一种人血浆中布立西坦的UPLC-MS/MS检测方法与流程

一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法
技术领域
1.本技术涉及生物分析技术领域，具体涉及一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法。


背景技术：

2.布立西坦，又名左乙拉西坦的衍生物。布立西坦能够与中枢突触囊泡蛋白2a（sv2a）进行较强的选择性、可逆性结合，通过影响突触功能发挥抗癫痫左乙；以及抑制电压依赖性钠离子通道，减少痫性放电的持续时间和频率，从而减少癫痫的发作。
3.目前，国内尚未有报道过受试者体内布立西坦的定量检测技术以及在临床一期生物等效性试验的应用，国外文献报道的方法均为液液萃取或固相萃取技术，费时费力，操作麻烦，实用性较差。为加速我国仿制药的研究和发展，并解决我国目前药品短缺的局面，亟需建立一种高灵敏、高通量的布立西坦定量分析方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，通过蛋白沉淀的样品处理方式从人血浆中提取布立西坦，将提取过的样品进行液质联用分析，解决了现有技术中采用液液萃取或固相萃取技术，费时费力，操作麻烦，实用性较差的问题。
5.为解决上述技术问题，本发明采用了以下方案：一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，将待测人血浆样品通过蛋白沉淀法处理后，采用含甲酸的流动相进行uplc-ms/ms分析测定。
6.进一步地，流动相体系中含有甲酸，尝试加入不同浓度甲酸，在保证杂质峰不影响主峰的前提下，进一步优选含甲酸的体积为流动相总体积的0.1%，使质谱离子化效率提高。
7.优选地，流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为含0.1%甲酸的水溶液，流动相b为含0.1%甲酸的甲醇溶液。
8.进一步地，流动相有机相为甲醇体系，优化过程中发现若流动相采用乙腈在色谱柱上保留过弱，并且响应也有所降低，因而排除乙腈使用甲醇。
9.优选地，包括以下步骤：s1，配制布立西坦标准曲线工作溶液、质控工作溶液、内标工作溶液，进而配制标准曲线样品、质控样品；s2，取等体积标准曲线样品、质控样品、待测人血浆样品，加入内标工作溶液混匀；取空白血浆，加入50%甲醇溶液，再加入甲醇沉淀蛋白，旋涡后离心取上清液；s3，在步骤s2的上清液中加入体积比为36:64的甲醇-水溶液稀释，涡旋摇匀后使用uplc-ms/ms测定，以布立西坦与内标布立西坦的峰面积比作为纵坐标，以标准曲线样品中待测物的浓度为横坐标制作标准曲线，并进行线性回归；s4，将经步骤s2处理后的待测人血浆样品，按照步骤s3所得的标准曲线方程计算，得到待测人血浆样品中布立西坦的浓度。
10.优选地，配制标准工作溶液的步骤为：称取布立西坦对照品，加入甲醇溶解，配制成浓度为1.000mg/ml的布立西坦储备液，至少配制两份储备液，一份作为标准曲线储备液，一份作为质控储备液；将布立西坦标准曲线储备液用体积比为50:50的甲醇-水溶液进行稀释，稀释成梯度为400.000~36000.000 ng/ml标准曲线工作溶液；将布立西坦质控储备液用体积比为50:50的甲醇-水溶液进行稀释，稀释成梯度为400.000~24000.000ng/ml质控工作溶液；在内标中，加入甲醇配制成浓度为1.000 mg/ml的内标储备液，将内标储备液用体积比50:50的甲醇-水溶液进行稀释，稀释成800.000ng/ml的内标工作溶液，所有储备液、工作液分装后均在
‐
20℃保存备用；取健康人空白血浆，分别加入上述布立西坦工作溶液，涡旋混匀，配制成浓度范围为20.000~1800.000ng/ml的标准曲线样品以及浓度范围为20.000~1200.000 ng/ml的质控样品。
11.优选地，所述布立西坦工作溶液浓度为400.000 ng/ml、1000.000 ng/ml、2000.000 ng/ml、4000.000 ng/ml、8000.000 ng/ml、16000.000ng/ml、30000.000 ng/ml和36000.000 ng/ml；所述布立西坦质控工作溶液浓度为：400.000 ng/ml、1200.000 ng/ml、3600.000 ng/ml、12000.000ng/ml、24000.000 ng/ml；校正标样和所述质控样品为新鲜配制；所述校正标样的浓度为：20.000 ng/ml、50.000 ng/ml、100.000 ng/ml、200.000 ng/ml、400.000 ng/ml、800.000ng/ml、1500.000 ng/ml、1800.000 ng/ml；所述质控样品的浓度为：20.000 ng/ml、60.000 ng/ml、180.000 ng/ml、600.000ng/ml、1200.000ng/ml。
12.优选地，所述内标采用布立西坦-d7。
13.优选地，在所述步骤s2中，所述涡旋混匀的时间为5min；所述离心条件为：离心时温度为4℃，离心转速为2120 g，离心时间为10 min。
