一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法及用途与流程

1.本发明涉及一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法及用途，属于医药技术领域。


背景技术：

2.水蛭是中国传统的特种药用水生动物，其干制品炮制后入药，在《神农本草经》中已有记载，具有很高的药用价值。《中国药典》2020版列载，水蛭为水蛭科动物蚂蟥(whitmania pigra whitman)、水蛭(hirudo nipponica whitman)或柳叶蚂蟥(whitmania acranulata whitman)的干燥全体，具有治疗中风、高血压、清瘀、闭经、跌打损伤等功效。近年新发现水蛭制剂在防治心脑血管疾病和抗癌方面具有特效。
3.水蛭的主要有效药用成分为大分子类化合物，如水蛭素、肝素、组织胺、吻蛭素以及氨基酸等。其中，水蛭素是目前鉴定出的最强的凝血酶特异性抑制剂，是一种含有65个氨基酸残基的单链多肽。药理学研究表明：水蛭素等多肽类成分具有抗凝血、抗血栓形成、改善血液流变性、脑保护、抗脑缺血、调脂、抗炎、保护肾脏、抗组织纤维化等作用。
[0004]“龙丹通络胶囊”(国药准字b20020853)是集心脑血管保健，预防、治疗为一体的纯中药产品，是哈尔滨圣泰生物制药有限公司主打品牌，甲类otc药品，国家中药保护品种，其中，水蛭是处方中的主要药物，具有益气活血，祛瘀通脉的功效。用于气虚血瘀型脑血栓形成恢复期或冠心病轻中度稳定型劳累性心绞痛，表现为气虚血瘀证者的康复保健，能从根本上预防心脑血管疾病的产生，并对已患心脑血管疾病有非常显著的效果。
[0005]“龙丹通络胶囊”成药中，以水蛭生粉入药，然而，由于水蛭药材在贮藏过程中易霉变，其药材细粉在固体制剂中微生物超标严重，导致“龙丹通络胶囊”的卫生学指标难以控制，极大地限制了药理药效及临床治疗。
[0006]
目前，中药制剂常用的灭菌方法包括：水洗灭菌法、化学灭菌法、干热灭菌法、射线灭菌法等，但这些方法在应用中也存在一定的缺点：水洗灭菌法只适用于中药材初步处理，去除附着于药材表面的灰尘及细菌；化学灭菌法利用化学试剂处理药材，经处理后的药材会有化学试剂残留；干热灭菌法对药材进行加热处理，温度较高，会使动物药中所含的蛋白质变性，不利于动物药材的活性成分提取；射线灭菌法中常用的包括微波灭菌法、
60
co-γ射线灭菌法、紫外灭菌法。但紫外线穿透能力弱，只适用于药材表面的灭菌。
60
co-γ射线灭菌法需要特殊的核辐照装置，对
60
co-γ射线的人身安全防护亦有特殊要求，限制了大量制药生产企业和高校院所等研发机构的应用。
[0007]
现阶段水蛭溶栓有效组分的常用提取方法有：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流法等，但这些方法存在着损失多、周期长、工序多、提取效率不高的特点。
[0008]
因此，采用科学可靠的灭菌技术，优化提取工艺，以控制水蛭药材的微生物菌落含量，有效提高水蛭中溶栓活性多肽组分的提取率，保证“龙丹通络胶囊”的临床用药安全、有效尤为重要。


技术实现要素：

[0009]
本发明所要解决的技术问题是，水蛭药材卫生学指标难以控制的问题，提供了一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法，可有效控制微生物含量，该法采用蜗牛酶-nacl酶降解溶剂系统、罐组动态逆流提取、高速离心、al2o3陶瓷膜分离、喷雾干燥技术提取水蛭溶栓有效组分，工艺流程简单，操作方便。
[0010]
同时，本发明提供一种具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。
[0011]
同时，本发明提供一种具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分在制备抗凝血、抗血栓、改善血液流变性、脑保护、抗脑缺血、调脂、抗炎、保护肾脏、或抗组织纤维化药物中的应用。
[0012]
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0013]
一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法，包括以下步骤：
[0014]
s01，取水蛭药材，粉碎，过筛，微波辐照灭菌，微波辐照功率为400～1000w，辐照时间为2～8min，获得灭菌水蛭药材；
[0015]
s02，运用三套罐组动态逆流提取技术对灭菌水蛭药材中的溶栓有效组分进行富集，采用灭菌水蛭药材重量10～15倍的0.3％～0.9％的氯化钠水溶液，加入蜗牛酶的比例为600～1200ku/kg灭菌水蛭药材作为提取溶媒，ph6.0～8.0，提取温度35～45℃，梯度形成阶段，a罐酶解提取时间为60～90min；b罐提取时间为15～40min；c罐提取时间为0～25min；提取阶段，各罐提取时间2.0～3.0小时，提取期间逆流循环3～5次，每次逆流循环15～25分钟，获得提取液；
[0016]
