水稻重组频率调控相关基因RAD51C和RAD51D的应用

水稻重组频率调控相关基因rad51c和rad51d的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及水稻重组频率调控相关基因rad51c和rad51d的应用。


背景技术：

2.水稻是最重要的粮食作物之一，约为中国60％以上的人口提供了主要的卡路里来源。然而，人口的增长以及生活质量的改善，对水稻产量、口感、营养等方面提出了更高的要求。因此，如何选育高产、高效、抗逆和优质的超级水稻新品种成为了育种学家目前需要解决的关键问题。在农作物育种过程中，新品种产生的本质是杂交后代优良基因的聚合，而基因间的重组是目标基因聚合的理论及实践基础，其特异发生在生殖发育的减数分裂时期。增加遗传重组频率可以提高遗传多样性，促进新组合的产生；重组频率的减少则可以保持已聚合优异性状的稳定；而遗传重组的完全消失甚至可用于实现杂种优势的固定与稳定遗传。因此，精准调控重组频率将有助于打破传统育种的瓶颈效应，实现超级优良品种的高效培育，具有极其重要的理论与应用意义。
3.同源重组是一个十分复杂而又精确调控的过程，其频率和分布均受到严格的控制，并且存在一些促进途径和抑制途径协同维持重组的平衡。目前已知约200种蛋白直接或间接参与了同源重组过程，其中直接影响重组频率的因子包括重组抑制因子和重组促进因子。在绝大多数物种中，一般一对同源染色体仅会发生1-3次重组交换，而dsb的数目却是交换数目的十倍以上，只有少量的dsb才会被选择进而修复形成交换。生物体存在一些重组抑制因子限制重组的形成，主要包括解旋酶fancm及其结合蛋白mhf1和mhf2、aaa-atp酶figl1及其互作蛋白flip、解旋blm/sgs1/recq4及其互作蛋白top3α和rmi1等。因此，可以通过敲除重组抑制基因的方法释放作物中受抑制的交换进而提高重组频率。重组促进因子主要包括直接参与交换形成的zmm、mus81等蛋白。近年来，在模式作物水稻中克隆了一系列zmm基因，包括mer3、zep1、zip4、hei10、msh4、msh5和heip1等，并证明了他们在水稻中介导重组交换的形成。有研究发现hei10对于重组交换的促进作用具有剂量效应，其拷贝数的增加能导致全基因组范围的常染色质区域的重组频率提高。因此，可以通过在野生型植株中增加重组促进基因的拷贝数来达到提高重组频率的目的。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的重组频率和/或育性。
5.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物重组频率和/或育性中的应用。
6.本发明提供的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：
7.1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物重组频率和/或育性中的应用；
8.2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备调控植物重组频率和/或育性的产品中的应用；
9.3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在培育重组频率和/或育性改变的植物中的应用；
10.4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备培育重组频率和/或育性改变的植物的产品中的应用；
11.5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在植物重组频率和/或育性中的应用；
12.所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
13.a1)氨基酸序列为seq id no.3的蛋白质；
14.a2)氨基酸序列为seq id no.6的蛋白质；
15.a3)与a1)或a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
16.a4)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。
17.上述a1)所述蛋白质的名称为rad51c。
18.上述a2)所述蛋白质的名称为rad51d。
19.为了使a1)或a2)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中seq id no.3或氨基酸序列为seq id no.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
20.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
21.所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。
22.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质rad51c和rad51d的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质rad51c和rad51d的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质rad51c和rad51d且具有蛋白质rad51c和rad51d功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
23.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
24.本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
25.本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
26.本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
27.上述应用中，所述蛋白质来源于水稻(oryza sativa)。
28.本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质rad51c和rad51d。
29.所述蛋白质rad51c的基因可为如下dna分子：
30.d1)核苷酸序列是seq id no.2所示的dna分子；
31.d2)编码区序列是序列表中seq id no.1所示的dna分子。
32.所述蛋白质rad51d的基因可为如下dna分子：
33.d3)核苷酸序列是seq id no.5所示的dna分子；
34.d4)编码区序列是序列表中seq id no.4所示的dna分子。
