一种生物墨水及其制备方法、应用

1.本发明涉及医疗器械技术领域，特别是涉及一种生物墨水及其制备方法、应用。


背景技术：

2.骨骼作为生物体的支撑结构，对保持美观及维持正常功能具有重大意义。肿瘤、外伤、感染等引起的骨缺损，对患者带来心理生理的困扰，也是外科医生面临的重大临床难题。目前临床上常用骨缺损修复方法为使用自体骨、同种异体骨、异种骨和人工骨修复材料进行移植修复。自体骨由于无免疫原性及良好的骨诱导性能，被认为是骨修复的“金标准”。但自体骨来源较为有限，且会对患者造成二次创伤。同种异体骨及异种骨虽然来源广泛，但存在免疫排斥、感染等问题，限制了其广泛运用。而人工骨修复材料虽然具有良好的生物安全性、骨传导性及生物可降解性，但在修复大段骨缺损时，会局限于内源性细胞的迁移和分化。因此，骨组织工程作为新型骨修复方法引起了极大的关注。
3.常规骨组织工程是在体外构建支架，再将种子细胞接种到支架上，体外培养一定的时间后植入体内骨缺损区域。然而，这种方法受限于种子细胞分布不可控、细胞数量有限等，无法满足骨组织再生的需求。同时，临床上的骨缺损病例中，为了尽可能地保存患者原有骨组织，其骨缺损区域通常是不规则的。因此，为了使骨移植物与骨缺损区域相吻合，生物墨水包裹种子细胞进行的3d生物打印修复体成为了骨缺损修复新的发展方向。gelma水凝胶由于其良好的生物安全性和生物相容性，被认为可以较好地模拟细胞外基质并为骨组织工程提供仿生微环境。然而，纯gelma水凝胶也有一定的局限性，比如较低的力学强度、较差的骨诱导能力等。因此，通过对gelma水凝胶的改性，开发出一种具有生物活性的生物墨水，从而应用于骨再生是解决这一临床问题的关键路径之一。