s03，对上述提取液进行高速离心，转速为5000～8000rpm，离心至少20分钟，得离心分离液；
[0017]
s04，对离心分离液进行微滤，得微滤透过液，浓缩，喷雾干燥得具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。
[0018]
s03中，采用碟片式离心机进行离心操作。
[0019]
s04中，微滤的方法为膜分离微滤分离，膜分离微滤分离采用膜孔径为0.05μm，al2o3陶瓷膜机组对上述离心分离液进行微滤分离处理，其机组的组合方式为四并两串式，每根膜管里装0.05μm膜芯61根，共488根；运行条件：温度：35～50℃、出膜压力：1.0～2.0bar；微滤分离结束后，用截留液体积3倍量的纯净水对截留液顶洗3次，顶洗温度：35～50℃、顶洗压力：7.0～10.0bar，得微滤透过液。
[0020]
s01中，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min。
[0021]
s01中，过筛为过40目筛。
[0022]
蜗牛酶的提取方法包括以下步骤：采用木瓜酶0.05％～0.15％w/v-甘露醇0.1％～0.3％w/v-司盘20 0.05％～0.1％w/v溶剂系统，溶解于ph6.0～8.2的0.01～0.03mol/l磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液500ml、20％～40％w/v浓度的(nh4)2so4溶液500～1000ml，溶液总量共计1000～1500ml；
[0023]
取去壳蜗牛，冰浴条件下至少12000rpm高速匀浆10～15min，对蜗牛酶进行萃取，萃取完成后进行活性炭脱色1～2h，活性炭的添加重量为去壳蜗牛重量的0.1％，再用0.9％nacl溶液过滤洗涤除去活性炭，0.9％nacl溶液的用量相当于去壳蜗牛重量的1～2倍量，获得蜗牛粗蛋白溶液，蜗牛粗蛋白溶液中，至少62％的蜗牛粗蛋白得率；
[0024]
采用聚乙二醇peg2000～4000结合葡聚糖凝胶sephadexg-25～100柱层析分离蜗牛酶，蜗牛粗蛋白溶液溶解于相当于蜗牛粗蛋白溶液重量1～4倍量的tri-hcl buffer溶液中，获得蜗牛粗蛋白溶解液，蜗牛粗蛋白溶解液与聚乙二醇peg2000～4000按照1:3～1:8的重量比例在0～4℃混合均匀，反应1～4h；获得蜗牛粗蛋白与peg2000～4000复合物，过滤，将蜗牛粗蛋白与peg2000～4000复合物50g溶解于200mltri-hcl buffer溶液，上样于采用同一缓冲液tri-hcl buffer平衡的葡聚糖凝胶sephadexg-25～100层析柱，0.20～0.60mol/lnacl溶液梯度洗脱3～6个柱体积，每0.1～0.3个柱体积收集一次，流速0.8～1.0ml/min，合并酶活性不低于4.72u/ml的组分，置于透析袋内，悬于去离子水中，3000～5000rpm磁力搅拌除盐，经冷冻干燥，获得纯度高于85％的蜗牛酶粉末。
[0025]
tri-hcl buffer溶液为0.03～0.06mol/l，ph 7.4～8.0。
[0026]
葡聚糖凝胶sephadexg-25～100层析柱的径高比1:5～1:8。
[0027]
本发明的提取方法获得的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。
[0028]
本发明的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分在制备抗凝血、抗血栓、改善血液流变性、脑保护、抗脑缺血、调脂、抗炎、保护肾脏、或抗组织纤维化药物中的用途。
[0029]
本发明具有如下有益效果：
[0030]
蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶，具有较强的生物转化能力，可以用于酵母细胞壁的破碎，因此广泛用于细胞生物学和基因工程学的研究。与传统的酶解法(如：胃蛋白酶、胰蛋白酶等)相比较，采用蜗牛酶-nacl溶剂体系提取水蛭溶栓活性组分，可最大限度的保留其溶栓活性组分，酶解条件温和、活性物质溶出快速，且蜗牛酶提取方法简单可行，转化率高，分离纯化容易，对环境无污染，适合工业化生产。
[0031]
本发明用于水蛭药材灭菌的微波辐照功率为400～1000w，辐照时间为2～8min，其中，辐照功率为800w，3min的水蛭提取物的溶栓活性最强。本发明采用微波辐照技术对水蛭药材进行灭菌，具有灭菌快速、彻底、穿透力强、不污染环境、能耗低的优点；灭菌效果显著，可有效控制微生物含量，符合卫生学指标；操作过程在常温下进行，不会导致水蛭药材温度升高，可以防止溶栓有效组分失活，保证了“龙丹通络胶囊”的用药安全、有效。微波灭菌不仅可以在短时问内达到很好的灭菌效果，效率高而且杀菌效果好，更能减少能量消耗和环境污染，对人体不产生核辐射损伤。本发明采用微波辐照技术的另一个主要原因是水蛭中的溶栓活性组分为多肽类物质，属于热敏感性药物成分，而微波辐照短时间内不会引起被辐照物的温度明显升高，对热敏性中药的杀菌有一定的优越性，同时由于大规模的样品灭菌非常便捷且成本低，只要合理的控制好微波功率和灭菌时间，可在药材贮藏及药物制剂生产灭菌过程中广泛应用。
