：

2.γ-聚谷氨酸(又称聚谷氨酸)是由微生物发酵产生的水溶性胞外谷氨酸聚合物(γ-pga)，分子量从5万到2百万道尔顿不等，因此他们可广泛的应用在食品、工业、化妆品、保健、水处理、废水处理、卫生用品、医疗以及水凝胶等领域。
3.国内采用发酵模式生产γ-pga，由于发酵液粘度较大，使得分离纯化较为困难。国内相关文献资料公开了从发酵液中提取纯化γ-pga的方法，分别是有机溶剂沉淀法，化学沉淀法和膜分离方法。
4.存在的主要问题是：
5.1、γ-聚谷氨酸提取纯化过程中，采用低级醇类(甲醇、乙醇或异丙醇)或丙酮等有机溶剂进行沉淀去除杂质，但该方法导致有机溶剂用量较大，往往是发酵液的3-4倍体积，同时也会沉淀出部分还原糖，影响了成品质量。
6.2、采用化学沉淀法提取纯化聚谷氨酸会引入新的杂质，不利于后续的纯化，并且盐类使用量过大，且对环境污染严重。
7.3、国内采用了硅藻土和活性炭吸附蛋白和色素，同时也吸附了γ-聚谷氨酸，吸附量在1-2％，降低了提取收率。
8.4、国内文献资料公开了采用不同方法提取纯化γ-聚谷氨酸的收率和纯度，其收率范围在70-90％，纯度范围在90-97％，范围变化比较大，不利于工业化大生产。
9.国内专利“一种无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法”(专利号：201310576404.0)公开了一种采用硅藻土和红土混合进行板框过滤除菌，并采用加热与中空纤维膜超滤结合的方式除杂蛋白及大分子活性有机物，活性炭脱色后经纳滤膜重复过滤去除大部分氨基酸及盐离子，采用10kda和100kda超滤膜对经上述处理的清液进行加压循环超滤-稀释-超滤-浓缩步骤，最终得到杂质很少的γ-pga浓溶液，经真空冷冻干燥，得到精制白色γ-pga。该工艺存在的问题：
10.1、该专利使用有机膜过滤工艺分离纯化γ-聚谷氨酸，过渡依赖于膜过滤设备，膜组件及相应辅助设备成本高；膜容易堵塞和污染，影响分离效率，而且需要定期更换膜设备，整体生产成本较高。
11.2、采用硅藻土、红土和活性炭除杂脱色过程中，容易吸附γ-pga，降低了提取收率。
12.3、根据该专利的工艺进行验证，γ-pga总收率＜90％，未达到专利中阐述的技术水平。


技术实现要素：

13.本发明的目的在于克服上述现有技术中的缺陷，提供一种提取纯化工艺步骤简单、不使用有机溶剂(对环境的影响较低)、收率和纯度较高的方法。
14.为实现上述目的所采取的技术方案为：
15.一种利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，工艺步骤为：
16.(1)发酵液预处理
17.发酵液中加入一次水，发酵液加热升温至70-80℃，使用30％磷酸调节ph至2.8-3.2，搅拌20-40min，静置60-100min；加入氢氧化铝，调节ph至7-8，搅拌20-40min，静置60-100min；
18.(2)金属网过滤
19.发酵液预处理结束后，经金属网过滤，收集滤液；
20.(3)吸附
21.将步骤(2)中的滤液加入吸附剂，搅拌20-40min，静置80-100min，固液分离并收集滤液；
22.(4)陶瓷膜过滤
23.将步骤(3)中的滤液经陶瓷膜过滤，收集滤液；
24.(5)浓缩
25.将步骤(4)中的滤液倒入四效降膜蒸发器进行浓缩并收集浓缩液；
26.(6)结晶
27.启动搅拌系统，转速控制在20-40r/min，浓缩液温度降至0-3℃，降温的速度控制在5-9℃/h，当溶液出现浑浊现象时，加入纯品γ-聚谷氨酸，继续搅拌80-100min，然后静置240-300min，固液分离后得到固体γ-聚谷氨酸；
28.(7)重结晶
29.固体γ-聚谷氨酸加入纯化水，浓度控制在60-70g/l，重复步骤(6)的工艺，得到固体γ-聚谷氨酸；
30.(8)干燥
31.将步骤(7)中的固体γ-聚谷氨酸进行干燥处理，温度控制在70-80℃，至水分＜0.5％，停止干燥，得到纯品γ-聚谷氨酸。
32.其中，步骤(1)中所述一次水用量是发酵液体积的30-40％。
