一种桑葚结合态多酚及其提取方法和应用

1.本发明涉及多酚提取技术领域，具体涉及一种桑葚结合态多酚及其提取方法和应用。


背景技术：

2.桑葚，又名桑葚子，是桑科植物桑(拉丁名：morus alba l.)的果穗。桑葚在我国已有几千年的食用和药用历史，有“民间圣果”的美誉。《本草纲目》记载其具有“利五脏关节，通血气；令人聪明，变白不老”之功效。桑葚是一种经典的药食同源类植物。现代营养学研究表明，桑葚富含多种生物活性成分，如维生素、脂肪酸、矿物质、多酚以及多糖等。流行病学研究表明，桑葚可降低心血管疾病、糖尿病和癌症等慢性疾病的发病风险。
3.桑葚含有大量且种类丰富的多酚类化合物，可达(1515.9
±
5.7mg gae/100g)鲜重，是所有深色水果中多酚含量最高的。桑葚多酚具有抗氧化、抗炎、调节免疫的功能，对于动脉粥样硬化、神经退行性疾病、糖尿病、肿瘤等都有预防保健作用。目前研究较多的为桑葚游离态多酚，对结合态多酚及其应用则鲜有报道。


技术实现要素：

4.为从桑葚中提取结合态多酚，本发明提供了一种桑葚结合态多酚及其提取方法和应用，本发明提取获得的桑葚结合态多酚能够明显抑制多种癌细胞的增殖，对正常乳腺上皮细胞、肝细胞生长均无明显影响，具有制备抗肿瘤药物的潜力。本发明提供的桑葚结合态多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抗菌活性，能用于抗菌产品的制备。
5.本发明提供了一种桑葚结合态多酚的提取方法，包括如下步骤：
6.s1，按照料液比1g：8-12ml将桑葚粉末和丙酮溶液混匀，离心弃上清，保留沉淀；
7.s2，s1中离心所得沉淀用naoh溶液水解，盐酸中和至中性，得中性溶液；
8.s3，将s2获得的中性溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，然后减压旋蒸去除有机溶剂，即获得桑葚结合态多酚粗提取物，纯化后获得桑葚结合态多酚。
9.进一步地，s1中，所述桑葚粉末制备过程为：将桑葚果实粉碎冻干、研磨粉碎后过筛，获得桑葚粉末。
10.进一步地，s1中，所述桑葚粉末和丙酮溶液的料液比为1g：10ml。
11.进一步地，s2中，所述naoh溶液的物质的量浓度为1.6-2mol/l。
12.进一步地，s2中，盐酸中和步骤在液氮保护下进行，避免结合态多酚变性。
13.进一步地，s3中，利用大孔树脂d101进行纯化。
14.本发明还提供了由上述方法提取获得的桑葚结合态多酚。
15.本发明还提供了所述的桑葚结合态多酚在制备抗肿瘤药物中的应用，所述桑葚结合态多酚能够抑制肿瘤细胞增殖和活力。
16.进一步地，所述肿瘤细胞包括人肺癌细胞、肝癌细胞和乳腺癌细胞。
17.本发明还提供了一种所述桑葚结合态多酚在制备抑菌剂中的应用，所述桑葚结合
态多酚能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
18.进一步地，所述桑葚结合态多酚对大肠杆菌的mic为2.5mg/ml，对金黄色葡萄球菌的mic为10mg/ml。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
20.1、本发明以桑葚果实为实验材料，提取获得的结合态多酚能够明显抑制多种癌细胞的增殖，对正常乳腺上皮细胞、肝细胞均无明显影响，因此，本发明制备得到的结合态多酚有制备抗肿瘤药物的潜力，为抗癌药物和保健食品的开发奠定了物质基础。
21.2、本发明提取得到的桑葚结合态多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有显著的抗菌活性，能够应用于抑菌剂和抗菌药物的制备。
22.3、本发明提取获得的桑葚结合态多酚兼具抗肿瘤及抗菌活性，可促进桑葚资源的深度开发和利用。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为本发明实施例1制备得到的桑葚结合态多酚样品外观图。
25.图2为桑葚结合态多酚对不同肿瘤细胞活力的影响。
26.图3为桑葚结合态多酚对不同肿瘤细胞增殖影响的细胞成像。
27.图4为桑葚结合态多酚对不同肿瘤细胞增殖影响的统计图。
28.图5为桑葚结合态多酚对正常细胞的影响；
29.图中，a为桑葚结合态多酚对正常乳腺上皮细胞mcf-10a活力的影响；
30.b为桑葚结合态多酚对正常肝细胞hl7702活力的影响。
31.图6为不同树脂纯化对桑葚结合态多酚抗肿瘤活性的影响。
具体实施方式
32.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.实施例1：一种桑葚结合态多酚及其提取方法。
34.一、实验材料
35.桑葚果实购买自阿里健康大药房。