[0032]
本发明同时添加药材10～15倍的0.3％～0.9％的氯化钠水溶液，加入蜗牛酶的比例为600～1200ku/kg药材作为提取溶媒，运用三套罐组动态逆流提取技术对水蛭中的溶栓有效组分进行富集。本发明采用蜗牛酶-nacl酶降解溶剂系统、罐组动态逆流提取、高速离心、al2o3陶瓷膜分离、喷雾干燥技术提取水蛭溶栓有效组分，工艺流程简单，操作方便。其中，利用三套罐组动态逆流提取方法，有利于水蛭中的溶栓有效成分的富集，它集萃取、重渗漉、动态和逆流技术为一体，具有节省溶剂、能耗低、提取效率高等优点，适合工业化生产。
[0033]
本发明为解决现有水蛭溶栓有效组分提取工艺效率不高的问题，提供一种新型蜗牛酶-nacl溶剂系统结合罐组动态逆流提取技术，对水蛭中的溶栓有效组分进行富集，可提高有效成分收率，减少活性组分损失，缩短生产周期，通过与传统提取溶剂及传统提取方式对比，本发明可明显提高水蛭中溶栓活性多肽组分的提取效率。
附图说明
[0034]
图1牛血清白蛋白标准曲线；
[0035]
图2为本发明微波辐照对水蛭药材中菌落数量的影响图；
[0036]
图3为本发明微波辐照功率对水蛭提取物溶栓效果的影响图；
[0037]
图4为水蛭提取物uplc-q-tof-ms正离子模式下的总离子流图；
[0038]
图5为水蛭提取溶液uplc图谱，其中，1为次黄嘌呤2为黄嘌呤。
具体实施方式
[0039]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0040]
实施例1
[0041]
本发明的目的在于提供一种水蛭药材灭菌方法，该方法采用微波辐照灭菌技术对水蛭药材进行灭菌，无化学试剂残留，过程在常温下进行，穿透性强，可防止药材活性成分失活，有效控制水蛭药材卫生学指标，提高水蛭药材质量的稳定性。
[0042]
本实施例采用微波辐照技术对水蛭药材进行灭菌，依据《中国药典》2020版四部通则微生物检测限度，以及《食品安全国家标准食品辐照加工卫生规范》(gb 10436-1989作业场所微波辐射卫生标准)，微波辐照灭菌产量可达200～250公斤/小时，可有效控制微生物含量达到《中国药典》2020版标准。
[0043]
蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶，具有较强的生物转化能力，可以用于酵母细胞壁的破碎，因此广泛用于细胞生物学和基因工程学的研究。与传统的酶解法(如：胃蛋白酶、胰蛋白酶等)相比较，采用蜗牛酶-nacl溶剂体系提取水蛭溶栓活性组分，可最大限度的保留其溶栓活性组分，酶解条件温和、活性物质溶出快速，且蜗牛酶提取方法简单可行，转化率高，分离纯化容易，对环境无污染，适合工业化生产。
[0044]
蜗牛酶提取方法为：采用木瓜酶(0.10％w/v)-甘露醇(0.2％w/v)-司盘20(0.07％w/v)溶剂系统，溶解于ph6.0～8.2的0.02mol/l磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液500ml、30％(w/v)浓度的(nh4)2so4溶液1000ml，溶液总量共计1500ml。即1500ml的溶液中含有0.10％w/v的木瓜酶，0.2％w/v的甘露醇和0.07％w/v的司盘20。
[0045]
取蜗牛(去壳)100克，冰浴条件下高速匀浆12000rpm、12min对蜗牛酶进行萃取，0.1％w/w活性炭脱色1.5h，150g、0.9％nacl溶液洗涤，可获得62％的蜗牛粗蛋白得率，明显优于常规的缓冲液提取法；采用聚乙二醇peg3000结合葡聚糖凝胶sephadexg-50柱层析分离蜗牛酶，蜗牛粗蛋白溶解于相当于蜗牛粗蛋白重量2倍量的tri-hcl buffer(0.04mol/l，ph7.4～8.0)中，获得蜗牛粗蛋白溶解液，蜗牛粗蛋白溶解液与peg3000按照1:5的重量比例
在2℃混合均匀，反应2h，过滤，获得蜗牛粗蛋白与peg3000复合物，将蜗牛粗蛋白与peg3000复合物50g溶解于200mltri-hcl buffer(0.04mol/l，ph7.4～8.0)，上样于采用同一缓冲液(tri-hcl buffer)平衡的葡聚糖凝胶sephadexg-50层析柱(径高比1:6)，0.35mol/l nacl溶液梯度洗脱4个柱体积，每0.1个柱体积收集一次，流速0.9ml/min，合并酶活性不低于4.72u/ml的组分，置于透析袋内，悬于去离子水中，4000rpm磁力搅拌除盐，经冷冻干燥，可获得纯度为85％的蜗牛酶粉末。
[0046]
蜗牛酶含量测定：
[0047]
鉴于蜗牛酶的主要成分为蛋白类成分，采用bradford蛋白定量法测定蜗牛酶的含量。
[0048]
标准曲线绘制：分别吸取0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的牛血清白蛋白溶液100μl，加入5ml bradford试剂，混合均匀，5min后于595nm测定吸光度a
595
值，绘制标准曲线，牛血清白蛋白标准曲线如图1所示。
[0049]