35.上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
36.本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。所述调控也可为下调或减弱或降低。
37.上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为与前文所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
38.c1)编码前文所述蛋白质rad51c和rad51d的核酸分子；
39.c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
40.c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
41.c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
42.c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
43.c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；
44.c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；
45.e1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白质rad51c和rad51d的编码基因表达的核酸分子；
46.e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；
47.e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；
48.e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；
49.e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
50.e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；
51.e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。
52.上述应用中，c1)所述核酸分子可为如下任一所示的dna分子，
53.d1)核苷酸序列是seq id no.2所示的dna分子；
54.d2)编码区序列是序列表中seq id no.1所示的dna分子；
55.d3)核苷酸序列是seq id no.5所示的dna分子；
56.d4)编码区序列是序列表中seq id no.4所示的dna分子；
57.d5)在严格条件下与d1)、d2)、d3)或d4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的dna分子。
58.上述应用中，e1)所述的核酸分子可为含有核苷酸序列是seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9所示的dna分子。
59.本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
60.本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为载体pyl156载体。
61.可用现有的植物表达载体构建含有rad51c和rad51d基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
62.使用rad51c和rad51d基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
63.为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
64.利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的rad51c和rad51d基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得重组频率和/或育性改变的转基因细胞系及转基因植株。携带rad51c和rad51d基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植
物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
65.可选地，e2)所述的表达盒为含有seq id no.7所示dna分子的表达盒。
66.e2)所述的表达盒为含有seq id no.8所示dna分子的表达盒。
67.e2)所述的表达盒为含有seq id no.9所示dna分子的表达盒。
68.e2)所述的重组载体可为重组敲除载体pcambia1300-sgrna1、重组敲除载体pcambia1300-sgrna2、重组敲除载体pcambia1300-sgrna3。
69.重组敲除载体pcambia1300-sgrna1是在pcambia1300-cas9载体限制性内切酶kpni和bamhi的识别位点之间插入序列为序列表中seq id no.7的dna片段，保持pcambia1300-cas9载体其他序列不变得到的重组质粒。
70.重组敲除载体pcambia1300-sgrna2是在pcambia1300-cas9载体限制性内切酶kpni和bamhi的识别位点之间插入序列为序列表中seq id no.8的dna片段，保持pcambia1300-cas9载体其他序列不变得到的重组质粒。
71.重组敲除载体pcambia1300-sgrna3是在pcambia1300-cas9载体限制性内切酶kpni和bamhi的识别位点之间插入序列为序列表中seq id no.9的dna片段，保持pcambia1300-cas9载体其他序列不变得到的重组质粒。
72.本发明还提供了一种降低植物重组频率和/或育性的方法，所述方法包括步骤p，所述步骤p为抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默前文所述蛋白的编码基因的表达量，来降低植物重组频率和/或育性。
73.上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质rad51c和rad51d的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质rad51c和rad51d的编码基因活性下降或失活。
