来源于清溪花鳖的抗衰老多肽及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及来源于清溪花鳖的抗衰老多肽及其应用。


背景技术：

2.衰老是机体随时间推移各项生理功能逐渐退化，直至最后死亡的生理过程。衰老不是一种病，是很多疾病如阿尔兹海默氏症(ad)、帕金森病(pd)、癌症、糖尿病主要的风险因素。免疫学说认为，机体衰老是由于机体对外来物质免疫反应下降或自身免疫过多导致的，提高免疫功能具有抗衰老的作用。
3.鳖肉营养丰富，含有蛋白质、矿物元素和多种活性物质，具有较高药用价值，能提高人体免疫功能、促进新陈代谢、延缓衰老，是一种药食同源佳肴。现有对鳖肉酶解产物鳖肽的研究相对较少，已有研究显示其具有抗氧化、降血压、提高免疫力、抗衰老等功能，但是多是基于对水解所得肽混合物的研究，单肽的研究很少且多聚焦抗氧化和降血压方面，鲜少有关于单肽抗衰老方面的研究。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供来源于清溪花鳖的抗衰老多肽及其应用的技术方案。
5.本发明具体采用以下技术方案实现：
6.本发明第一方面提供了来源于清溪花鳖的抗衰老多肽，该多肽包括：
7.(1)、如seq id no.1所述的氨基酸序列；或
8.(2)、如seq id no.2所述的氨基酸序列；或
9.(3)、如(1)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
10.(4)、如(2)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(2)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
11.(5)、与(1)或(2)或(3)或(4)所述序列至少有90％同源性的氨基酸序列。
12.本发明第二方面提供了上述的多肽在制备改善或治疗运动能力药物或食品中的应用。
13.本发明第三方面提供了上述的多肽在制备提高或治疗生殖能力药物或食品中的应用。
14.本发明第四方面提供了上述的多肽在制备抗衰老药物或食品中的应用。
15.本发明第五方面提供了上述的多肽在制备治疗与衰老相关疾病药物或食品中的应用。
16.本发明涉及的多肽来源于清溪花鳖肽，清溪花鳖肽通过生物水解清溪花鳖获得，经检测、比对获得清溪花鳖肽中含有的4000余条肽信息。采用数据库预测和计算机模拟分子对接的方法筛选出可能具有生物活性的肽，筛选得到的生物活性肽与多个toll样受体
(tlr)有很强的亲和力，具有免疫相关功能，推测其在抗衰老方面存在一定潜力。随着年龄增加，机体的健康寿命指标运动能力和生殖能力会随之降低，通过秀丽隐杆线虫(简称线虫)动物模型实验发现，本发明来源于清溪花鳖肽的多肽能够明显改善线虫的运动能力和生殖能力，说明本发明的生物活性肽有利于健康寿命的提高，具有抗衰老的作用。
附图说明
17.图1为本发明中十六肽的ms图；
18.图2为本发明中八肽的ms图；
19.图3为本发明中十六肽对线虫头部摆动影响图；
20.图4为本发明中十六肽对线虫身体摆动影响图；
21.图5为本发明中八肽对线虫头部摆动影响图；
22.图6为本发明中八肽对线虫身体摆动影响图；
23.图7为本发明中十六肽对线虫吞咽速率影响图；
24.图8为本发明中八肽对线虫吞咽速率影响图；
25.图9为本发明中十六肽对线虫产卵影响图；
26.图10为本发明中八肽对线虫产卵影响图；
27.图11为本发明中十六肽对线虫存活率影响图，图中“*”10μg/ml与空白比较，“#”20μg/ml与空白比较，“*”和“#”表示p《0.05，“**”和“##”表示p《0.01，“***”和“###”表示p《0.001；
28.图12为本发明中八肽对线虫存活率影响图，图中“*”10μg/ml与空白比较，“*”和“#”表示p《0.05，“**”和“##”表示p《0.01，“***”和“###”表示p《0.001。
具体实施方式
29.以下结合实施例来进一步说明本发明。
30.实施例1：来源于清溪花鳖的生物活性多肽的制备与筛选
31.1、水解
32.清溪花鳖洗净，去内脏、油脂
→
100℃下蒸煮2h
→
冷却至60℃后加入0.6％中性蛋白酶和碱性蛋白酶(1:1)
→
搅拌条件下，60℃酶解3h
→
高温水浴灭酶15min
→
过滤、纯化，保留上清液
→
干燥后获得清溪花鳖肽粉末。
33.2、lc-ms检测
34.液相-质谱(lc-ms)联用技术分析步骤1中获得的清溪花鳖肽粉末，使用proteome discoverer软件与ncbi中华鳖蛋白序列(gcf_000230535.1)比对，获得4000多条肽信息。色谱条件色谱柱：beh300 c18(2.1*100mm，1.7μm)，流动相a相0.1％甲酸水溶液，b相0.1％甲酸的乙腈溶液，柱温35℃，进样体积25μl，梯度洗脱程序0-2min 5％ b相，2-19min 5％-100％ b相，19-21min 100％b相。质谱条件：full ms-dd ms(topn)模式，targeted sim-dd ms模式，离子源esi，正离子采集模式，full ms[100-1500]ms，喷雾电压3.5kv，气体为鞘气40units，辅助气10units，吹扫气0units，离子源温度320℃，辅助气温度350℃。
[0035]
3、活性肽筛选
[0036]
使用peptideranker和toxinpred分别对获得的肽进行生物活性和毒性预测。用
autodockvina软件进行分子对接，发现有两条肽具有潜在生物活性的肽与多个tlr具有较高的亲和力，分别是十六肽pgsgappaapalgygy(如seq id no.1所示)和八肽ffdanayp(如seq id no.2所示)。
[0037]
表1
[0038][0039]