蜗牛酶样品溶液加入双蒸水稀释至0.5ml，加3ml考马斯亮蓝溶液(150mg/ml)，摇匀后室温静置15min，于595nm测定吸光度，依据标准曲线计算样品溶液中酶含量。
[0050]
蜗牛酶活力测定：
[0051]
将蜗牛酶冻干粉0.25mg溶于10ml柠檬酸-磷酸盐缓冲系统(ph 5.0～7.0)，获得蜗牛酶溶液，蜗牛酶溶液与底物溶液分别于40℃水浴中预热。底物溶液的配制方法为：精取0.5g羧甲基纤维素钠(cmc-na)溶于100ml柠檬酸-磷酸缓冲溶液(ph 5.0～7.0)，制备底物溶液。然后取0.5ml蜗牛酶溶液加入到2.0ml底物溶液中混匀，于40℃反应30min，加2.5ml 3,5-二硝基水杨酸，取出置沸水浴中5min，立即用自来水冷却。另做一空白管，以0.5ml蒸馏水代替酶溶液，其他操作同上，采用分光光度计于490nm处测定光密度值，计算酶活力，(注：酶活力单位在上述条件下，每分钟产生1μmol葡萄糖的酶量为一个活力单位u)。
[0052]
本实施例同时运用三套罐组动态逆流提取技术对水蛭中的溶栓有效组分进行富集，采用灭菌水蛭药材(水蛭药材，微波辐照灭菌，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min，获得灭菌水蛭药材)重量12倍的0.5％的氯化钠水溶液，加入蜗牛酶的比例为900ku/kg药材作为提取溶媒，ph6.5，提取温度40℃，梯度形成阶段，a罐酶解提取时间为75min；b罐提取时间为30min；c罐提取时间为10min；提取阶段，各罐提取时间2.5小时，提取期间逆流循环4次，每次逆流循环20分钟。采用碟片式离心机对上述提取液进行高速离心，转速为6000rpm，离心20分钟，得离心分离液；膜分离微滤分离采用膜孔径为0.05μm，al2o3陶瓷膜机组对上述离心分离液进行微滤分离处理，其机组的组合方式为四并两串式，每根膜管里装0.05μm膜芯61根，共488根；运行条件：温度：40℃、出膜压力：1.5bar；微滤分离结束后，用截留液体积3倍量的纯净水对截留液顶洗3次，顶洗温度：40℃、顶洗压力：8.0bar；得微滤透过液，浓缩，喷雾干燥得水蛭提取物。
[0053]
一、微波辐照灭菌效果：由图2可以看出，水蛭药材经功率为0～800w的微波辐照处理3min后，其总菌落含量、霉菌含量、大肠杆菌计数均明显降低，最大降幅可达73.5％，可以有效控制微生物(包括：总菌落数、霉菌及大肠杆菌)含量，达到卫生学规定标准。
[0054]
二、微波辐照对水蛭提取物抗凝活性及重金属含量的影响
[0055]
表1不同微波辐照功率对水蛭提取物抗凝活性及重金属含量的影响(时间：5min)
[0056][0057]
由表1数据可知，水蛭药材经微波辐照功率为0～800w处理5min后，提取物的抗凝活性没有显著差异，而对人体有害的重金属含量经微波辐照后有所下降，砷含量最大下降幅度达0.34ppm，铅含量最大下降幅度达0.38ppm，汞含量最大下降幅度达0.30ppm，镉含量最大下降幅度达0.25ppm，辐照前后质量稳定，有效控制了重金属含量。
[0058]
三、蜗牛酶不同提取方法获得蜗牛酶提取率对比
[0059]
表2不同提取方法对蜗牛粗蛋白提取率及蜗牛酶纯化率的影响
[0060][0061]
超声破壁法与本发明实施例1的萃取分离法的区别仅在于：采用灭菌水蛭药材(水蛭药材，微波辐照灭菌，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min，获得灭菌水蛭药材)重量12倍的水溶液作为提取溶媒，超声(功率为1000w)提取30min后，再进行三套罐组动态逆流提取技术对水蛭中的溶栓有效组分进行富集。
[0062]
sevag试剂法(正丁醇：氯仿＝1:4)与本发明实施例1的萃取分离法的区别仅在于：采用灭菌水蛭药材(水蛭药材，微波辐照灭菌，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min，获得灭菌水蛭药材)重量12倍的sevag试剂作为提取溶媒，再进行三套罐组动态逆流提取技术对水蛭中的溶栓有效组分进行富集。
[0063]
单纯木瓜酶解法与本发明实施例1的萃取分离法的区别仅在于：将本技术的木瓜酶(0.1％w/v)-甘露醇(0.2％w/v)-司盘20(0.07％w/v)溶剂系统替换为单纯的木瓜酶(0.1％w/v)。
[0064]
由表2可见，本实施例采用木瓜酶-甘露醇-司盘20溶剂系统的蜗牛粗蛋白得率以及蜗牛酶纯化得率均最高。
[0065]
四、与其他提取方法比较，蜗牛酶-nacl溶剂系统用于水蛭抗凝活性组分提取的优
势
[0066]
表3不同提取方法对水蛭提取物抗凝活性及溶栓活性蛋白组分含量的影响
[0067][0068]
水煎煮法的工艺为：采用灭菌水蛭药材(水蛭药材，微波辐照灭菌，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min，获得灭菌水蛭药材)重量12倍的水溶液作为提取溶媒，煎煮1.5h。
[0069]