74.所述基因敲除可采用crispr-cas9系统进行敲除，所述crispr-cas9系统包括cas9蛋白质和sgrna，所述sgrna的靶序列可为：rad51c基因第二外显子的特异序列“5
’‑
gtgggcgccaacaagtccaa-3
’”
(对应rad51c-3突变体)或/和rad51d基因第一外显子的特异序列“5
’‑
aatggcgatggcggcgacgt-3
’”
(对应rad51d-4突变体)或/和“5
’‑
ttccccaggcctcctccctc-3
’”
(对应rad51d-5突变体)。
75.所述crispr-cas9系统为重组载体pcambia1300-cas9-sgrna。
76.本发明还提供了一种提高植物重组频率的方法，所述方法包括步骤m，所述步骤m为增强、提高或上调目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调前文所述蛋白的编码基因的表达量，来提高植物重组频率和/或育性。
77.本发明提供一种培育重组频率和/或育性降低的植物的方法，包括抑制或降低或沉默目的植物中上述蛋白的编码基因的表达和/或上述蛋白的含量和/或活性，或/和抑制或降低或沉默上述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到重组频率和/或育性降低的植物。
78.在本发明的一个实施方案中，所述培育重组频率和/或育性降低植物的育种方法包括如下步骤：
79.(1)构建抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的重组载体；
80.(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物(如作物或水稻)中，获得重组频率和/或育性低于所述受体植物的植物。
81.上文中，所述重组载体可为重组敲除载体pcambia1300-sgrna1、重组敲除载体pcambia1300-sgrna2、重组敲除载体pcambia1300-sgrna3。
82.重组敲除载体pcambia1300-sgrna1是在pcambia1300-cas9载体限制性内切酶kpni和bamhi的识别位点之间插入序列为序列表中序列7的dna片段，保持pcambia1300-cas9载体其他序列不变得到的重组质粒。所述sgrna的靶序列如序列表的seq id no.1的第160-179位所示。
83.重组敲除载体pcambia1300-sgrna2是在pcambia1300-cas9载体限制性内切酶kpni和bamhi的识别位点之间插入序列为序列表中序列8的dna片段，保持pcambia1300-cas9载体其他序列不变得到的重组质粒。所述sgrna的靶序列如序列表的seq id no.4的第1-20位所示。
84.重组敲除载体pcambia1300-sgrna3是在pcambia1300-cas9载体限制性内切酶kpni和bamhi的识别位点之间插入序列为序列表中序列9的dna片段，保持pcambia1300-cas9载体其他序列不变得到的重组质粒。所述sgrna的靶序列如序列表的seq id no.4的第43-62位所示。
85.本发明中，所述植物育种的目的可包括培育重组频率和/或育性降低的植物。
86.本发明中，所述植物育种的目的可包括培育重组频率和/或育性提高的植物。
87.本发明中，所述调控育性可为调控植物株高、花粉、结实率和花粉可染率。
88.本发明中，所述调控重组频率可为调控植物性母细胞中二价体数目、交叉结频率和交叉指示蛋白hei10的数目和分布。
89.本发明中，所述育性调控阶段包含营养生长阶段和生殖生长阶段。
90.所述重组频率调控阶段的所述生殖生长阶段具体为减数分裂时期。
91.前文所述的蛋白质和/或所述的生物材料也属于本发明要求保护的范围。
92.本发明中，所述植物可为如下中的任一种：
93.c1)单子叶植物；
94.c2)禾本目植物；
95.c3)禾本科植物；
96.c4)稻属植物；
97.c5)水稻。
98.所述水稻具体可为盐稻8号或rad51c和rad51d基因突变体。所述rad51c和rad51d基因突变体具体为突变体rad51c-3、rad51d-4和rad51d-5。
99.本发明利用crispr/cas9基因编辑技术对水稻重组关键基因rad51c和rad51d进行编辑，发现不同等位突变植株中遗传重组频率发生了不同程度的降低。综合遗传学和细胞生物学等手段发现，rad51c和rad51d特异的参与调控水稻减数分裂过程中交换的形成。这一研究为加速水稻新品种的培育、缩短育种周期提供了重要的基因资源和技术支撑。通过对更多关键基因进行同步编辑，有望实现对遗传重组更大幅度的调控。此外，由于遗传重组过程在不同动植物中较为保守，该研究思路也有望适用于其它动植物的理论研究和新品种培育。
附图说明
100.图1为rad51c和rad51d的基因结构及crispr/cas9定点突变体的突变位点。
101.图2为rad51c和rad51d的基因crispr/cas9定点突变体的表型分析。其中a为抽穗期的植株表型；b为野生型及突变体花粉，标尺＝50μm；c为野生型及突变体穗子，使用白色三角指示突变体穗子上的种子；d为野生型及突变体的结实率统计；e为野生型及突变体可染花粉的统计。显著性分析采用t检验，****，p《0.0001。
102.图3为野生型和突变体花粉母细胞的染色体行为。其中a为野生型；b为rad51c-3突变体；c为rad51d-4突变体；d为rad51d-5突变体。标尺＝5μm。野生型具有12个二价体，而在rad51c-3、rad51d-4和rad51d-5突变体中，一部分细胞含有12个二价体或表现为染色体缠绕，而其他细胞均表现为单价体与二价体共存的表型，表明交叉结减少了。
103.图4为rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体不同转基因株系的表型。其中a为rad51c-3；b为rad51d-4；c为rad51d-5。不同转基因株系中期i染色体表型(标尺＝5μm)及使用i
2-ki染色的花粉表型(标尺＝50μm)。
104.图5为rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中二价体数目和交叉结频率统计。其中a为中期i二价体数目统计；b为中期i染色体交叉结频率统计。显著性分析采用t检验，****，p《0.0001；***，p＝0.0003。
105.图6为rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中hei10信号显著减少。其中a为粗线期野生型、rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中hei10的定位情况；b为晚粗线期野生型、rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中hei10的定位情况，标尺＝5μm；c为粗线期野生型、rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中hei10信号的统计分析；d为晚粗线期野生型、rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中hei10信号的统计分析。显著性分析采用t检验，****，p《0.0001；**，p＝0.0015；*，p＝0.0152；***，p＝0.0001。