14.优选地，在步骤s3中，色谱条件为：色谱柱：acquity uplc beh c18，50
×
2.1 mm，填料粒径为1.7 μm；流速0.3 ml/min；柱温：40℃；进样体积：1 μl；自动进样器温度：8℃。
15.优选地，在步骤s3中，质谱条件为：离子源esi源，采用正离子模式、多反应监测mrm模式；电喷雾电压为5500 v；离子源温度为500℃；气帘气为35 psi；碰撞气为9 psi；喷雾气为45 psi；辅助加热气为45 psi。
16.优选地，洗脱设置为：洗脱设置为：体积流量为0.3ml/min；梯度洗脱条件为：在0.00~1.50min，流动相a为60%~5%，流动相b为40%~95%；在1.51min~2.50min，流动相a为5%，流动相b为95%；在2.51min~2.60min，流动相a为5%~60%，流动相b为95%~40%；在2.61min~3.50min，流动相a为60%，流动相b为40%。
17.本发明的有益效果为：1、样品处理优化：本发明中样品处理方法采用蛋白沉淀的方法，回收率接近100%，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率。2、灵敏度高：布立西坦的定量下限为20.000 ng/ml。3、专属性强：采用布立西坦-d7为同位素内标，与布立西坦色谱保留完全一致，减小了基质效应对检测结果的影响。4、稳定性好：工作液与血浆样品在室温和-20℃条件下放置均稳定。
附图说明
18.图1为布立西坦[m+h]
+
的产物离子扫描图；图2为布立西坦-d7[m+h]
+
的产物离子扫描图；图3为空白血浆样品中布立西坦的典型色谱图；图4为定量下限样品中布立西坦的典型色谱图；图5为空白血浆样品中布立西坦-d7的典型色谱图；图6为定量下限样品中布立西坦-d7的典型色谱图。
具体实施方式
[0019]
为了更清楚地展现本发明地目的、技术方案和优点，下面将结合实施例对本技术作进一步说明。
[0020]
实施例1本发明的实施例1为一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，如图1和图2所示，包括以下步骤：1、溶液及样品的配制1.1标准系列样品：精密称取布立西坦标准品，经过折算，加入一定体积的甲醇溶解并定容，配制成浓度为1.000 mg/ml的布立西坦储备液，至少配制两份标准品储备液，一份作为标准曲线储备液，一份作为质控储备液，将布立西坦标准曲线储备液用空白溶剂（体积比为50:50的甲醇-水溶液）进行稀释，稀释成梯度为400.000~36000.000ng/ml标准曲线工作溶液，用于绘制标准曲线。
[0021]
1.2质控样品：将标准系列样品中配制得到的布立西坦质控储备液用空白溶剂（体积比为50:50的甲醇-水溶液）进行稀释，稀释成梯度为400.000~24000.000 ng/ml质控工作溶液。
[0022]
1.3内标溶液：精密称取适量的布立西坦-d7标准品，加入一定体积的甲醇配制成浓度为1.000 mg/ml的内标储备液，将内标储备液用体空白溶剂（体积比为50:50的甲醇-水溶液）进行稀释，稀释成800.000 ng/ml的内标工作溶液。
[0023]
1.4布立西坦标准曲线工作溶液和质控工作溶液的配制过程：分别见表1和表2。
[0024]
表1 布立西坦标准曲线工作溶液的配制
表2 布立西坦质控工作溶液的配制1.5校准曲线样品与质控样品：在190 μl的空白血浆中加入10 μl对应的工作溶液（标准曲线工作溶液或质控工作溶液）混合均匀。配制体积可根据实际情况按比例适当调整。配制含布立西坦的标样的浓度为:20.000 ng/ml、50.000 ng/ml、100.000 ng/ml、200.000ng/ml、400.000 ng/ml、800.000 ng/ml、1500.000 ng/ml、1800.000 ng/ml；所述质控样品的浓度为:20.000 ng/ml、60.000ng/ml、180.000 ng/ml、600.000 ng/ml、1200.000 ng/ml。
[0025]
2、 样品前处理将室温下解冻的样品或新配制的样品，涡旋混匀，在96孔板的孔中加入标准曲线样品、质控样品、待测样品各40.0 μl，再加入20.0 μl内标工作溶液混匀；取空白血浆样品40.0 μl加入20.0 μl 50%甲醇样品，每个样品孔中加入380 μl甲醇沉淀蛋白，涡旋后离心10 min，所述离心条件为：离心时温度为4℃，离心转速为2120 g，离心时间为10 min。离心结束后取40 μl上清液，用500 μl甲醇：水（36:64，v/v）稀释，涡旋摇匀后进行uplc-ms/ms测定。
[0026]
3、检测仪器及分析条件3.1药品及试剂：布立西坦（tlc）;布立西坦-d7(tlc);甲醇（lcms;fisher）;甲酸（lcms;fisher）。
[0027]
3.2主要设备仪器lc-30ad超高效液相色谱仪；tq5500三重四级杆质谱仪。
[0028]
3.3分析条件3.3.1色谱条件：色谱柱为acquityuplcbehc18（50
×