33.其中，步骤(2)中所述金属网过滤使用的是烧结网不锈钢滤芯，滤芯精度为40um，滤速控制在1-3m3/h；过滤时，γ-聚谷氨酸发酵液温度控制在30-35℃。
34.其中，步骤(3)中所述吸附剂制备方法包括如下步骤：
35.1)黏土称重并过200目筛，加入纯化水，搅拌20-30min，过滤后得到湿固体黏土。
36.w黏土∶l纯化水＝1kg∶2-4l。
37.2)湿固体黏土中分别加入纯化水和80％的浓硫酸，升温至80-85℃，搅拌300-350min，过滤后得到湿固体a。
38.w黏土∶l纯化水＝1kg∶1-2l，
39.w黏土∶l浓硫酸＝1kg∶0.6-0.8l。
40.3)湿固体a用纯化水水洗1次并过滤得到湿固体a。
41.w黏土a∶l纯化水＝1kg∶6-10l。
42.4)湿固体a中分别加入纯化水、固体酒精和醋酐，加入80％浓硫酸调节ph3-3.5，于40-45℃搅拌450-500min，过滤后得到湿固体b。
43.w黏土∶l纯化水＝1kg∶1-2l，
44.w黏土∶w固体酒精＝1kg∶0.4-0.6kg，
45.w黏土∶l醋酐＝1kg∶0.4-6l。
46.5)湿固体b用纯化水水洗2次，并过滤、干燥，得到固体b，水分含量低于2％。
47.w黏土∶l纯化水＝1kg∶3-5l。
48.6)壳聚糖过200目筛。
49.7)固体b中加入壳聚糖，搅拌均匀后，加入40％玻璃水溶液，搅拌80-100min。搅拌过程中，每隔20min加入纯化水。搅拌结束粉碎并过200目筛筛分，于70-80℃干燥，至水分含量低于2％以下停止干燥；最后，将干燥后的混合物进行高温热处理。在250-300℃的条件下，高温煅烧6-10min。煅烧结束，再次进行粉碎和过200目筛筛分处理，得到吸附剂。
50.其中，通过上述制备方法制成的吸附剂组成为：w固体b∶w壳聚糖＝1kg∶0.3-0.5kg，w固体b∶l40％玻璃水＝1kg∶0.2-0.4l，w固体b∶l纯化水＝1kg∶60-100ml。
51.其中，所述吸附剂用量：w吸附剂(kg)＝0.29
×
发酵单位(g/l)
×
发酵液体积(m3)。
52.其中，步骤(4)中所述陶瓷膜过滤是指：
53.1)酸化：滤液加热至65-70℃，加30％磷酸，调ph至2-3，搅拌30-50min，维持温度不变。
54.2)陶瓷膜过滤：陶瓷膜材质是溴化锂、二氧化锆、二氧化钛等无机材料高温烧结而成，孔径5nm，操作压力0.2-0.5mpa。向陶瓷膜过滤装置的进料斗中加入滤液，循环2-6min，开始过滤并收集滤液。
55.其中，步骤(5)中所述浓缩是指经陶瓷膜过滤的滤液温度控制在50-60℃，进入四效降膜蒸发器，流速控制在6000-8000l/h，出口处滤液的浓度是进口处滤液浓度的2-3倍。
56.其中，步骤(6)中所述纯品γ-聚谷氨酸用量为：
57.w纯品γ-聚谷氨酸(kg)＝0.01
×
发酵单位(g/l)
×
发酵液体积(m3)
58.本发明专利的有益效果体现在以下几个方面：
59.1、本发明阐述的工艺没有使用有机溶剂，减少了对环境的影响。
60.2、同有机膜过滤比较，采用复合无机陶瓷膜代替有机膜，膜组件及相应辅助设备成本较低，同时延长了设备的维护和保养周期。使用过程中发现无机膜过滤中减少了膜容易堵塞和污染现象，提高了膜的使用效率。
61.3、本专利中使用了全新的吸附剂，其杂蛋白的吸附率在85％以上，色素的吸附率在80％左右，高于常规的吸附剂吸附效果，并且γ-聚谷氨酸吸附量小于0.7％。
62.4、采用本专利的工艺，γ-聚谷氨酸收率在90％左右；纯度在97-99％。
具体实施方式
63.下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
64.目前，国内采用发酵模式生产聚谷氨酸，即利用枯草芽孢杆菌，采用三级发酵模式
生产，其培养基中的氮源主要是酵母粉、蛋白胨和玉米浆，碳源主要是葡萄糖、谷氨酸钠和柠檬酸钠。
65.陶瓷膜及膜过滤设备由上海致政膜过滤设备有限公司提供。
66.实施例1
67.聚谷氨酸发酵液10m3，发酵单位45.8g/l。