具体实施方式
106.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
107.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
108.以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
109.下述实施例中的pcambia1300-cas9质粒已记载于：chun wang,lan shen,yaping fu,changjie yan,kejian wang.a simple crispr/cas9 system for multiplex genome editing in rice.journal of genetics and genomics,2015,42(12):703-706.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
110.下述实施例中的sk-grna质粒已记载于：chun wang,lan shen,yaping fu,changjie yan,kejian wang.a simple crispr/cas9 system for multiplex genome editing in rice.journal of genetics and genomics,2015,42(12):703-706.公众可从
申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
111.下述实施例中的盐稻8号已记载于：fanfan zhang,ding tang,yi shen,zhihui xue,wenqing shi,lijun ren,guijie du,yafei li,zhukuan cheng.the f-box protein zygo1 mediates bouquet formation to promote homologous pairing,synapsis,and recombination in rice meiosis.plant cell,2017,29(10):2597
–
2609.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
112.下述实施例采用spss11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用t检验，p＜0.05(*)表示具有显著性差异，p＜0.01(**)表示具有极显著性差异，p＜0.001(***)及p＜0.0001(****)表示具有极显著性差异。
113.实施例1、基于crispr/cas9基因编辑的rad51c和rad51d基因突变体的制备rad51c基因在水稻数据库rice genome annotation project的编码序列(cds)如seq id no.1所示的核苷酸序列，基因组序列如seq id no.2所示，为编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，编码蛋白具有349个氨基酸，包含一个reca结构域。rad51d基因在水稻数据库rice genome annotation project的编码序列(cds)如seq id no.4所示的核苷酸序列，基因组序列如seq id no.5所示，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示，编码蛋白具有283个氨基酸，同样包含一个reca结构域。
114.1、crispr/cas9方法对rad51c和rad51d基因进行定点突变
115.1)sgrna载体构建
116.选取rad51c第二外显子的特异序列“5
’‑
gtgggcgccaacaagtccaa-3
’”
及rad51d第一外显子的特异序列“5
’‑
aatggcgatggcggcgacgt-3
’”
和“5
’‑
ttccccaggcctcctccctc-3
’”
为靶位点。使用限制性内切酶aari(ferment)酶切中间载体sk-grna载体骨架，随后将退火形成双链的靶序列插入到sk-grna载体中，获得中间载体sk-sgrna1重组载体、sk-sgrna2重组载体和sk-sgrna3重组载体。
117.用于载体构建的引物序列如下：
118.rad51c-3-cas9-f:5
’‑
ggcagtgggcgccaacaagtccaa-3’119.rad51c-3-cas9-r:5
’‑
aaacttggacttgttggcgcccac-3’120.rad51d-4-cas9-f:5
’‑
ggcaaatggcgatggcggcgacgt-3’121.rad51d-4-cas9-r:5
’‑
aaacacgtcgccgccatcgccatt-3’122.rad51d-5-cas9-f:5
’‑
ggcattccccaggcctcctccctc-3’123.rad51d-5-cas9-r:5
’‑
aaacgagggaggaggcctggggaa-3’124.sk-sgrna1重组载体是将sk-grna载体的限制性内切酶aari识别位点间的小片段替换为5
’‑
gtgggcgccaacaagtccaa-3’的片段，保持sk-grna载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体sk-sgrna1表达5
’‑
gtgggcgccaacaagtccaa-3’的sgrna。
125.sk-sgrna2重组载体是将sk-grna载体的限制性内切酶aari识别位点间的小片段替换为5
’‑
aatggcgatggcggcgacgt-3’的片段，保持sk-grna载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体sk-sgrna1表达5
’‑
aatggcgatggcggcgacgt-3’的sgrna。
126.sk-sgrna3重组载体是将sk-grna载体的限制性内切酶aari识别位点间的小片段替换为5
’‑
ttccccaggcctcctccctc-3’的片段，保持sk-grna载体的其他序列不变，得到的重
组表达载体。重组载体sk-sgrna1表达5
’‑
ttccccaggcctcctccctc-3’的sgrna。