70％乙醇回流法的工艺为：采用灭菌水蛭药材(水蛭药材，微波辐照灭菌，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min，获得灭菌水蛭药材)重量12倍的70％乙醇作为提取溶媒，热回流提取1.5h。
[0070]
柠檬酸缓冲液提取的工艺为：采用灭菌水蛭药材(水蛭药材，微波辐照灭菌，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min，获得灭菌水蛭药材)重量12倍的柠檬酸缓冲液作为提取溶媒，煎煮1.5h。
[0071]
生理盐水(0.9％nacl)提取的工艺为：采用灭菌水蛭药材(水蛭药材，微波辐照灭菌，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min，获得灭菌水蛭药材)重量12倍的生理盐水(0.9％nacl)作为提取溶媒，再进行三套罐组动态逆流提取技术对水蛭中的溶栓有效组分进行富集。
[0072]
0.4％nacl提取的工艺为：采用灭菌水蛭药材(水蛭药材，微波辐照灭菌，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min，获得灭菌水蛭药材)重量12倍的0.4％nacl作为提取溶媒，再进行三套罐组动态逆流提取技术对水蛭中的溶栓有效组分进行富集。
[0073]
胃蛋白酶解法的工艺为：采用灭菌水蛭药材(水蛭药材，微波辐照灭菌，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min，获得灭菌水蛭药材)重量12倍的0.5％的氯化钠水溶液，加入胃蛋白酶的比例为900ku/kg药材作为提取溶媒，再进行三套罐组动态逆流提取技术对水蛭中的溶栓有效组分进行富集。
[0074]
胰蛋白酶解法的工艺为：采用灭菌水蛭药材(水蛭药材，微波辐照灭菌，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min，获得灭菌水蛭药材)重量12倍的0.5％的氯化钠水溶液，加入
胰蛋白酶的比例为900ku/kg药材作为提取溶媒，再进行三套罐组动态逆流提取技术对水蛭中的溶栓有效组分进行富集。
[0075]
采用中国药典2020版水蛭药材项下，markward滴定法(凝血酶滴定法)及aptt凝血活酶测定法进行体外抗凝试验；采用双缩脲比色法测水蛭提取液中抗凝蛋白质含量，进一步考察不同提取方法所获得的水蛭溶栓提取物的抗凝活性及溶栓活性蛋白组分含量的影响。结果表明，对比其他几种提取方法，蜗牛酶-nacl溶剂系统降解提取法所获得的的水蛭提取物抗凝活性最强，且水蛭溶栓活性蛋白组分含量最高，明显优于传统的胃蛋白酶和胰蛋白酶水解法。
[0076]
中药水蛭中抗凝活性成分目前大致可分为两类：一类是直接作用于凝血系统的成分，包括凝血酶抑制剂以及其它抗血液凝固的物质，二类是一些蛋白酶抑制剂及其它活性成分。主要成分为水蛭素类抗凝多肽、氨基酸、黄嘌呤等成分。
[0077]
表4不同酶解提取方法对水蛭药材提取物中抗凝活性组分含量的影响
[0078][0079][0080]
采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(uplc-q-tof-ms)技术测定水蛭提取物中的化学成分图谱：
[0081]
检测仪器：exionlc ad超高效液相色谱仪，sciex 5600三重四级杆质谱仪(美国ab sciex公司)
[0082]
色谱条件：
[0083]
色谱柱：acquity beh c18 column(2.1mm
×
100mm，1.7μm)；柱温：40℃；流动相：a：0.1％甲酸-水，b：0.1％甲酸-乙腈；洗脱方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序见表5；流速0.3ml/min；样品仓温度4℃；进样量5μl。
[0084]
表5超高效液相色谱梯度洗脱条件
[0085][0086]
质谱条件：
[0087]
使用正离子模式下的电喷雾电离源，ida设置响应值超过100cps的8个最高峰进行二级质谱扫描，开启动态背景扣除(dbs)。电喷雾电离源(esi)喷雾电压5500v，气帘气0.24mpa，雾化气压力0.38mpa，辅助气压力0.38mpa，辅助气温度550℃，在该条件下的水蛭提取物的总离子流图见图4。根据二级质谱图可知水蛭提取物中含有次黄嘌呤、黄嘌呤等抗凝物质，二级质谱解析见表6。
[0088]
表6二级质谱解析
[0089][0090]
采用uplc测定水蛭中抗凝组分次黄嘌呤、黄嘌呤含量：
[0091]
标准品：次黄嘌呤、黄嘌呤对照品(购于北京索莱宝科技有限公司)；
[0092]
检测仪器：lc-20at超高效液相色谱仪(日本岛津公司)
[0093]
色谱条件：
[0094]
色谱柱：agela xbp-c18-l(tcm)(250mm
×
4.6mm，5μm)；检测波长：254nm；流速1.0ml/min；进样量10μl；检测温度：25℃；流动相a：甲醇；流动相b：水；洗脱梯度见下表7。
[0095]
表7流动相洗脱程序
[0096]
时间(min)a(％)b(％)01995199101090301090
[0097]