68.(1)发酵液预处理
69.发酵液中加入一次水3m3；发酵液体积13m3。发酵液加热升温至70℃；使用30％磷酸调节ph至2.8，搅拌20min，静置60min；加入氢氧化铝，调节ph至7，搅拌20in，静置60min。
70.(2)金属网过滤
71.发酵液预处理结束后，发酵液温度控制在30℃，经金属网过滤，滤速控制在1m3/h。收集滤液11.2m3，含量40.16g/l，收率98.2％。
72.(3)吸附
73.滤液中加入吸附剂132.82kg，搅拌20min，静置80min，固液分离得到滤液11.1m3，含量40.28g/l，收率99.4％。
74.(4)陶瓷膜过滤
75.滤液加热至65℃，加30％磷酸，调ph至2，搅拌30min，维持温度不变。
76.陶瓷膜过滤：陶瓷膜材质是溴化锂、二氧化锆、二氧化钛等无机材料高温烧结而成，孔径5nm，操作压力0.2-0.5mpa。向陶瓷膜过滤装置的进料斗中加入滤液，循环2min，开始过滤并收集滤液。陶瓷膜过滤结束，收集滤液11.06m3，含量39.78g/l，收率98.4％。
77.(5)浓缩
78.滤液进入四效降膜蒸发器进行浓缩2倍，并收集浓缩液5.52m3。
79.(6)结晶
80.启动搅拌系统，转速控制在20r/min，浓缩液温度降至3℃，降温的速度控制在5℃/h，当溶液出现浑浊现象，加入纯品γ-聚谷氨酸4.6kg，继续搅拌80min，然后静置240min，固液分离后得到湿固体γ-聚谷氨酸476.5kg。
81.(7)重结晶
82.固体γ-聚谷氨酸加入纯化水，浓度控制在60g/l。
83.重复步骤(6)的工艺，得到湿固体γ-聚谷氨酸473.1kg。
84.(8)干燥
85.湿固体γ-聚谷氨酸进行干燥处理，温度控制在70-80℃，至水分＜0.5％停止干燥，得到纯品γ-聚谷氨酸413.6kg(不包含结晶工艺中添加的纯品聚谷氨酸)，收率90.3％，纯度97.4％。
86.实施例2
87.聚谷氨酸发酵液10m3，发酵单位39.6g/l。
88.(1)发酵液预处理发酵液中加入一次水3.3m3；发酵液体积13.3m3。发酵液加热升温至72℃；使用30％磷酸调节ph至2.9，搅拌25min，静置70min；加入氢氧化铝，调节ph至7.2，搅拌25in，静置70min。
89.(2)金属网过滤
90.发酵液预处理结束后，发酵液温度控制在31℃，经金属网过滤，滤速控制在1.5m3/
h。收集滤液11.5m3，含量33.85g/l，收率98.3％。
91.(3)吸附
92.滤液中加入吸附剂114.84kg，搅拌25min，静置85min，固液分离得到滤液11.4m3，含量33.94g/l，收率99.4％。
93.(4)陶瓷膜过滤
94.滤液加热至66℃，加30％磷酸，调ph至2.2，搅拌35min，维持温度不变。
95.陶瓷膜过滤：陶瓷膜材质是溴化锂、二氧化锆、二氧化钛等无机材料高温烧结而成，孔径5nm，操作压力0.2-0.5mpa。向陶瓷膜过滤装置的进料斗中加入滤液，循环3min，开始过滤并收集滤液。陶瓷膜过滤结束，收集滤液11.31m3，含量33.70g/l，收率98.5％。
96.(5)浓缩
97.滤液进入四效降膜蒸发器进行浓缩2.2倍，并收集浓缩液5.14m3。
98.(6)结晶
99.启动搅拌系统，转速控制在25r/min，浓缩液温度降至2℃，降温的速度控制在6℃/h，当溶液出现浑浊现象，加入纯品γ-聚谷氨酸3.96kg，继续搅拌85min，然后静置250min，固液分离后得到湿固体γ-聚谷氨酸398.4kg。
100.(7)重结晶
101.湿固体γ-聚谷氨酸加入纯化水，浓度控制在62g/l。
102.重复步骤(6)的工艺，得到湿固体γ-聚谷氨酸392.2kg。
103.(8)干燥
104.湿固体γ-聚谷氨酸进行干燥处理，温度控制在72℃，至水分0.4％停止干燥，得到纯品γ-聚谷氨酸358kg(不包含结晶工艺中添加的纯品聚谷氨酸)，收率90.4％，纯度97.6％。
105.实施例3
106.聚谷氨酸发酵液10m3，发酵单位41.4g/l。