127.2)crispr-cas9重组载体pcambia1300-cas9-sgrna的构建
128.使用kpni和bamhi对插入靶序列的中间载体sk-sgrna1重组载体、sk-sgrna2重组载体和sk-sgrna3重组载体进行双酶切，获得含有靶基因序列的片段。
129.使用kpni和bamhi对pcambia1300-cas9双元载体进行双酶切，获得pcambia1300-cas9双元载体的线性骨架片段。
130.将上述含有靶基因序列的片段和pcambia1300-cas9双元载体的线性骨架片段连接，获得重组敲除载体pcambia1300-sgrna1、pcambia1300-sgrna2和pcambia1300-sgrna3。
131.重组敲除载体pcambia1300-sgrna1是在pcambia1300-cas9载体限制性内切酶kpni和bamhi的识别位点之间插入序列为序列表中序列7的dna片段，保持pcambia1300-cas9载体其他序列不变得到的重组质粒。
132.重组敲除载体pcambia1300-sgrna2是在pcambia1300-cas9载体限制性内切酶kpni和bamhi的识别位点之间插入序列为序列表中序列8的dna片段，保持pcambia1300-cas9载体其他序列不变得到的重组质粒。
133.重组敲除载体pcambia1300-sgrna3是在pcambia1300-cas9载体限制性内切酶kpni和bamhi的识别位点之间插入序列为序列表中序列9的dna片段，保持pcambia1300-cas9载体其他序列不变得到的重组质粒。
134.2、rad51c和rad51d转基因水稻植株的获得
135.采用电击法分别将上述重组敲除载体pcambia1300-sgrna1、pcambia1300-sgrna2和pcambia1300-sgrna3转入农杆菌eha105(博迈德，bc303-01)，获得重组农杆菌eha105/pcambia1300-cas9-sgrna1，重组农杆菌eha105/pcambia1300-cas9-sgrna2及重组农杆菌eha105/pcambia1300-cas9-sgrna3。
136.随后将重组农杆菌eha105/pcambia1300-cas9-sgrna1，重组农杆菌eha105/pcambia1300-cas9-sgrna2及重组农杆菌eha105/pcambia1300-cas9-sgrna3转入野生型盐稻8号的成熟胚愈伤。具体实验步骤如下：
137.(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导和继代培养：选取饱满的野生型盐稻8号的成熟种子，去掉衣壳，使用75％酒精浸泡5min，再使用5％ naclo处理40min。无菌水冲洗5次后于nb培养基中培养14d以诱导愈伤组织。切下愈伤组织，在nb培养基(b5培养基基盐3163.98mg/l(coolaber,pm1321)，30g/l蔗糖，500mg/l酶解酪蛋白，7g/l琼脂粉，2mg/l 2,4-d，余量为水，ph 5.8)继代培养两次，每次10d。
138.(2)农杆菌的培养：在含50mg/l卡那霉素和25mg/l利福平的yep液体培养基(胰蛋白胨5g/l，酵母提取物1g/l，牛肉浸膏5g/l，蔗糖5g/l，硫酸镁2mm/l，ph 7.0)中接种农杆菌，于28℃的摇床中暗培养16-18h，4000rpm离心收集菌体，倒掉上清，加入适量aam培养基(aa盐分和氨基酸，ms维生素，0.5g/l酶解酪蛋白，36g/l葡萄糖，68.5g/l蔗糖，100μm/l乙酰丁香酮，余量为水，ph 5.8)将沉淀重悬。
139.(3)浸染：愈伤组织放入菌液后室温放置20min，期间轻轻摇晃。随后取出愈伤组织，使用无菌滤纸吸去多余液体后转入nbc培养基(nb培养基组分，10g/l葡萄糖，100μm/l乙酰丁香酮，ph 5.8)26℃避光培养3d，随后转入nbcs1培养基(nb培养基组分，潮霉素或g418 25mg/l，头孢霉素500mg/l，ph 5.8。)进行筛选培养2周，最后在nbcs2培养基(nb培养基组
分，潮霉素或g418 50mg/l，头孢霉素200mg/l，ph 5.8)上继续筛选培养2周。
140.(4)分化培养：将生长状态较好的愈伤组织转入nba分化培养基(nb培养基组分，2mg/l 6-ba，1mg/l naa，5mg/l aba，ph 5.8)，26℃分化培养20d(每天光照12h，光强2000lx)。
141.(5)生根培养：分化出的幼苗转入1/2ms培养基(1/2ms基本成分，30g/l蔗糖，0.5mg/l naa，7g/l琼脂粉，50mg/l潮霉素，余量为水，ph 5.8)进行生根培养。根系发育健壮时，取出幼苗，清水中室温浸泡2d之后移入大田。获得t0代水稻植株。
142.提取转基因水稻植株的dna，应用相对应的引物(见下述用于突变体鉴定的引物序列)检测不同grna靶位点的编辑效率。rad51c基因在水稻数据库rice genome annotation project基因组序列为seq id no.2所示的核苷酸序列，rad51d基因在水稻数据库rice genome annotation project的基因组序列为seq id no.5所示的核苷酸序列。
143.用于突变体鉴定的引物序列如下：
144.rad51c-3-jd-f:5
’‑
ttggtaccagtgtctttgctc-3’145.rad51c-3-jd-r:5
’‑
aaggatgttgttgaggtcagc-3’146.rad51d-4-jd-f:5
’‑
gaagggattccagtgggc-3’147.rad51d-4-jd-r:5
’‑
ctcctgtaccccaagcaca-3’148.rad51d-5-jd-f:5
’‑
gaagggattccagtgggc-3’149.rad51d-5-jd-r:5
’‑
ctcctgtaccccaagcaca-3’150.对于某一转基因株系(一个愈伤组织来源的t0代植株及其自交后代)，如果该株系中t0代植株及其自交后代植株鉴定均为纯合突变且无cas9基因，该株系为纯合植株。
151.具体鉴定方法如下：首先利用pcr方法，鉴定出不同愈伤来源的t0代阳性植株10-20个，单株收种，并随机选取30粒分别播种，获得t1代植株。采用pcr方法对t1代植株进行突变位点和cas9基因的鉴定，具有纯合突变且无cas9基因的植株即为后续实验所需的纯合株系。继续按照上述方法验证，获得遗传稳定的转基因纯合株系一共8个。
152.对t1代转基因株系的鉴定结果显示，这三个载体分别导致rad51c和rad51d基因缺失或插入1或2bp(图1)。对于pcambia1300-sgrna1载体，共获得3个纯系，分别命名为rad51c-3突变体line 1-3；对于pcambia1300-sgrna2载体，共获得3个纯系，分别命名为rad51d-4突变体line 4-6；对于pcambia1300-sgrna3载体，共获得2个纯系，分别命名为rad51d-5突变体line 7-8。