结果表明，对比其他几种提取方法，蜗牛酶-nacl溶剂系统降解提取法所获得的水蛭提取物中抗凝活性组分的配比最高，明显优于传统的胃蛋白酶和胰蛋白酶水解法。如图5所示，为水蛭提取溶液uplc图谱。
[0098]
五、微波辐照前后水蛭提取物的溶栓效果对比
[0099]
实验动物：sd大鼠，36只雌雄各半，体重200-220克，随机分为6组，采用中动脉梗阻法建立sd大鼠脑血栓模型，分别灌胃：a.假手术组和b.模型组：灌胃生理盐水；c.未辐照组：灌胃未经微波辐照处理的水蛭药材提取物；d组灌胃辐照功率200w，辐照3min的水蛭药材提取物；e组灌胃辐照功率600w，辐照3min的水蛭药材提取物；f组灌胃辐照功率800w，辐照3min的水蛭药材提取物。
[0100]
如图3所示，实验结果显示，辐照功率为800w，辐照3min的水蛭提取物，对大鼠实验性脑血栓的溶栓治疗效果，明显优于其他辐照功率组水蛭提取物组以及未经辐照的水蛭提取物组。
[0101]
本实施例的提取方法获得的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。
[0102]
本实施例的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分在制备抗凝血、抗血栓、改善血液流变性、脑保护、抗脑缺血、调脂、抗炎、保护肾脏、或抗组织纤维化药物中的用途。
[0103]
实施例2
[0104]
一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法，其包括以下步骤：
[0105]
s01，取水蛭药材，粉碎，过筛，微波辐照灭菌，微波辐照功率为400w，辐照时间为2min，获得灭菌水蛭药材；
[0106]
s02，运用三套罐组动态逆流提取技术对灭菌水蛭药材中的溶栓有效组分进行富集，采用灭菌水蛭药材重量10倍的0.3％的氯化钠水溶液，加入蜗牛酶的比例为600ku/kg灭菌水蛭药材作为提取溶媒，ph6.0，提取温度35℃，梯度形成阶段，a罐酶解提取时间为60min；b罐提取时间为15min；c罐提取时间为0min；提取阶段，各罐提取时间2.0小时，提取期间逆流循环3次，每次逆流循环15分钟，获得提取液；
[0107]
s03，对上述提取液进行高速离心，转速为5000rpm，离心25分钟，得离心分离液；
[0108]
s04，对离心分离液进行微滤，得微滤透过液，浓缩，喷雾干燥得具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。
[0109]
s03中，采用碟片式离心机进行离心操作。
[0110]
s04中，微滤的方法为膜分离微滤分离，膜分离微滤分离采用膜孔径为0.05μm，al2o3陶瓷膜机组对上述离心分离液进行微滤分离处理，其机组的组合方式为四并两串式，每根膜管里装0.05μm膜芯61根，共488根；运行条件：温度：35℃、出膜压力：1.0bar；微滤分离结束后，用截留液体积3倍量的纯净水对截留液顶洗3次，顶洗温度：35℃、顶洗压力：
7.0bar，得微滤透过液。
[0111]
s01中，过筛为过40目筛。
[0112]
蜗牛酶的提取方法包括以下步骤：采用木瓜酶0.05％w/v-甘露醇0.1％w/v-司盘20 0.05％w/v溶剂系统，溶解于ph6.0～8.2的0.01mol/l磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液500ml、20％w/v浓度的(nh4)2so4溶液500ml，溶液总量共计1000ml；
[0113]
取去壳蜗牛，冰浴条件下15000rpm高速匀浆10min，对蜗牛酶进行萃取，萃取完成后进行活性炭脱色1h，活性炭的添加重量为去壳蜗牛重量的0.1％，再用0.9％nacl溶液过滤洗涤除去活性炭，0.9％nacl溶液的用量相当于去壳蜗牛重量的1倍量，获得蜗牛粗蛋白溶液，蜗牛粗蛋白溶液中，65％的蜗牛粗蛋白得率；
[0114]
采用聚乙二醇peg2000结合葡聚糖凝胶sephadexg-25柱层析分离蜗牛酶，蜗牛粗蛋白溶液溶解于相当于蜗牛粗蛋白溶液重量1倍量的tri-hcl buffer溶液中，获得蜗牛粗蛋白溶解液，蜗牛粗蛋白溶解液与聚乙二醇peg2000按照1:3的重量比例在0℃混合均匀，反应1h；获得蜗牛粗蛋白与peg2000复合物，过滤，将蜗牛粗蛋白与peg2000复合物50g溶解于200mltri-hcl buffer溶液，上样于采用同一缓冲液tri-hcl buffer平衡的葡聚糖凝胶sephadexg-25层析柱，0.20mol/lnacl溶液梯度洗脱3个柱体积，每0.1个柱体积收集一次，流速0.8ml/min，合并酶活性不低于4.72u/ml的组分，置于透析袋内，悬于去离子水中，3000rpm磁力搅拌除盐，经冷冻干燥，获得纯度88％的蜗牛酶粉末。
[0115]
tri-hcl buffer溶液为0.03mol/l，ph 7.4～8.0。
[0116]
葡聚糖凝胶sephadexg-25层析柱的径高比1:5。
[0117]
本实施例的提取方法获得的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。