2.1mm，1.7μm）；流动相a：(水/甲酸=100/0.1)，流动相b：(甲醇/甲酸=100/0.1)；柱温箱温度：40℃；流速：0.3ml/min；进样体积1ul；自动进样器清洗溶液为：甲醇/水=80/20；自动进样针清洗时浸泡时间为2s；自动进样器清洗模式：进样前和进样后清洗；样品盘温度为8℃；洗脱程序设置如表3所示。
[0029]
表3洗脱程序参数设置3.3.2质谱条件：离子源为esi源，采用正离子模式、多反应监测(mrm)模式；电喷雾电压为5500v；离子源温度为500℃；气帘气为35psi；碰撞气为9psi；喷雾气为45psi；辅助加热气为45psi；质谱mrm参数设置如表4所示。
[0030]
表4质谱mrm参数设置实施例2本发明的实施例2为本发明检测方法的方法学验证。
[0031]
1、选择性取6个不同来源的空白血浆40μl(n=3)，分别用实施例1中的方法处理样品，取（不加内标）样品进行质谱分析，获得空白血浆样品色谱图。取6个不同来源的空白血浆（n=3）分
μl低浓度（1200.000 ng/ml）、中浓度（12000.000 ng/ml）、高浓度（24000.000 ng/ml）质控工作溶液，涡旋振摇混匀。取40 μl混合液（n=3），加入20 μl内标工作溶液（800.000 ng/ml），混匀后加入380 μl提取后的空白基质上清液，混匀。在4℃下低温离心10min，离心力为2120 g。
[0039]
参比样品（标样溶液）预处理：取10 μl低浓度（1200.000 ng/ml）、中浓度（12000.000 ng/ml）、高浓度（24000.000 ng/ml）质控工作溶液，加入100 μl内标工作液，加入1900 μl甲醇，加入190 μl超纯水，混匀。
[0040]
取500 μl 36%甲醇溶液至一新的96孔板中，分别加入基质效应样品上清液和参比样品溶液40 μl至相应孔位中，涡旋混匀。
[0041]
布立西坦的内标归一化基质效应因子均值为hqc 1.032、mqc 1.025、lqc 1.045；内标归一化基质效应因子变异系数分别为hqc0.70%、mqc 0.84%、lqc 1.42%。表明在本试验条件下，可以忽略基质效应对布立西坦测定的影响。
[0042]
5、残留布立西坦残留：不大于lloq样品待测物平均响应的3.39%；布立西坦-d7残留：不大于lloq样品内标平均响应的0.10%。
[0043]
6、待测物与内标的相互干扰当bri以uloq浓度单独添加至样品时（未添加内标），样品内标响应最大值为该批次标准曲线lloq样品内标平均响应值的0.02%，证明待测物对内标物质测定无干扰。当bri-d7以方法规定的浓度添加至样品时（未添加待测物），待测物响应最大值为该批次标准曲线lloq样品待测物平均响应值的4.84%，证明内标物质对待测物的测定无干扰。
[0044]
7、稳定性验证结果如表6所示。
[0045]
表6 稳定性验证结果
上述实验结果表明：本发明的方法经过方法学验证，建立的方法灵敏度高、选择性好、准确、精密、稳定性好，线性良好。
[0046]
综上实施例的结果表明:本发明的方法通过蛋白沉淀的方法提取布立西坦，可以
实现对血浆中布立西坦的快速、高灵敏的检测,可以应用于布立西坦药代动力学与生物等效性的研究。
[0047]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

技术特征：
1.一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，其特征在于，将待测人血浆样品通过蛋白沉淀法处理后，采用含甲酸的流动相进行uplc-ms/ms分析测定。2.根据权利要求1所述的一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，其特征在于，流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为含0.1%甲酸的水溶液，流动相b为含0.1%甲酸的甲醇溶液。3.根据权利要求1所述的一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，配制布立西坦标准曲线工作溶液、质控工作溶液、内标工作溶液，进而配制标准曲线样品、质控样品；s2，取等体积标准曲线样品、质控样品、待测人血浆样品，加入内标工作溶液混匀；取空白人血浆样品，加入50% 甲醇溶液，样品再加入甲醇沉淀蛋白，涡旋后离心取上清液；s3，在步骤s2的上清液中加入体积比为36:64的甲醇-水溶液稀释，涡旋摇匀后使用uplc-ms/ms测定，以布立西坦与内标的峰面积比作为纵坐标，以标准曲线样品中待测物的浓度为横坐标制作标准曲线，并进行线性回归；s4，将经步骤s2处理后的待测人血浆样品，按照步骤s3所得的标准曲线方程计算，得到待测人血浆样品中布立西坦的浓度。4.根据权利要求3所述的一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，其特征在于，配制标准工作溶液的步骤为：称取布立西坦对照品，加入甲醇溶解，配制成浓度为1.000mg/ml的布立西坦储备液，至少配制两份储备液，一份作为标准曲线储备液，一份作为质控储备液；将布立西坦标准曲线储备液用体积比为50:50的甲醇-水溶液进行稀释，稀释成梯度为400.000~36000.000 ng/ml标准曲线工作溶液；将布立西坦质控储备液用体积比为50:50的甲醇-水溶液进行稀释，稀释成梯度为400.000~24000.000 ng/ml质控工作溶液；在内标中，加入甲醇配制成浓度为1.000 mg/ml的内标储备液，将内标储备液用体积比50:50的甲醇-水溶液进行稀释，稀释成800.000ng/ml的内标工作溶液，所有储备液、工作液分装后均在