36.二、实验方法
37.1、桑葚结合态多酚的提取
38.(1)桑葚果实加入液氮冻干，在低温状态下用研磨仪研磨至粉碎，过200目筛获得桑葚粉末。
39.(2)按照料液比1g：10ml将桑葚粉末与体积分数80％丙酮溶液混合摇匀1h，4500rpm离心15min，取上清液；重复提取三次后合并上清液，减压浓缩回收有机溶剂，弃掉含有自由态多酚的上清，保留含有结合态多酚的沉淀。
40.(3)按照用量比1g:10ml在沉淀中加入2mol/l naoh溶液水解，在液氮保护下搅拌1h，然后少量多次缓慢加质量分数为37％的盐酸中和至中性，即得中性溶液。
41.(4)萃取：按照体积比1:1在中性溶液中加入乙酸乙酯，反复萃取5次，减压旋蒸去除有机溶剂，即获得桑葚结合态多酚粗提取物。
42.(5)将桑葚结合态多酚粗提取物经d101大孔树脂纯化，用95％乙醇洗脱，洗脱液真空干燥，即得到桑葚结合态多酚。
43.2、桑葚结合态多酚对不同肿瘤细胞活力的影响
44.选取对数生长期的mcf-7、a549、h1299、hepg2及mda-mb-231细胞，调整细胞密度为每孔8
×
104个/ml，每孔加入100μl至96孔培养板中，于37℃、5％co2培养箱中过夜培养。待细胞贴壁后取出培养板，更换含不同浓度(0、10、15、20、30、50μg/ml)桑葚结合态多酚的培养基，设5个平行孔。继续培养48h后，吸弃孔内液体，pbs洗涤后加入新培养基，每孔加mtt溶液(5mg/ml)20μl，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μl dmso，振荡10min，使结晶物充分融解。490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。
45.3、桑葚结合态多酚抑制肿瘤细胞增殖
46.将长势良好的hepg2和mcf-7细胞以8
×
103个/孔密度接种在96孔板内。待细胞贴壁，加入桑葚结合态多酚处理细胞24h。用细胞培养基按比例(1000:1)稀释edu溶液，每孔加入稀释液100μl，37℃co2培养箱中孵育2h。弃培养液，pbs洗涤，加入适量细胞染色固定液室温孵育30min，弃固定液。
47.每孔加入50μl 2mg/ml甘氨酸，摇床孵育5min，弃液，pbs洗涤。每孔加入100μl 1
×
apollo染色反应液，避光于室温于摇床上孵育30min，弃液，加入100μl含0.5％tritonx-100的pbs洗涤3次。每孔加入dapi工作液50μl，摇床孵育10min，弃液，pbs洗涤。荧光显微镜下观察、拍照。
48.4、桑葚结合态多酚对正常乳腺上皮细胞、肝细胞生长的影响
49.选取对数生长期的正常人乳腺上皮细胞mcf-10a和人干细胞hl7702，调整细胞密度为每孔8
×
104个/ml，每孔加入100μl至96孔培养板中，于37℃、5％co2培养箱中过夜培养。待细胞贴壁后取出培养板，更换含不同浓度(0、10、15、20、30、50μg/ml)桑葚结合态多酚的培养基，设5个平行孔。继续培养48h后，吸弃孔内液体，pbs洗涤后加入新培养基，每孔加mtt溶液(5mg/ml)20μl，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μl dmso，振荡10min，使结晶物充分融解。490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。
50.5、桑葚结合态多酚抗菌活性研究
51.(1)抑菌圈实验
52.将获得的桑葚结合态多酚用无菌水配制成100mg
·
ml-1
桑葚结合态多酚溶液，将滤纸片置于100mg
·
ml-1
桑葚结合态多酚溶液中浸泡30min，分别取200μl大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液均匀涂布于lb固体培养基平板上，晾5min后，将浸泡后的滤纸片置于涂布有菌液的lb固体培养基表面，以无菌水浸泡的滤纸片为空白对照，置于37℃恒温培养箱培养24h。
53.(2)最低抑菌浓度(mic)测定
54.菌悬液制备：将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌在lb固体培养基平板上活化，挑取单菌落至100ml lb液体培养基中，于37℃、150r/min振荡培养24h，获得菌悬液。