技术实现要素：

4.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种生物墨水及其制备方法、应用，用于解决现有技术中纯甲基丙烯酸化明胶骨诱导能力差、得到的骨再生的修复体的力学强度低的问题。
5.为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过包括以下技术方案获得的。
6.本发明提供一种生物墨水，以分散剂总体积为基准，所述生物墨水包括以下浓度的组分：甲基丙烯酸化明胶(gelma)50～150g/l，光引发剂2.5～10g/l，生物陶瓷纳米纤维5～10g/l，所述分散剂为培养基或磷酸缓冲液。
7.优选地，所述生物陶瓷纳米纤维的直径为10～30nm，长度为0.1～2.0μm。
8.优选地，所述生物陶瓷纳米纤维为硬硅钙石或锶掺杂硬硅钙石。
9.优选地，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。
10.本发明的目的之二在于提供一种生物墨水的制备方法，将甲基丙烯酸化明胶、光引发剂和生物陶瓷纳米纤维均匀分散于分散剂中，制得所述生物墨水。
11.优选地，先将甲基丙烯酸化明胶和光引发剂均匀分散于分散剂中，然后再加入生
物陶瓷纳米纤维。
12.优选地，分散过程中体系温度为35～40℃。
13.本发明的目的之三在于提供一种生物墨水在制备用于修复骨缺损的药物或医疗器械中的应用。
14.本发明的目的之四在于提供一种3d生物打印骨再生修复体的方法，构建骨再生修复体三维模型，将生物墨水与种子细胞混合后作为打印原料进行3d生物打印，光固化后形成骨再生修复体。
15.优选地，采用波长为365～405nm的蓝光进行光固化。更优选地，光固化时间为50～60s。
16.优选地，所述种子细胞为成体细胞或干细胞。
17.优选地，所述种子细胞在生物墨水中的加入量为106～107个/ml。
18.优选地，3d生物打印的气压为0.1～0.2mpa。
19.优选地，3d生物打印的速度为6～12mm/s。
20.本发明的目的之五在于提供一种采用上述方法得到的骨再生修复体。
21.如上所述，本发明的生物墨水及其制备方法、应用，具有以下有益效果：通过生物陶瓷纳米纤维改性gelma获得生物墨水，该生物墨水具有良好的骨诱导能力，能支持种子细胞的体内外生长及成骨分化，从而促进骨缺损区域的骨再生；该生物墨水具有剪切稀化的性能，能满足微挤出式打印过程中保护细胞并快速成型，工艺简单易行且易于推广。
附图说明
22.图1显示为实施例1制备的生物墨水的剪切稀化性能图。
23.图2显示为实施例1制备的骨再生修复体内活死细胞染色图。
24.图3显示为实施例1制备的骨再生修复体的骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色图。
25.图4显示为实施例1制得的骨再生修复体的体内成骨实验中空白组、对照组和实验组的micro-ct图。
26.图5显示为图4的micro-ct图进行定量分析后获得的数据的柱状图。
具体实施方式
27.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
28.须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
29.此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为
鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
30.本发明实施例提供了一种具体的生物墨水，以分散剂总体积为基准，所述生物墨水包括以下浓度的组分：甲基丙烯酸化明胶(gelma)50～150g/l，光引发剂2.5～10g/l，生物陶瓷纳米纤维5～10g/l，所述分散剂为培养基或磷酸缓冲液(pbs)。
31.在一个具体的实施方式中，每升无菌培养基中包括如下组分：90～110ml胎牛血清、10～20ml青霉素链霉素溶液和850～900ml最低基本培养基。
32.在一个更为具体的实施方式中，每升无菌培养基中包括如下组分：100ml胎牛血清、10ml青霉素链霉素溶液和890ml最低基本培养基(mem)。所述最低基本培养基mem购买自gibco或者hyclone公司。
33.在一个具体的实施方式中，所述磷酸缓冲液(pbs)中各组分浓度为：30～40g/l磷酸二氢钠和5.0～5.5g/l磷酸氢二钠，所述磷酸缓冲液的溶剂为水。
34.在一个更为具体的实施方式中，所述磷酸缓冲液(pbs)中各组分浓度为：38g/l磷酸二氢钠和5.04g/l磷酸氢二钠，所述磷酸缓冲液的溶剂为水。
35.在一个具体的实施方式中，所述生物陶瓷纳米纤维的直径为10～30nm，长度为0.1～2.0μm。
36.在一个具体的实施方式中，所述生物陶瓷纳米纤维为硬硅钙石(csh)或锶掺杂硬硅钙石(sr-csh)。
37.在一个具体的实施方式中，所述硬硅钙石以硝酸钙和硅酸钠为原料，采用水热法合成。
38.在一个更为具体的实施方式中，所述硝酸钙和硅酸钠的摩尔比为(0.9～1.2):1，如具体为1：1。
39.在一个具体的实施方式中，所述锶掺杂硬硅钙石以硝酸锶、硝酸钙和硅酸钠为原料，采用水热法合成。
40.在一个更为具体的实施方式中，所述硝酸锶、硝酸钙和硅酸钠的摩尔比为1：(3～4)：(4～5)，如具体为1：4：5。
41.在一个具体的实施方式中，水热温度为180～200℃，水热处理时间为24～48h。
42.在一个更为具体的实施方式中，水热温度为200℃，水热处理时间为24h。
43.在一个具体的实施方式中，水热反应后，还包括后处理，所述后处理包括洗涤、干燥。
44.在一个具体的实施方式中，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)。lap是一种蓝光引发剂，应用于生物墨水中，可采用蓝光实现光固化，相对于紫外光固化，更为安全，不会损伤细胞。
45.本发明实施例还提供了一种生物墨水的具体的制备方法，将甲基丙烯酸化明胶、光引发剂和生物陶瓷纳米纤维均匀分散于分散剂中，制得所述生物墨水。
46.在一个具体的实施方式中，先将甲基丙烯酸化明胶和光引发剂均匀分散于分散剂中，然后再加入生物陶瓷纳米纤维。
47.在一个具体的实施方式中，分散过程中体系温度为35～40℃，如具体为35℃，37
℃，40℃。
48.本发明实施例还提供了一种生物墨水在制备用于修复骨缺损的药物或医疗器械中
·
的应用。