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20℃保存备用；取健康人空白血浆，分别加入布立西坦工作溶液，涡旋混匀，配制成浓度范围为20.000~1800.000ng/ml的标准曲线样品以及浓度范围为20.000~1200.000 ng/ml的质控样品。5.根据权利要求4所述的一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，其特征在于，所述布立西坦工作溶液浓度为400.000 ng/ml、1000.000 ng/ml、2000.000 ng/ml、4000.000 ng/ml、8000.000 ng/ml、16000.000 ng/ml、30000.000 ng/ml和36000.000 ng/ml；所述布立西坦质控工作溶液浓度为：400.000 ng/ml、1200.000 ng/ml、3600.000 ng/ml、12000.000 ng/ml、24000.000 ng/ml；校正标样和所述质控样品为新鲜配制；所述校正标样的浓度为：20.000 ng/ml、50.000 ng/ml、100.000 ng/ml、200.000 ng/ml、400.000 ng/ml、800.000 ng/ml、1500.000 ng/ml、1800.000 ng/ml；所述质控样品的浓度为：20.000 ng/ml、60.000 ng/ml、180.000 ng/ml、600.000 ng/ml、1200.000ng/ml。6.根据权利要求4所述的一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，其特征在于，所述内标采用布立西坦-d7。7.根据权利要求3所述的一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，其特征在于，在所述步骤s2中，所述涡旋混匀的时间为5 min；所述离心条件为：离心时温度为4℃，离心
转速为2120 g，离心时间为10 min。8.根据权利要求3所述的一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，其特征在于，在步骤s3中，色谱条件为：色谱柱：acquity uplc beh c18，50
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2.1 mm，填料粒径为1.7 μm；流速0.3 ml/min；柱温：40℃；进样体积：1 μl；自动进样器温度：8℃。9.根据权利要求3所述的一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，其特征在于，在步骤s3中，质谱条件为：离子源esi源，采用正离子模式、多反应监测mrm模式；电喷雾电压为5500 v；离子源温度为500℃；气帘气为35 psi；碰撞气为9 psi；喷雾气为45 psi；辅助加热气为45 psi。10.根据权利要求8所述的一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法，其特征在于，洗脱设置为：体积流量为0.3ml/min；梯度洗脱条件为：在0.00~1.50min，流动相a为60%~5%，流动相b为40%~95%；在1.51min~2.50min，流动相a为5%，流动相b为95%；在2.51min~2.60min，流动相a为5%~60%，流动相b为95%~40%；在2.61min~3.50min，流动相a为60%，流动相b为40%。

技术总结
本申请涉及生物分析技术领域，具体涉及一种人血浆中布立西坦的UPLC-MS/MS检测方法。本发明公开了一种人血浆中布立西坦的UPLC-MS/MS检测方法，将待测人血浆样品通过蛋白沉淀法处理后，采用含甲酸的流动相进行UPLC-MS/MS分析测定。优选地，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的甲醇溶液。本发明中样品处理方法采用蛋白沉淀的方法，回收率接近100%，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率；灵敏度高、专属性强、稳定性好。稳定性好。稳定性好。


技术研发人员：徐新颖 吴强 石玲子 刘娟
受保护的技术使用者：四川省药品检验研究院（四川省医疗器械检测中心）
技术研发日：2023.08.16
技术公布日：2023/9/13