153.rad51c-3突变体是将重组农杆菌eha105/pcambia1300-cas9-sgrna1转入野生型盐稻8号的成熟胚愈伤，针对rad51c基因的靶序列5
’‑
gtgggcgccaacaagtccaa-3’突变获得的转基因植株。
154.rad51d-4突变体是将重组农杆菌eha105/pcambia1300-cas9-sgrna2及重组农杆菌eha105/pcambia1300-cas9-sgrna3转入野生型盐稻8号的成熟胚愈伤，针对rad51d基因的靶序列5
’‑
aatggcgatggcggcgacgt-3’突变获得的转基因植株。
155.rad51d-4突变体是将重组农杆菌eha105/pcambia1300-cas9-sgrna3转入野生型盐稻8号的成熟胚愈伤，针对rad51d基因的靶序列5
’‑
ttccccaggcctcctccctc-3’突变获得的转基因植株。
156.3、转基因阳性株系的鉴定
157.为了确定转基因阳性植株，将步骤2获得的t0代基因编辑的植株分别自交1代，得到t1代基因编辑的植株。之后按照上述pcr方法检测t1代基因编辑的植株的突变类型。共获得8个纯合突变体：line1、line2、line3、line4、line5、line6、line7和line8。
158.line1与野生型相比，对于rad51c基因，2条同源染色体中rad51c基因均发生了如下突变：rad51c基因中的“5
’‑
gtgggcgccaacaagtccaaggg-3’(对应于seq id no.1的第160-182位，seq id no.2的第488-510位)”突变为“5
’‑
gtgggcgccaacaagtctcaaggg-3
’”
。该突变使序列表中序列1的第176-177位的核苷酸之间插入“t”，该核苷酸的插入引起了移码，导致翻译提前终止，造成rad51c蛋白功能缺失，从而将rad51c基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1。
159.line2与野生型相比，对于rad51c基因，2条同源染色体中rad51c基因均发生了如下突变：rad51c基因中的“5
’‑
gtgggcgccaacaagtccaaggg-3’(对应于seq id no.1的第160-182位，seq id no.2的第488-510位)”突变为“5
’‑
gtgggcgccaacaagtcgcaaggg-3
’”
。该突变使序列表中序列1的第176-177位的核苷酸之间插入“g”，该核苷酸的插入引起了移码，导致翻译提前终止，造成rad51c蛋白功能缺失，从而将rad51c基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1。
160.line3与野生型相比，对于rad51c基因，2条同源染色体中rad51c基因均发生了如下突变：rad51c基因中的“5
’‑
gtgggcgccaacaagtccaaggg-3’(对应于seq id no.1的第160-182位，seq id no.2的第488-510位)”突变为“5
’‑
gtgggcgccaacaagtcaaggg-3
’”
。该突变使序列表中序列1的第176位的核苷酸“c”缺失，该核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成rad51c蛋白功能缺失，从而将rad51c基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1。
161.line4与野生型相比，对于rad51d基因，2条同源染色体中rad51d基因均发生了如下突变：rad51d基因中的“5
’‑
atggcgatggcggcgacgtcgg-3’(对应于seq id no.4的第1-22位，seq id no.5的第33-54位)”突变为“5
’‑
atggcgatggcggcgcgtcgg-3
’”
。该突变使序列表中序列4的第16位的核苷酸“a”缺失，该核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成rad51d蛋白功能缺失，从而将rad51d基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1。
162.line5与野生型相比，对于rad51d基因，2条同源染色体中rad51d基因均发生了如下突变：rad51d基因中的“5
’‑
atggcgatggcggcgacgtcgg-3’(对应于seq id no.4的第1-22位，seq id no.5的第33-54位)”突变为“5
’‑
atggcgatggcggcgaacgtcgg-3
’”
。该突变使序列表中序列4的第16-17位的核苷酸之间插入“a”，该核苷酸的插入引起了移码，导致翻译提前终止，造成rad51d蛋白功能缺失，从而将rad51d基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1。
163.line6与野生型相比，对于rad51d基因，2条同源染色体中rad51d基因均发生了如下突变：rad51d基因中的“5
’‑
atggcgatggcggcgacgtcgg-3’(对应于seq id no.4的第1-22位，seq id no.5的第33-54位)”突变为“5
’‑
atggcgatggcggcgatcgtcgg-3
’”
。该突变使序列表中序列4的第16-17位的核苷酸之间插入“t”，该核苷酸的插入引起了移码，导致翻译提前终止，造成rad51d蛋白功能缺失，从而将rad51d基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1。
164.line7与野生型相比，对于rad51d基因，2条同源染色体中rad51d基因均发生了如下突变：rad51d基因中的“5
’‑
ttccccaggcctcctccctccgg-3’(对应于seq id no.4的第43-65位，seq id no.5的第75-97位)”突变为“5
’‑
ttccccaggcctcctcctccgg-3
’”
。该突变使序列表中序列4的第59位核苷酸“c”缺失，该核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成rad51d蛋白功能缺失，从而将rad51d基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1。
165.line8与野生型相比，对于rad51d基因，2条同源染色体中rad51d基因均发生了如下突变：rad51d基因中的“5
’‑