107.(1)发酵液预处理
108.发酵液中加入一次水3.5m3；发酵液体积13.5m3。发酵液加热升温至75℃；使用30％磷酸调节ph至3.0，搅拌30min，静置80min；加入氢氧化铝，调节ph至7.5，搅拌30in，静置80min。
109.(2)金属网过滤
110.发酵液预处理结束后，发酵液温度控制在32℃，经金属网过滤，滤速控制在2m3/h。收集滤液11.7m3，含量34.89g/l，收率98.6％。
111.(3)吸附
112.滤液中加入吸附剂120kg，搅拌30min，静置90min，固液分离得到滤液11.6m3，含量35.01g/l，收率99.5％。
113.(4)陶瓷膜过滤
114.滤液加热至67℃，加30％磷酸，调ph至2.5，搅拌40min，维持温度不变。
115.陶瓷膜过滤：陶瓷膜材质是溴化锂、二氧化锆、二氧化钛等无机材料高温烧结而成，孔径5nm，操作压力0.2-0.5mpa。向陶瓷膜过滤装置的进料斗中加入滤液，循环4min，开始过滤并收集滤液。陶瓷膜过滤结束，收集滤液11.51m3，含量34.82g/l，收率98.7％。
116.(5)浓缩
117.滤液进入四效降膜蒸发器进行浓缩2.5倍，并收集浓缩液4.6m3。
118.(6)结晶
119.启动搅拌系统，转速控制在30r/min，浓缩液温度降至1℃，降温的速度控制在7℃/h，当溶液出现浑浊现象，加入纯品γ-聚谷氨酸4.14kg，继续搅拌90min，然后静置260min，固液分离后得到湿固体γ-聚谷氨酸410.34kg。
120.(7)重结晶
121.湿固体γ-聚谷氨酸加入纯化水，浓度控制在65g/l。
122.重复步骤(6)的工艺，得到湿固体γ-聚谷氨酸413.8kg。
123.(8)干燥
124.湿固体γ-聚谷氨酸进行干燥处理，温度控制在72℃，至水分0.3％停止干燥，得到纯品γ-聚谷氨酸378kg(不包含结晶工艺中添加的纯品聚谷氨酸)，收率91.3％，纯度98.8％。
125.实施例4
126.聚谷氨酸发酵液10m3，发酵单位42.6g/l。
127.(1)发酵液预处理
128.发酵液中加入一次水3.8m3；发酵液体积13.8m3。发酵液加热升温至77℃；使用30％磷酸调节ph至3.1，搅拌35min，静置90min；加入氢氧化铝，调节ph至7.8，搅拌35in，静置90min。
129.(2)金属网过滤
130.发酵液预处理结束后，发酵液温度控制在34℃，经金属网过滤，滤速控制在2.5m3/h。收集滤液12m3，含量34.79g/l，收率98％。
131.(3)吸附
132.滤液中加入吸附剂123kg，搅拌35min，静置95min，固液分离得到滤液11.9m3，含量34.87g/l，收率99.4％。
133.(4)陶瓷膜过滤
134.滤液加热至68℃，加30％磷酸，调ph至2.8，搅拌45min，维持温度不变。
135.陶瓷膜过滤：陶瓷膜材质是溴化锂、二氧化锆、二氧化钛等无机材料高温烧结而成，孔径5nm，操作压力0.2-0.5mpa。向陶瓷膜过滤装置的进料斗中加入滤液，循环5min，开始过滤并收集滤液。陶瓷膜过滤结束，收集滤液11.82m3，含量34.58g/l，收率98.5％。
136.(5)浓缩
137.滤液进入四效降膜蒸发器进行浓缩2.8倍，并收集浓缩液4.2m3。
138.(6)结晶
139.启动搅拌系统，转速控制在35r/min，浓缩液温度降至1℃，降温的速度控制在8℃/h，当溶液出现浑浊现象，加入纯品γ-聚谷氨酸4.26kg，继续搅拌95min，然后静置270min，固液分离后得到湿固体γ-聚谷氨酸415.2kg。
140.(7)重结晶
141.湿固体γ-聚谷氨酸加入纯化水，浓度控制在67g/l。
142.重复步骤(6)的工艺，得到湿固体γ-聚谷氨酸416.4kg。
143.(8)干燥
144.湿固体γ-聚谷氨酸进行干燥处理，温度控制在78℃，至水分0.3％停止干燥，得到纯品γ-聚谷氨酸384.2kg(不包含结晶工艺中添加的纯品聚谷氨酸)，收率90.2％，纯度98.4％。