[0118]
本实施例的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分在制备抗凝血、抗血栓、改善血液流变性、脑保护、抗脑缺血、调脂、抗炎、保护肾脏、或抗组织纤维化药物中的用途。
[0119]
实施例3
[0120]
一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法，包括以下步骤：
[0121]
s01，取水蛭药材，粉碎，过筛，微波辐照灭菌，微波辐照功率为1000w，辐照时间为8min，获得灭菌水蛭药材；
[0122]
s02，运用三套罐组动态逆流提取技术对灭菌水蛭药材中的溶栓有效组分进行富集，采用灭菌水蛭药材重量15倍的0.9％的氯化钠水溶液，加入蜗牛酶的比例为1200ku/kg灭菌水蛭药材作为提取溶媒，ph8.0，提取温度45℃，梯度形成阶段，a罐酶解提取时间为90min；b罐提取时间为40min；c罐提取时间为25min；提取阶段，各罐提取时间3.0小时，提取期间逆流循环5次，每次逆流循环25分钟，获得提取液；
[0123]
s03，对上述提取液进行高速离心，转速为8000rpm，离心30分钟，得离心分离液；
[0124]
s04，对离心分离液进行微滤，得微滤透过液，浓缩，喷雾干燥得具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。
[0125]
s03中，采用碟片式离心机进行离心操作。
[0126]
s04中，微滤的方法为膜分离微滤分离，膜分离微滤分离采用膜孔径为0.05μm，al2o3陶瓷膜机组对上述离心分离液进行微滤分离处理，其机组的组合方式为四并两串式，每根膜管里装0.05μm膜芯61根，共488根；运行条件：温度：50℃、出膜压力：2.0bar；微滤分
离结束后，用截留液体积3倍量的纯净水对截留液顶洗3次，顶洗温度：50℃、顶洗压力：10.0bar，得微滤透过液。
[0127]
s01中，过筛为过40目筛。
[0128]
蜗牛酶的提取方法包括以下步骤：采用木瓜酶0.15％w/v-甘露醇0.3％w/v-司盘20 0.1％w/v溶剂系统，溶解于ph6.0～8.2的0.03mol/l磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液500ml、40％w/v浓度的(nh4)2so4溶液1000ml，溶液总量共计1500ml；
[0129]
取去壳蜗牛，冰浴条件下12000rpm高速匀浆15min，对蜗牛酶进行萃取，萃取完成后进行活性炭脱色2h，活性炭的添加重量为去壳蜗牛重量的0.1％，再用0.9％nacl溶液过滤洗涤除去活性炭，0.9％nacl溶液的用量相当于去壳蜗牛重量的2倍量，获得蜗牛粗蛋白溶液，蜗牛粗蛋白溶液中，63％的蜗牛粗蛋白得率；
[0130]
采用聚乙二醇peg4000结合葡聚糖凝胶sephadexg-100柱层析分离蜗牛酶，蜗牛粗蛋白溶液溶解于相当于蜗牛粗蛋白溶液重量4倍量的tri-hcl buffer溶液中，获得蜗牛粗蛋白溶解液，蜗牛粗蛋白溶解液与聚乙二醇peg4000按照1:8的重量比例在4℃混合均匀，反应4h；获得蜗牛粗蛋白与peg4000复合物，过滤，将蜗牛粗蛋白与peg4000复合物50g溶解于200mltri-hcl buffer溶液，上样于采用同一缓冲液tri-hcl buffer平衡的葡聚糖凝胶sephadexg-100层析柱，0.60mol/lnacl溶液梯度洗脱6个柱体积，每0.3个柱体积收集一次，流速1.0ml/min，合并酶活性不低于4.72u/ml的组分，置于透析袋内，悬于去离子水中，5000rpm磁力搅拌除盐，经冷冻干燥，获得纯度90％的蜗牛酶粉末。
[0131]
tri-hcl buffer溶液为0.06mol/l，ph 7.4～8.0。
[0132]
葡聚糖凝胶sephadexg-100层析柱的径高比1:8。
[0133]
本实施例的提取方法获得的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。
[0134]
本实施例的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分在制备抗凝血、抗血栓、改善血液流变性、脑保护、抗脑缺血、调脂、抗炎、保护肾脏、或抗组织纤维化药物中的用途。
[0135]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法，其特征在于：包括以下步骤：s01，取水蛭药材，粉碎，过筛，微波辐照灭菌，微波辐照功率为400~1000w，辐照时间为2~8min，获得灭菌水蛭药材；s02，运用三套罐组动态逆流提取技术对灭菌水蛭药材中的溶栓有效组分进行富集，采用灭菌水蛭药材重量10~15倍的0.3%~0.9%的氯化钠水溶液，加入蜗牛酶的比例为600~1200 ku/kg灭菌水蛭药材作为提取溶媒，ph6.0~8.0，提取温度35~45℃，梯度形成阶段，a罐酶解提取时间为60~90min；b罐提取时间为15~40min；c罐提取时间为0~25min；提取阶段，各罐提取时间2.0~3.0小时，提取期间逆流循环3~5次，每次逆流循环15~25分钟，获得提取液；s03，对上述提取液进行高速离心，转速为5000~8000rpm，离心至少20分钟，得离心分离液；s04，对离心分离液进行微滤，得微滤透过液，浓缩，喷雾干燥得具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：s03中，采用碟片式离心机进行离心操作。3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：s04中，微滤的方法为膜分离微滤分离，膜分离微滤分离采用膜孔径为0.05