4、目标肽合成
[0040]
十六肽合成
[0041]
采用固相合成法，按照氨基酸序列pro-gly-ser-gly-ala-pro-pro-ala-ala-pro-ala-leu-gly-tyr-gly-tyr的特征，先将tyr的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后tyr的氨基和gly的羧基进行缩水反应，处理后再添加tyr，让gly的氨基和tyr的羧基再反应，接着依次从右到左添加氨基酸，添加到最后一个氨基酸pro，反应后切除树脂，即得到目标肽pgsgappaapalgygy。采用高效液相色谱(hplc)进行纯化，色谱柱为welch xb-c18(5μm，4.6*250mm)，流动相a：含有0.1％三氟乙酸(tfa)的乙腈；流动相b：含有0.1％tfa的水；25min内a相由15％上升到40％，流速1.0ml/min，检测波长220nm。要求纯度达到98％以上，并经质谱(ms)鉴定结构。
[0042]
表2为十六肽pgsgappaapalgygy的hplc检测结果，由表2可知，十六肽pgsgappaapalgygy的保留时间为12.325min，根据峰面积百分比得肽的纯度为98.14％，符合合成肽的纯度要求。由图1的ms图可知，合成肽为目标肽pgsgappaapalgygy。
[0043]
表2
[0044][0045]
八肽合成
[0046]
采用固相合成法，按照氨基酸序列phe-phe-asp-ala-asn-ala-tyr-pro的特征，先将pro的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后pro的氨基和tyr的羧基进行缩水反应，处理后再添加ala，tyr的氨基和ala的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，添加最后一个氨基酸phe，反应后再切除树脂，即得到目标肽ffdanayp。采用hplc进行纯化，色谱柱为welch xb-c18(5μm，4.6*250mm)，流动相a：含有0.1％三氟乙酸(tfa)的乙腈；流动相b：含有0.1％tfa的水；25min内a相由15％上升到40％，流速1.0ml/min，检测波长220nm。要求纯度达到98％以上，并经ms鉴定结构。
[0047]
表3为八肽ffdanayp的hplc检测结果，由表3可知，八肽ffdanayp的保留时间为11.266min，根据峰面积百分比得肽的纯度为98.94％，符合合成肽的纯度要求。由图2的ms图可知，合成肽为目标肽ffdanayp。
[0048]
表3
[0049][0050]
实施例2：来源于清溪花鳖的生物活性多肽的抗衰老实验
[0051]
(1)运动能力测定
[0052]
对n2野生型线虫进行同期化，并转至肽浓度分别为0、10、20、50μg/ml(即空白、低浓度、中浓度、高浓度)的线虫生长培养基(ngm)上培养。培养2d后，在显微镜下观察并记录20s内线虫头部摆动的次数和60s内线虫身体摆动的次数，作为线虫运动能力的指标。
[0053]
结论：十六肽pgsgappaapalgygy(图3)和八肽ffdanayp(图5)显著增加线虫的头部摆动次数，不具剂量依赖。十六肽增加线虫的身体摆动次数，低浓度效果优于高浓度(图4)；八肽浓度为20μg/ml时增加身体摆动次数，10μg/ml和50μg/ml肽浓度时次数低于空白组(图6)。两种肽对线虫运动能力都有改善作用，尤其是对头部摆动的改善效果非常显著，十六肽对身体摆动的作用优于八肽。整体而言，十六肽对线虫运动能力的改善好于八肽。
[0054]
(2)吞咽速率测定
[0055]
对n2线虫进行同期化，并转至肽浓度为0、10、20、50μg/ml的ngm上培养，2d后显微镜下观测其吞咽频率，记录20s内线虫的咽抽次数，作为线虫吞咽速率的指标。
[0056]
结论：十六肽在低、中浓度时显著增加线虫咽抽次数，提高线虫吞咽速率，改善线虫进食情况，高浓度时这种有益效果消失(图7)。八肽在低、中浓度时增加线虫咽抽次数，低浓度时与空白没有显著性差异，中浓度时与空白有显著性差异，同样地，高浓度时增加咽抽次数的效果消失(图8)。低、中浓度的十六肽和八肽均能提升线虫的吞咽速率，影响进食情况，相比于八肽，十六肽的效果更明显。
[0057]
(3)产卵率测定
[0058]
将同期化24h后的n2线虫转至肽浓度为0、10、20、50μg/ml的ngm上培养，1d后挑1条线虫至新板上培养24h，显微镜下观测产卵数量，实验重复三次。
[0059]
结论：十六肽低、高浓度时显著增加线虫产卵数量，中浓度时增加线虫产卵数量但不显著(图9)。八肽呈剂量依赖型增加线虫的产卵数量，中、高浓度时效果显著(图10)。由此可见，十六肽和八肽均能有效提升线虫的生殖能力。
[0060]
(4)僵化速率测定
[0061]
将同期化至l3期的cl2006线虫，分别转移至肽浓度为0、10、20μg/ml的ngm上，保证每个板上有30～40条线虫。28℃诱导培养24h后，开始观察并记录每组线虫的僵化数目，此后每一段时间计数一次，实验重复三次。用铂丝轻触线虫，若线虫无法向前或向后爬动，但头部可摆动，则认为该线虫发生了瘫痪病理性行为。
[0062]
结论：cl2006线虫是研究ad的模型，随着年龄增长会出现瘫痪表现，属于渐进性瘫痪线虫。单肽的加入能够明显改善cl2006线虫的瘫痪表型，延长瘫痪时间，相比于20μg/ml肽溶液，10μg/ml肽溶液的有益效果反而更加显著(图11-12)。不仅如此，随着时间的增加，低浓度肽溶液的积极作用越来越明显，尤其是十六肽。
[0063]
综上所述，本发明来源于清溪花鳖的十六肽和八肽能够明显改善线虫的运动能力和生殖能力，说明本发明的生物活性肽有利于健康寿命的提高，具有抗衰老的作用。