145.实施例5
146.聚谷氨酸发酵液10m3，发酵单位37.5g/l。
147.(1)发酵液预处理
148.发酵液中加入一次水4m3；发酵液体积14m3。发酵液加热升温至80℃；使用30％磷酸调节ph至3.2，搅拌40in，静置100min；加入氢氧化铝，调节ph至8.0，搅拌40in，静置100min。
149.(2)金属网过滤
150.发酵液预处理结束后，发酵液温度控制在35℃，经金属网过滤，滤速控制在3m3/h。收集滤液12.1m3，含量30.43g/l，收率98.2％。
151.(3)吸附
152.滤液中加入吸附剂108.8kg，搅拌40min，静置100min，固液分离得到滤液12m3，含量30.53g/l，收率99.5％。
153.(4)陶瓷膜过滤
154.滤液加热至70℃，加30％磷酸，调ph至3.0，搅拌50min，维持温度不变。
155.陶瓷膜过滤：陶瓷膜材质是溴化锂、二氧化锆、二氧化钛等无机材料高温烧结而成，孔径5nm，操作压力0.2-0.5mpa。向陶瓷膜过滤装置的进料斗中加入滤液，循环6min，开始过滤并收集滤液。陶瓷膜过滤结束，收集滤液11.93m3，含量30.13g/l，收率98.1％。
156.(5)浓缩
157.滤液进入四效降膜蒸发器进行浓缩3倍，并收集浓缩液4m3。
158.(6)结晶
159.启动搅拌系统，转速控制在40r/min，浓缩液温度降至0℃，降温的速度控制在9℃/h，当溶液出现浑浊现象，加入纯品γ-聚谷氨酸3.75kg，继续搅拌100min，然后静置280min，固液分离后得到湿固体γ-聚谷氨酸367.3kg。
160.(7)重结晶
161.湿固体γ-聚谷氨酸加入纯化水，浓度控制在70g/l。
162.重复步骤(6)的工艺，得到湿固体γ-聚谷氨酸368.5kg。
163.(8)干燥
164.湿固体γ-聚谷氨酸进行干燥处理，温度控制在80℃，至水分0.2％停止干燥，得到纯品γ-聚谷氨酸340.1kg(不包含结晶工艺中添加的纯品聚谷氨酸)，收率90.7％，纯度98.1％。
165.实施例6
166.聚谷氨酸发酵液10m3，发酵单位38.6g/l。
167.(1)发酵液预处理
168.发酵液中加入一次水4m3；发酵液体积14m3。发酵液加热升温至70℃；使用30％磷酸调节ph至3，搅拌30in，静置100min；加入氢氧化铝，调节ph至7.6，搅拌35in，静置100min。
169.(2)金属网过滤
170.发酵液预处理结束后，发酵液温度控制在33℃，经金属网过滤，滤速控制在2.3m3/h。收集滤液12m3，含量31.62g/l，收率98.3％。
171.(3)吸附
172.滤液中加入吸附剂112kg，搅拌35min，静置100min，固液分离得到滤液11.92m3，含量31.64g/l，收率99.4％。
173.(4)陶瓷膜过滤
174.滤液加热至66℃，加30％磷酸，调ph至2.9，搅拌45min，维持温度不变。
175.陶瓷膜过滤：陶瓷膜材质是溴化锂、二氧化锆、二氧化钛等无机材料高温烧结而成，孔径5nm，操作压力0.2-0.5mpa。向陶瓷膜过滤装置的进料斗中加入滤液，循环5min，开始过滤并收集滤液。陶瓷膜过滤结束，收集滤液11.89m3，含量31.15g/l，收率98.2％。
176.(5)浓缩
177.滤液进入四效降膜蒸发器进行浓缩2.7倍，并收集浓缩液4.4m3。
178.(6)结晶
179.启动搅拌系统，转速控制在40r/min，浓缩液温度降至1℃，降温的速度控制在8℃/h，当溶液出现浑浊现象，加入纯品γ-聚谷氨酸3.86g，继续搅拌80min，然后静置250min，固液分离后得到湿固体γ-聚谷氨酸379.7kg。
180.(7)重结晶
181.湿固体γ-聚谷氨酸加入纯化水，浓度控制在70g/l。
182.重复步骤(6)的工艺，得到湿固体γ-聚谷氨酸380.2kg。
183.(8)干燥
184.湿固体γ-聚谷氨酸进行干燥处理，温度控制在80℃，至水分0.2％停止干燥，得到纯品γ-聚谷氨酸348.9kg(不包含结晶工艺中添加的纯品聚谷氨酸)，收率90.4％，纯度98.3％。