49.本发明实施例还提供了一种3d生物打印骨再生修复体的方法，构建骨再生修复体三维模型，将生物墨水与种子细胞混合后作为打印原料进行3d生物打印，光固化后形成骨再生修复体。通过将得到的骨再生修复体填充在骨缺损处，分层缝合骨膜及皮肤，从而促进骨缺损再生。当骨修复体中的种子细胞在生物墨水的刺激下成骨分化，分泌骨基质，从而促进骨缺损的再生。
50.在一个具体的实施方式中，3d生物打印采用微挤出式生物打印机。
51.在一个具体的实施方式中，采用波长为365～405nm的蓝光进行光固化。采用蓝光实现光固化，相对于紫外光固化，更为安全，不会损伤细胞。
52.在一个具体的实施方式中，光固化时间为50～60s。
53.在一个具体的实施方式中，所述种子细胞为成体细胞或干细胞。
54.在一个具体的实施方式中，所述种子细胞在生物墨水中的加入量为106～107个/ml。
55.在一个具体的实施方式中，3d生物打印的气压为0.1～0.2mpa。
56.在一个具体的实施方式中，3d生物打印的速度为6～12mm/s。
57.本发明实施例还提供了一种采用上述方法得到的骨再生修复体。
58.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
59.本技术以下各实施例中，每升无菌培养基中包括如下组分：100ml胎牛血清、10ml青霉素链霉素溶液和890ml最低基本培养基(mem，购买自gibco公司)。
60.磷酸缓冲液(pbs)中各组分浓度为：38g/l磷酸二氢钠和5.04g/l磷酸氢二钠，所述磷酸缓冲液的溶剂为水。
61.本技术以下实施例中，所述硬硅钙石(csh)直径为10～30nm，长度为0.1～2μm，采用如下方法制得：
62.1)将118.075g四水硝酸钙溶解于1l去离子水中制备0.5m的硝酸钙溶液；
63.2)将142.1g九水硅酸钠溶解于1l去离子中得到0.5m的硅酸钠溶液；
64.3)室温搅拌条件下，将硝酸钙溶液缓慢滴加入硅酸钠溶液中，滴加完毕后，将其转移至内衬为聚四氟乙烯的不锈钢水热釜中，200℃水热处理24小时；将白色沉淀物过滤，并分别用去离子和无水乙醇清洗三遍。在真空干燥箱内180℃干燥24小时后，得到的白色粉末即为硬硅钙石(csh)。
65.本技术以下实施例中，所述锶掺杂硬硅钙石(sr-csh)直径为10～30nm，长度为0.1～2μm，采用如下方法制得：
66.1)将10.5815g硝酸锶和106.2675g四水硝酸钙溶解于1l去离子水中，得到0.5m的混合溶液；
67.2)将142.1g九水硅酸钠溶解于1l去离子中得到0.5m的硅酸钠溶液；
68.3)室温搅拌条件下，将混合溶液缓慢滴加入硅酸钠溶液中，滴加完毕后，将其转移至内衬为聚四氟乙烯的不锈钢水热釜中，200℃水热处理24小时；将白色沉淀物过滤，并分
别用去离子和无水乙醇清洗三遍。在真空干燥箱内180℃干燥24小时后，得到的白色粉末即为锶掺杂硬硅钙石(sr-csh)。
69.实施例1
70.本实施例中提供了一种生物墨水，以分散剂总体积为基准，所述生物墨水包括以下浓度的组分：甲基丙烯酸化明胶100g/l，光引发剂5g/l，生物陶瓷纳米纤维5g/l，所述分散剂为无菌培养基，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)，所述生物陶瓷纳米纤维为sr-csh。
71.本实施例中提供了一种生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
72.1)称取1g的gelma和0.05g光引发剂(lap)溶于10ml无菌培养基中，在37℃下磁力搅拌2小时；
73.2)称取0.05g的sr-csh，加入到上述混合溶液中，在37℃下磁力搅拌2小时，混合均匀后制成生物墨水。
74.本实施例中还提供了一种3d生物打印骨再生修复体的方法，构建骨再生修复体三维模型，将上述生物墨水与骨髓间充质干细胞(2
×
106个/ml)混合后作为打印原料进行3d生物打印，打印气压为0.18mpa，打印速度为8mm/s，405nm蓝光固化60s后，获得骨再生修复体。
75.利用流变仪(mars40，thermo fisher，美国)，将本实施例制得的生物墨水置于椎板夹具，在剪切速率区间为0.001～100s-1
进行实验，检测不同剪切速率下生物墨水的粘度。结果如图1所示，本实施例中的生物墨水的、粘度随着剪切速率的增高而降低，具有剪切稀化的性能，能满足微挤出式打印过程中保护细胞并快速成型。
76.对本实施例获得的骨再生修复体内骨髓间充质干细胞活性进行检测。具体操作如下：利用活死细胞染色试剂盒对活细胞和死细胞进行染色，在荧光显微镜下进行观察。结果如图2所示，本实施例中的3d生物打印骨再生修复体内bmscs表现出良好的细胞生存率，体现了生物墨水的生物安全性。
77.以纯gelma水凝胶为生物墨水作为对照组，利用碱性磷酸酶染色试剂盒对本实施例的骨再生修复体内细胞碱性磷酸酶进行染色，在体视镜下进行观察。结果如图3所示，本实施例的骨再生修复体内骨髓间充质干细胞表现出较高的碱性磷酸酶活性，证明了其具有成骨分化能力。
78.将本实施例中获得的骨再生修复体进行体内成骨实验，以纯gelma水凝胶为生物墨水作为对照组，空白组不做任何处理。
79.体内成骨实验中采用的模型为：成年sd大鼠，体重为200～250克，雄性。
80.大鼠被随机分成3组，每组数量为3，分别对应空白组、对照组和实验组
81.在大鼠颅顶制备两个对称的直径为5毫米的缺损，将骨再生修复体植入骨缺损处，以纯gelma水凝胶为生物墨水作为对照组，空白组不做任何处理。分层缝合肌层及皮肤。
82.在8周取材，采用micro-ct测试各组的新骨量，实验结果如图4和图5所示：采用本技术实施例生物墨水制备的骨再生修复体的实验组具有更高的新骨量，而对照组和空白组的新骨量非常有限，由此效果可以明显看出，采用本技术中的生物墨水制备的骨再生修复体可以显著促进骨再生。
83.实施例2-5
84.实施例2-5与实施例1的区别在于，生物墨水的配方不同，具体参照表1，其余工艺完全相同。
85.表1.实施例1-5的生物墨水的配方表
[0086][0087]
实施例2-5中生物墨水及骨再生修复体的性能与实施例1相当，在此不再赘述。
[0088]
综上所述，本发明通过生物陶瓷纳米纤维改性gelma获得生物墨水，该生物墨水具有良好的骨诱导能力，能支持种子细胞的体内外生长及成骨分化，从而促进骨缺损区域的骨再生；该生物墨水具有剪切稀化的性能，能满足微挤出式打印过程中保护细胞并快速成型，工艺简单易行且易于推广。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0089]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