技术特征：
1.来源于清溪花鳖的抗衰老多肽，其特征在于该多肽包括：(1)、如seq id no.1所述的氨基酸序列；或(2)、如seq id no.2所述的氨基酸序列；或(3)、如(1)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(4)、如(2)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(2)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(5)、与(1)或(2)或(3)或(4)所述序列至少有90％同源性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的多肽在制备改善或治疗运动能力药物或食品中的应用。3.如权利要求1所述的多肽在制备提高或治疗生殖能力药物或食品中的应用。4.如权利要求1所述的多肽在制备抗衰老药物或食品中的应用。5.如权利要求1所述的多肽在制备治疗与衰老相关疾病药物或食品中的应用。

技术总结
来源于清溪花鳖的抗衰老多肽及其应用，属于生物技术领域。该多肽包括：如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列；或如SEQ ID No.2所述的氨基酸序列；或上述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与上述的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或与上述的序列至少有90％同源性的氨基酸序列。本发明来源于清溪花鳖的多肽能够明显改善线虫的运动能力和生殖能力，说明本发明的多肽有利于健康寿命的提高，具有抗衰老的作用。具有抗衰老的作用。具有抗衰老的作用。


技术研发人员：石丽华 向沙沙 张亚林 王润璋 阎芙洁 朱炫 陈杰
受保护的技术使用者：浙江清溪健康科技有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/9/14