185.对比实施例1
186.聚谷氨酸发酵液1m3，发酵单位40.6g/l。
187.发酵液在5000r/min离心20min以去除菌体，得到上清液0.74m3，检测得出，上清液液中γ-聚谷氨酸含量为51.41g/l，收率93.7％。
188.反胶束萃取：
189.(a)反胶束溶液的制备：前萃溶液为：100mmol/l十六烷基三甲基溴化铵(ctab)/80％(v/v)异辛烷/5％(v/v)正己醇/15％(v/v)正丁醇；反萃溶液为：含0.5mol/l kbr的ph为4.2的醋酸缓冲液；
190.(b)上清液预处理：将步骤2得到的含有γ-聚谷氨酸的上清液，加入0.1mol/lnacl，用6mol/l的稀盐酸调节ph至6；
191.(c)反胶束萃取：将等体积的前萃溶液与预处理后的上清液混合，混合时间为5min；然后再加入反萃溶液，混合10min，待相分离(25℃)后，得到含有γ-聚谷氨酸的水相。
192.水相置于7000dal透析袋中在蒸馏水中透析48h，每4h换一次蒸馏水，将透析的浓缩液进行真空干燥得到γ-聚谷氨酸粗品；
193.γ-聚谷氨酸粗品溶于蒸馏水，再将所得溶液放入透析袋中，用蒸馏水反复透析48h，去除小分子和有机溶剂，浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸纯品，产量为
307kg，提取率75.5％，纯度96.1％。
194.对比实施例2
195.将500lγ-聚谷氨酸发酵液(发酵单位29.4g/l)转移至带夹套的搅拌釜中，加入1mol/l稀硫酸调节ph至5.0，搅拌均匀后进行加热至50℃，然后加入2倍体积的食品级乙醇，1500rpm高速搅拌3h，自然沉降后去除上清液，颗粒状沉淀用食品级乙醇洗两遍，以去除浮色，此时得到的为淡黄色颗粒状粗品。
196.淡黄色颗粒状粗品中加入2倍发酵液体积的蒸馏水，60℃加热条件下快速搅拌溶解，然后加入25kg组合硅藻土(200目硅藻土15kg，100目硅藻土10kg)、150目活性炭200g进行吸附，搅拌均匀后趁热过滤；在正压过滤器中用200目硅藻土做成厚度为1cm左右的滤饼，混合液加入过滤器中进行过滤，压力≤0.5mpa，收集滤液，过滤速度30l/h。过滤结束，滤液236l，γ-聚谷氨酸51.14g/l，收率82.1％。
197.过滤后的滤液直接进行减压蒸馏，此过程除浓缩之外，还可以将滤液中含有的微量乙醇去除干净；装置中的装液量为50％，温度控制在55℃，直至滤液中聚谷氨酸的含量达到8％(w/v)，取出后进行冷冻干燥后得到固体聚谷氨酸11.4kg，总收率在77.5％，纯度为91.4％。
198.对比实施例3
199.聚谷氨酸发酵液1m3，发酵单位37.2g/l。
200.①
发酵液的酸化处理：调发酵液ph至3.0；
201.②
发酵液除菌：采用微滤膜滤除菌体；得到滤液0.76m3，含量46.25g/l；
202.③
超滤浓缩：加入3-10倍体积的纯净水稀释，采用超滤膜对稀释后的无菌发酵液进行浓缩除杂，并重复稀释浓缩步骤3次，直至浓缩后的体积为原发酵液的20％；
203.④
γ-聚谷氨酸的分离纯化：将超滤浓缩后的液体调ph3.0后，直接采用95％乙醇醇进行沉淀，用量是2.1m3，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸成品34.12kg，收率88.4％，纯度96.2％。
204.对比实施4
205.聚谷氨酸发酵液1m3，发酵单位35.5g/l。
206.将发酵液ph调至3.0，加入发酵液体积质量体积百分比2％(20kg)的硅藻土，然后用800目滤布，板框过滤除菌体，得到滤液0.72m3，含量46.89g/l，收率95.1％。
207.聚谷氨酸发酵液的脱色方法为：
208.加入1％(10kg)活性炭，进行常温慢速搅拌，脱色90min，抽滤，至液体基本澄清无色；然后将脱色液稀释2倍后过纳滤膜，制得聚谷氨酸溶液0.6m3，含量53.5g/l，收率94.3％。