ttccccaggcctcctccctccgg-3’(对应于seq id no.4的第43-65位，seq id no.5的第75-97位)”突变为“5
’‑
ttccccaggcctcctctccgg-3
’”
。该突变使序列表中序列4的第59-60位核苷酸“cc”缺失，这两个核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成rad51d蛋白功能缺失，从而将rad51d基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1。
166.实施例2、crispr/cas9基因编辑的rad51c和rad51d基因突变体表型分析
167.考察植株：实施例1中获得的突变体rad51c-3的line 1、rad51d-4的line 4及rad51d-5的line 7、野生型盐稻8号
168.种植条件：室温28℃，光周期：16小时光照/8小时黑暗，湿度60％-70％。观察并统计株高，花粉，结实率和花粉可染率。统计用材料实验重复3次，每次每个株系测定3株以上。
169.1％ i
2-ki染色分析实验步骤如下：从盛花期的水稻小花中取出花药放于载玻片上，使用解剖针横切花药，将其浸润于1％ i
2-ki染色液中染色1-3分钟，盖上盖玻片，置于40
×
光学显微镜下观察。
170.结果如图2所示，在营养生长时期，突变体rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5与野生型盐稻8号相比无明显差异；但是在生殖生长阶段，突变体rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5表现为部分不育(图2中a-c)。
171.对该突变体花粉进行1％ i
2-ki染色分析结果发现，相比于野生型饱满可染的花粉，突变体花粉大部分不着色，形状不规则，说明突变体花粉部分败育(图2中b)。
172.对突变体的结实率和花粉可染率进行统计发现：突变型植株rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5的结实率分别为8.5
±
0.9％(n＝10)，30.1
±
1.8％(n＝13)，和1.0
±
0.4％(n＝12)；花粉可染率分别为10.3
±
0.8％(n＝10),24.8
±
1.6％(n＝11)，和1.8
±
0.4％(n＝9)，均显著低于野生型，且呈现不同程度的降低(图2中d和e)。
173.实施例3、crispr/cas9基因编辑的rad51c和rad51d基因突变体细胞学表型分析
174.考察植株：实施例1中获得的突变体rad51c-3的line 1、rad51d-4的line 4及rad51d-5的line 7、野生型盐稻8号。
175.种植条件：室温28℃，光周期：16小时光照/8小时黑暗，湿度60％-70％。统计用材料实验重复3次，每次每个株系测定3株以上。
176.1.野生型及定点突变体中的细胞学表型分析
177.结果如图3所示：野生型盐稻8号中，终变期12个二价体清晰可见，中期i时12个二价体整齐排列在赤道板上面(图3中a)。在rad51c-3和rad51d-4突变体中，有的花粉母细胞呈现野生型表型即具有12个二价体，而其他细胞具有明显缺陷，表现为：终变期和中期i二价体和单价体共存(图3中b和c)。在rad51d-5突变体中，几乎没有观察到野生型表型的细
胞，终变期和中期i一些细胞中二价体和单价体共存，而在其他细胞中可以观察到明显的染色体缠绕(图3中d)。这些突变体在二价体形成上的表型说明rad51c和rad51d在重组晚期具有促进交换形成的功能。
178.2、转基因株系的细胞学表型-中期i染色体观察
179.对实施例1中获得的转基因株系line1-8进行中期i染色体表型观察。取处于减数分裂时期的野生型或者突变体幼穗于乙醇-冰醋酸(3:1)固定液中室温固定24h。将固定好的花药在1％的醋酸洋红染液中捣碎，盖上盖玻片，之后用45％醋酸脱色两次。液氮速冻去掉盖玻片，滴加dapi(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，盖上盖玻片，即可用于观察。
180.结果发现：rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体的所有转基因株系表型一致(图4中a-c)，说明rad15c和rad51d基因突变确实是导致这些植株二价体数目减少的原因。
181.3、rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体的交叉结数目
182.为了探究rad51c和rad51d在交换形成中的功能，对中期i染色体的二价体数目和交叉结数目进行了统计。实验重复3次，每次每个株系统计3株以上。
183.根据中期i染色体的形态可以计算交叉数目，一般认为棒状染色体有1个交叉结，环状染色体有两个交叉结，根据棒状染色体和环状染色体的数目即可计算交叉结数目。
184.交叉结数目＝棒状染色体数目
×
1+环状染色体数目
×2185.结果如图5所示：野生型盐稻8号中有12个二价体，而rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中二价体数目显著下降到10.3
±
0.2(n＝73,p《0.0001)，10.9
±
0.1(n＝66,p《0.0001),和7.0
±
0.4(n＝37,p《0.0001)(图5中a)。野生型中交叉结数目为20.6
±
0.2(n＝58)，而rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中交叉结数目显著下降到17.3
±
0.3(n＝73,p《0.0001)，19.4
±
0.3(n＝66,p＝0.0003)和9.9
±
0.8(n＝37,p《0.0001)(图5中b)。这些结果表明rad51c和rad51d基因参与了水稻的重组频率调控。
186.4、rad51c和rad51d参与了交换成熟过程
187.采用免疫荧光染色的方法检测了rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中hei 10的定位情况，以研究rad51c和rad51d在交换形成中的具体功能。
188.(1)用4％的多聚甲醛固定新鲜水稻幼穗30min；
189.(2)随后用1
×
pbs清洗。选取合适时期的小花置于载玻片，用解剖针挑出花药并敲碎，加盖盖玻片，压片；
190.(3)将压片后的载玻片于液氮中冷冻完全，用刀片迅速揭去盖玻片，自然晾干；
191.(4)一抗孵育。每张载玻片上加上含有hei 10一抗(1％，鼠源多抗，参考文献：kejian wang,mo wang,ding tang,yi shen,chunbo miao,qing hu,tiegang lu,zhukuan cheng.the role of rice hei 10in the formation of meiotic crossovers，plos genetics.2012,8(7):e1002809.)的1