55.用lb培养基调整桑葚结合态多酚终质量浓度为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.312mg/ml，每管加入大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌悬液500μl，lb培养基中加入无菌水作为空白对照，不加入桑葚结合态多酚的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌作为阴性对照。37℃、150r/min振荡培养24h后，记录明显抑制大肠杆菌或金黄色葡萄球菌生长所需的最低桑葚结合态多酚质量浓度作为mic。
56.三、实验结果
57.1、制备得到的桑葚结合态多酚样品外观如图1所示。
58.2、桑葚结合态多酚对不同肿瘤细胞活力的影响
59.结果如图2所示，cck-8实验表明，本发明制备得到的桑葚结合态多酚对乳腺癌细胞mcf-7、肝癌细胞hepg2、肺癌细胞a549、肺癌细胞h1299和乳腺癌细胞mda-mb-231的细胞活力均有显著的抑制作用。
60.3、桑葚结合态多酚对肿瘤细胞增殖的影响
61.结果如图3和图4所示，edu实验进一步显示，桑葚果结合态多酚明显抑制了肝癌以及乳腺癌细胞的增殖。
62.4、桑葚结合态多酚对正常乳腺上皮细胞、肝细胞生长的影响
63.如图5所示，桑葚结合态多酚对正常乳腺上皮细胞mcf-10a和肝细胞hl7702的生长无显著影响。
64.5、桑葚结合态多酚抗菌活性研究
65.表1实施例1提取的桑葚结合态多酚的抑菌作用
[0066][0067]
表2桑葚结合态多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(mic)
[0068][0069][0070]
注：—表示无菌落生成，+表示有菌落生成
[0071]
由表1可以看出，本发明实施例1提取获得的桑葚结合态多酚对大肠杆菌和金黄色
葡萄球菌均具有显著的抗菌活性。
[0072]
由表2可以看出，本发明实施例1制备得到的桑葚结合态多酚对大肠杆菌的mic为2.5mg/ml，对金黄色葡萄球菌的mic为10mg/ml。
[0073]
实施例2：一种桑葚结合态多酚及其提取方法。
[0074]
其余步骤与实施例1基本相同，区别在于：
[0075]
桑葚结合态多酚的提取步骤为：
[0076]
(1)桑葚果实加入液氮冻干，在低温状态下用研磨仪研磨至粉碎，过250目筛获得桑葚粉末。
[0077]
(2)按照料液比1g：8ml将桑葚粉末与体积分数80％丙酮溶液混合摇匀1h，5000rpm离心12min，取上清液；重复提取三次后合并上清液，减压浓缩回收有机溶剂，弃掉含有自由态多酚的上清，保留含有结合态多酚的沉淀。
[0078]
(3)按照用量比1g:11ml在沉淀中加入2mol/l naoh溶液水解，在液氮保护下搅拌1h，然后少量多次缓慢加质量分数为37％的盐酸中和至中性，即得中性溶液。
[0079]
(4)萃取：按照体积比1:1在中性溶液中加入乙酸乙酯，反复萃取5次，减压旋蒸去除有机溶剂，即获得桑葚结合态多酚粗提取物。
[0080]
(5)将桑葚结合态多酚粗提取物经d101大孔树脂纯化，用95％乙醇洗脱，洗脱液真空干燥，即得到桑葚结合态多酚。
[0081]
按照实施例1中的方法步骤研究实施例2制备得到的桑葚结合态多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，结果见表3。
[0082]
表3实施例2制备得到的桑葚结合态多酚的抑菌作用
[0083][0084]
由表3可知，实施例2制备得到的桑葚结合态多酚也能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
[0085]
实施例3：一种桑葚结合态多酚及其提取方法。
[0086]
其余步骤与实施例1基本相同，区别在于：
[0087]
桑葚结合态多酚的提取步骤为：
[0088]
(1)桑葚果实加入液氮冻干，在低温状态下用研磨仪研磨至粉碎，过200目筛获得桑葚粉末。
[0089]
(2)按照料液比1g：12ml将桑葚粉末与体积分数80％丙酮溶液混合摇匀1h，4800rpm离心15min，取上清液；重复提取三次后合并上清液，减压浓缩回收有机溶剂，弃掉含有自由态多酚的上清，保留含有结合态多酚的沉淀。
[0090]
(3)按照用量比1g:12ml在沉淀中加入2mol/l naoh溶液水解，在液氮保护下搅拌1h，然后少量多次缓慢加质量分数为37％的盐酸中和至中性，即得中性溶液。
[0091]
(4)萃取：按照体积比1:1在中性溶液中加入乙酸乙酯，反复萃取5次，减压旋蒸去
除有机溶剂，即获得桑葚结合态多酚粗提取物。
[0092]
(5)将桑葚结合态多酚粗提取物经d101大孔树脂纯化，用95％乙醇洗脱，洗脱液真空干燥，即得到桑葚结合态多酚。
[0093]
按照实施例1中的方法步骤研究实施例3制备得到的桑葚结合态多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，结果见表4。