209.调整聚谷氨酸溶液的浓度为10g/l，用10kda超滤膜进行超滤。
210.超滤结束，进行冷冻干燥，得到固体γ-聚谷氨酸成品30kg，收率84.5％，纯度95.7％。
211.对比实施例5
212.聚谷氨酸发酵液1m3，发酵单位42.7g/l。
213.(1)除菌体
214.将发酵液ph调至4.5，硅藻土和红土按2︰1混合，加入量为2％(20kg)，800目滤布，
0.22mpa压力，板框过滤除菌体。滤液体积0.71m3，含量56.71g/l，收率94.3％。
215.(2)除杂蛋白及大分子活性有机物
216.滤液用氢氧化钠调ph6.5，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80％以上杂蛋白。滤液体积0.69m3，含量57.3g/l，收率98.2％。
217.(3)脱色
218.滤液加入1％活性炭(6.9kg)进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，得滤液0.69m3，含量56.5g/l，收率98.6％。
219.(4)除小分子氨基酸、离子杂质
220.滤液稀释2.5倍过0.01um孔径纳滤膜，透过液再次过0.01um孔径纳滤膜，得清液1.7m3，含量22.34g/l，收率97.4％。
221.(5)超滤-浓缩-超滤提纯
222.滤液进行100kda超滤，得到滤液1.67m3，继续100kda超滤，得滤液1.65m3，继续进行100kda超滤膜循环超滤，最终得到1.62m3，稀释至3m3进行10kda超滤膜超滤，得到滤液2.5m3并浓缩至1m3，真空冷冻干燥后，得到固体γ-聚谷氨酸34.7kg，收率81.3％，纯度94.6％。

技术特征：
1.一种利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于工艺步骤为：(1)发酵液预处理发酵液中加入一次水，加热升温至70-80℃，使用30％磷酸调节ph至2.8-3.2，搅拌20-40min，静置60-100min；加入氢氧化铝，调节ph至7-8，搅拌20-40min，静置60-100min；(2)金属网过滤发酵液预处理结束后，经金属网过滤，收集滤液；(3)吸附将步骤(2)中的滤液加入吸附剂，搅拌20-40min，静置80-100min，固液分离并收集滤液；(4)陶瓷膜过滤将步骤(3)中的滤液经陶瓷膜过滤，收集滤液；(5)浓缩将步骤(4)中的滤液倒入四效降膜蒸发器进行浓缩并收集浓缩液；(6)结晶启动搅拌系统，转速控制在20-40r/min，浓缩液温度降至0-3℃，降温的速度控制在5-9℃/h，当溶液出现浑浊现象时，加入纯品γ-聚谷氨酸，继续搅拌80-100min，然后静置240-300min，固液分离后得到固体γ-聚谷氨酸；(7)重结晶固体γ-聚谷氨酸加入纯化水，浓度控制在60-70g/l，重复步骤(6)的工艺，得到固体γ-聚谷氨酸；(8)干燥将步骤(7)中的固体γ-聚谷氨酸进行干燥处理，温度控制在70-80℃，至水分＜0.5％，停止干燥，得到纯品γ-聚谷氨酸。2.按照权利要求1所述的提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于步骤(1)中所述一次水用量是发酵液体积的30-40％。3.按照权利要求1所述的提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于步骤(2)中所述金属网过滤使用的是烧结网不锈钢滤芯，滤芯精度为40um，滤速控制在1-3m3/h；过滤时，γ-聚谷氨酸发酵液温度控制在30-35℃。4.按照权利要求1所述的提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于步骤(3)中所述吸附剂制备方法包括如下步骤：1)黏土称重并过200目筛，加入纯化水，搅拌20-30min，过滤后得到湿固体黏土；w黏土∶l纯化水＝1kg∶2-4l；2)湿固体黏土中分别加入纯化水和80％的浓硫酸，升温至80-85℃，搅拌300-350min，过滤后得到湿固体a；w黏土∶l纯化水＝1kg∶1-2l，w黏土∶l浓硫酸＝1kg∶0.6-0.8l；3)湿固体a用纯化水水洗1次并过滤得到湿固体a；w黏土a∶l纯化水＝1kg∶6-10l；