技术特征：
1.一种生物墨水，其特征在于，以分散剂总体积为基准，所述生物墨水包括以下浓度的组分：甲基丙烯酸化明胶50～150g/l，光引发剂2.5～10g/l，生物陶瓷纳米纤维5～10g/l，所述分散剂为培养基或磷酸缓冲液。2.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于：所述生物陶瓷纳米纤维的直径为10～30nm，长度为0.1～2.0μm。3.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于：所述生物陶瓷纳米纤维为硬硅钙石或锶掺杂硬硅钙石。4.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于：所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。5.一种如权利要求1-3任一所述的生物墨水的制备方法，其特征在于：将甲基丙烯酸化明胶、光引发剂和生物陶瓷纳米纤维均匀分散于分散剂中，制得所述生物墨水。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：先将甲基丙烯酸化明胶和光引发剂均匀分散于分散剂中，然后再加入生物陶瓷纳米纤维；和/或，分散过程中体系温度为35～40℃。7.一种如权利要求1-3任一所述的生物墨水在制备用于修复骨缺损的药物或医疗器械中的应用。8.一种3d生物打印骨再生修复体的方法，其特征在于：构建骨再生修复体三维模型，将如权利要求1-3任一所述的生物墨水与种子细胞混合后作为打印原料进行3d生物打印，光固化后形成骨再生修复体。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：采用波长为365～405nm的蓝光进行光固化；和/或，所述种子细胞为成体细胞或干细胞；和/或，所述种子细胞在生物墨水中的加入量为106～107个/ml；和/或，3d生物打印的气压为0.1～0.2mpa；和/或，3d生物打印的速度为6～12mm/s。10.一种采用如权利要求8或9所述的方法得到的骨再生修复体。

技术总结
本发明提供一种生物墨水及其制备方法、应用，以分散剂总体积为基准，所述生物墨水包括以下浓度的组分：甲基丙烯酸化明胶50～150g/L，光引发剂2.5～10g/L，生物陶瓷纳米纤维5～10g/L，所述分散剂为培养基或磷酸缓冲液。本发明通过生物陶瓷纳米纤维改性GelMA获得生物墨水，该生物墨水具有良好的骨诱导能力，能支持种子细胞的体内外生长及成骨分化，从而促进骨缺损区域的骨再生；该生物墨水具有剪切稀化的性能，能满足微挤出式打印过程中保护细胞并快速成型，工艺简单易行且易于推广。工艺简单易行且易于推广。工艺简单易行且易于推广。


技术研发人员：林开利 余幸鸽 王旭东 李得见
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属第九人民医院
技术研发日：2022.03.02
技术公布日：2023/9/13