[0094]
表4实施例3制备得到的桑葚结合态多酚的抑菌作用
[0095][0096]
由表4可知，实施例3制备得到的桑葚结合态多酚也能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
[0097]
实施例4：利用不同树脂纯化对纯化桑葚结合态多酚对抗肿瘤活性的影响。
[0098]
一、实验材料
[0099]
选择大孔树脂类型有ab-8、hpd826、d101和hpd600。
[0100]
二、不同树脂纯化的桑葚结合态多酚对肺癌细胞a549的影响
[0101]
1、大孔树脂预处理：大孔树脂用95％乙醇浸泡过夜充分溶胀后，双蒸水洗涤至无白色浑浊、无醇味，备用；
[0102]
2、经过预处理的大孔树脂(ab-8、hpd826、d101和hpd600)湿法装柱，分别加入桑葚结合态多酚粗提物样品液(实施例1萃取后获得的)，然后进行mfbps的分离纯化，分别获得纯化后的桑葚结合态多酚。
[0103]
分别采用ab-8、hpd826、d101和hpd600树脂纯化的桑葚结合态多酚干预肺癌细胞a549 24h。
[0104]
cck-8实验结果表明，d101纯化的桑葚结合态多酚具有显著抗肿瘤活性，且效果显著优于其他三种树脂纯化的多桑葚结合态多酚(图6)。
[0105]
综上所述，本发明提取获得的桑葚结合态多酚能够明显抑制多种癌细胞的增殖，对正常乳腺上皮细胞、肝细胞均无明显影响，具有制备抗肿瘤药物的潜力。本发明提取获得的桑葚结合态多酚还表现出对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌显著的抗菌活性，能够应用于抑菌剂和抗菌药物的制备。
[0106]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0107]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.一种桑葚结合态多酚的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：s1，按照料液比1g：8-12ml将桑葚粉末与丙酮溶液混匀，离心，弃上清，保留沉淀；s2，s1中的沉淀用naoh溶液水解，盐酸中和得中性溶液；s3，s2获得的中性溶液中加入乙酸乙酯进行萃取，减压旋蒸去除有机溶剂，即获得桑葚结合态多酚粗提取物，纯化后获得桑葚结合态多酚。2.根据权利要求1所述的桑葚结合态多酚的提取方法，其特征在于，s1中，所述桑葚粉末制备过程为：将桑葚果实粉碎冻干、研磨粉碎后过筛，获得桑葚粉末。3.根据权利要求1所述的桑葚结合态多酚的提取方法，其特征在于，s1中，所述桑葚粉末和丙酮溶液的用量比为1g：10ml。4.根据权利要求1所述的桑葚结合态多酚的提取方法，其特征在于，s2中，盐酸中和步骤在液氮保护下进行，避免结合态多酚变性。5.根据权利要求1所述的桑葚结合态多酚的提取方法，其特征在于，s3中，利用大孔树脂d101进行纯化。6.一种由权利要求1所述的方法提取获得的桑葚结合态多酚。7.一种权利要求6所述的桑葚结合态多酚在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述桑葚结合态多酚能够抑制肿瘤细胞增殖和活力。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括人肺癌细胞、肝癌细胞和乳腺癌细胞。9.一种权利要求6所述的桑葚结合态多酚在制备抑菌剂中的应用，其特征在于，所述桑葚结合态多酚能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述桑葚结合态多酚对大肠杆菌的mic为2.5mg/ml，对金黄色葡萄球菌的mic为10mg/ml。

技术总结
本发明涉及多酚提取技术领域，具体公开了一种桑葚结合态多酚及其提取方法和应用，将桑葚果实冻干、粉碎，以1：10(w:v)料液比加入80％丙酮溶液，混匀后离心弃上清，沉淀用NaOH溶液水解，盐酸中和至中性，继续加入乙酸乙酯萃取5次得到桑葚结合态多酚粗提取物，大孔树脂D101纯化后获得桑葚结合态多酚。本发明提取获得的桑葚结合态多酚能明显抑制多种癌细胞的增殖和活力，同时对正常乳腺上皮细胞、肝细胞生长均无明显影响，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抗菌活性，因此在抗肿瘤及抗菌药物制备方面具有应用潜力。面具有应用潜力。面具有应用潜力。


技术研发人员：付荣 杨鹏 王海龙 由玉洁 刘瑞琛
受保护的技术使用者：山西医科大学
技术研发日：2023.07.26
技术公布日：2023/9/13