4)湿固体a中分别加入纯化水、固体酒精和醋酐，加入80％浓硫酸调节ph3-3.5，于40-45℃搅拌450-500min，过滤后得到湿固体b；w黏土∶l纯化水＝1kg∶1-2l，w黏土∶w固体酒精＝1kg∶0.4-0.6kg，w黏土∶l醋酐＝1kg∶0.4-6l；5)湿固体b用纯化水水洗2次，并过滤、干燥，得到固体b，水分含量低于2％；w黏土∶l纯化水＝1kg∶3-5l；6)壳聚糖过200目筛；7)固体b中加入壳聚糖，搅拌均匀后，加入40％玻璃水溶液，搅拌80-100min；搅拌过程中，每隔20min加入纯化水。搅拌结束粉碎并过200目筛筛分，于70-80℃干燥，至水分含量低于2％以下停止干燥；最后，将干燥后的混合物进行高温热处理；在250-300℃的条件下，高温煅烧6-10min；煅烧结束，再次进行粉碎和过200目筛筛分处理，得到吸附剂。5.按照权利要求4所述的提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述吸附剂组成为：w固体b∶w壳聚糖＝1kg∶0.3-0.5kg，w固体b∶l40％玻璃水＝1kg∶0.2-0.4l，w固体b∶l纯化水＝1kg∶60-100ml。6.按照权利要求4所述的提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述吸附剂用量为：w吸附剂(kg)＝0.29
×
发酵单位(g/l)
×
发酵液体积(m3)。7.按照权利要求1所述的提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于步骤(4)中所述陶瓷膜过滤是指：1)酸化：滤液加热至65-70℃，加30％磷酸，调ph至2-3，搅拌30-50min，维持温度不变；2)陶瓷膜过滤：陶瓷膜材质是溴化锂、二氧化锆、二氧化钛其中的一种或多种无机材料高温烧结而成，孔径5nm，操作压力0.2-0.5mpa；向陶瓷膜过滤装置的进料斗中加入滤液，循环2-6min，开始过滤并收集滤液。8.按照权利要求1所述的提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于步骤(5)中所述浓缩是指经陶瓷膜过滤的滤液温度控制在50-60℃，进入四效降膜蒸发器，流速控制在6000-8000l/h，出口处滤液的浓度是进口处滤液浓度的2-3倍。9.按照权利要求1所述的提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于步骤(6)中所述纯品γ-聚谷氨酸用量为：w纯品γ-聚谷氨酸(kg)＝0.01
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发酵单位(g/l)
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发酵液体积(m3)。

技术总结
本发明涉及一种利用γ-聚谷氨酸发酵液提取纯化γ-聚谷氨酸的方法，其工艺步骤包括发酵液预处理、金属网过滤、吸附、陶瓷膜过滤、浓缩、结晶、重结晶和干燥。本发明采用新的吸附剂代替常规吸附材料，省去了传统工艺中醇析这一必需提取手段。同目前国内常规工艺相比，本发明方法除杂效果显著，还能够实现γ-PGA的有效提纯，制得γ-PGA的纯度高达97％以上，具有提取收率高，产品质量稳定、生产成本低等特点，有利于增强产品的国外市场竞争力。利于增强产品的国外市场竞争力。


技术研发人员：保洁华 奇乃 李小萍
受保护的技术使用者：宁夏泰胜生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.04
技术公布日：2023/9/13