µ
m，al2o3陶瓷膜机组对上述离心分离液进行微滤分离处理，其机组的组合方式为四并两串式，每根膜管里装0.05
µ
m膜芯61根，共488根；运行条件：温度：35～50℃、出膜压力：1.0～2.0bar；微滤分离结束后，用截留液体积3倍量的纯净水对截留液顶洗3次，顶洗温度：35～50℃、顶洗压力：7.0～10.0bar，得微滤透过液。4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：s01中，微波辐照功率为800w，辐照时间为3min。5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：s01中，过筛为过40目筛。6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：蜗牛酶的提取方法包括以下步骤：采用木瓜酶0.05%~0.15%w/v-甘露醇0.1%~0.3%w/v-司盘20 0.05%~0.1%w/v溶剂系统，溶解于ph6.0~8.2的0.01~0.03mol/l磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液500ml、20%~40%w/v浓度的(nh4)2so4溶液500~1000ml，溶液总量共计1000~1500ml；取去壳蜗牛，冰浴条件下至少12000rpm高速匀浆10~15min，对蜗牛酶进行萃取，萃取完成后进行活性炭脱色1~2h，活性炭的添加重量为去壳蜗牛重量的0.1%，再用0.9%nacl溶液过滤洗涤除去活性炭，0.9%nacl溶液的用量相当于去壳蜗牛重量的1~2倍量，获得蜗牛粗蛋白溶液，蜗牛粗蛋白溶液中，至少62%的蜗牛粗蛋白得率；采用聚乙二醇peg2000~4000结合葡聚糖凝胶sephadexg-25~100柱层析分离蜗牛酶，蜗牛粗蛋白溶液溶解于相当于蜗牛粗蛋白溶液重量1~4倍量的tri-hcl buffer溶液中，获得蜗牛粗蛋白溶解液，蜗牛粗蛋白溶解液与聚乙二醇peg2000~4000按照1:3~1:8的重量比例在0~4℃混合均匀，反应1~4 h；获得蜗牛粗蛋白与peg2000~4000复合物，过滤，将蜗牛粗蛋白与peg2000~4000复合物50g溶解于200ml tri-hcl buffer溶液，上样于采用同一缓冲液tri-hcl buffer平衡的葡聚糖凝胶sephadexg-25~100层析柱，0.20~0.60mol/l nacl溶液梯度洗脱3~6个柱体积，每0.1~0.3个柱体积收集一次，流速0.8~1.0ml/min，合并酶活性不低于4.72u/ml的组分，置于透析袋内，悬于去离子水中，3000~5000rpm磁力搅拌除盐，经冷
冻干燥，获得纯度高于85%的蜗牛酶粉末。7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于：tri-hcl buffer溶液为0.03~0.06 mol/l，ph 7.4~8.0。8.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于：葡聚糖凝胶sephadexg-25~100层析柱的径高比1:5~1:8。9.根据权利要求1~8任意一项所述的提取方法获得的具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分。10.根据权利要求9所述具有抗凝活性的水蛭溶栓有效组分在制备抗凝血、抗血栓、改善血液流变性、脑保护、抗脑缺血、调脂、抗炎、保护肾脏、或抗组织纤维化药物中的用途。

技术总结
本发明公开了一种水蛭药材的微波辐照灭菌及蜗牛酶辅助罐组动态逆流提取方法及用途，属于医药技术领域，提取方法采用蜗牛酶-NaCl酶降解溶剂系统、罐组动态逆流提取、高速离心、Al2O3陶瓷膜分离、喷雾干燥技术提取水蛭溶栓有效组分，工艺流程简单，操作方便。本发明为解决现有水蛭溶栓有效组分提取工艺效率不高的问题，对水蛭中的溶栓有效组分进行富集，可提高有效成分收率，减少活性组分损失，缩短生产周期，通过与传统提取溶剂及传统提取方式对比，本发明可明显提高水蛭中溶栓活性多肽组分的提取效率。的提取效率。的提取效率。


技术研发人员：刘欣 李禹震 张宇 李松达 齐洋 丁芬 闫向伟
受保护的技术使用者：海南艾斯卓普科技有限公司
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/9/13