×
pbs溶液，盖上塑盖片，放入湿盒内于37℃孵育1h；
192.(5)洗一抗。使用1
×
pbs洗涤3次，每次5min；
193.(6)二抗孵育。每张载玻片上加上50μl含有二抗(fitc偶联的羊抗鼠抗体)的1
×
tnb溶液，上塑盖片，放入湿盒内于37℃孵育30min；
194.(7)洗二抗。使用1
×
pbs洗涤3次，每次5min；
195.(8)晾干，每张载玻片加10μl dapi溶液，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察拍照。
196.在野生型盐稻8号中，hei 10在粗线期呈点状信号并沿着染色体呈线状分布，与联
会复合体的中央元件zep1共定位(图6中a)。到了晚粗线期，hei 10小的点状信号消失，而是呈现散布在染色体的少量大点信号，这些信号标记了交换成熟的位置(图6中b)。在rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中hei10信号仅仅局限于存在zep1信号的部分配对的染色体区域，统计结果发现：rad51c-3、rad51d-4及rad51d-5突变体中粗线期和晚粗线期hei10信号数目都显著少于野生型(图6中c-d)，表明rad51c和rad51d参与了交换的成熟过程。
197.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物重组频率和/或育性中的应用；2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备调控植物重组频率和/或育性的产品中的应用；3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在培育重组频率和/或育性改变的植物中的应用；4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备培育重组频率和/或育性改变的植物的产品中的应用；5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：a1)氨基酸序列为seq id no.3的蛋白质；a2)氨基酸序列为seq id no.6的蛋白质；a3)与a1)或a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；a4)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于水稻。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：c1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；e1)抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白的编码基因表达的核酸分子；e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物
细胞系；e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：c1)所述核酸分子为如下任一所示的dna分子，d1)核苷酸序列是seq id no.2所示的dna分子；d2)编码区序列是序列表中seq id no.1所示的dna分子；d3)核苷酸序列是seq id no.5所示的dna分子；d4)编码区序列是序列表中seq id no.4所示的dna分子；d5)在严格条件下与d1)、d2)、d3)或d4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的dna分子。5.一种提高植物重组频率和/或育性的方法，其特征在于：所述方法包括步骤m，所述步骤m为增强、提高或上调目的植物中权利要求1或2所述应用中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调权利要求1或2所述应用中所述蛋白的编码基因的表达量，来提高植物重组频率和/或育性。6.一种降低植物重组频率和/或育性的方法，其特征在于：所述方法包括步骤p，所述步骤p为抑制或降低或沉默目的植物中权利要求1或2所述应用中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默权利要求1或2所述应用中所述蛋白的编码基因的表达量，来降低植物重组频率和/或育性。7.一种培育重组频率和/或育性降低的植物育种方法，其特征在于：包括抑制或降低或沉默目的植物中权利要求要求1或2所述应用中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到重组频率和/或育性降低的植物，所述重组频率和/或育性降低的植物的重组频率和/或育性低于所述受体植物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)构建抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的重组表达载体；(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物中，获得植物重组频率和/或育性低于所述受体植物的植物。9.权利要求1或2所述的应用中的蛋白质和/或权利要求3或4所述的应用中的生物材料。10.根据权利要求1-4任一所述的应用、权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述植物是如下中的任一种：c1)单子叶植物；c2)禾本目植物；c3)禾本科植物；c4)稻属植物；c5)水稻。

技术总结
本发明公开了水稻重组频率调控相关基因RAD51C和RAD51D的应用。本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及水稻重组频率调控相关基因RAD51C和RAD51D的应用。本发明通过调控水稻基因组中重组频率相关蛋白质的编码基因的表达、或者重组频率相关蛋白质的活性或含量来降低水稻重组频率；蛋白质RAD51C的氨基酸序列为SEQ IDNo.3，蛋白质RAD51D的氨基酸序列为SEQ ID No.6。通过CRISPR-Cas9载体对水稻内源RAD51C或/和RAD51D的基因进行敲除，基因敲除水稻植株的重组频率与对照相比显著降低。本发明对水稻优势品种的选育及种质资源的开发具有重要意义。有重要意义。


技术研发人员：张凡凡 程祝宽 马利军 石文清 周月
受保护的技术使用者：北京师范大学
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/9/14