生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法

1.本发明涉及生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法。


背景技术：

2.啤酒花是一种药食同源的植物，主要用于啤酒的制造过程，是啤酒生产的基本原料，其雌花不仅能够赋予啤酒香味和苦味，还能增加啤酒的防腐能力和非生物稳定性，是酿造啤酒的主要原料之一。
3.黄腐酚是雌性啤酒花中特有的异戊二烯基黄酮类物质，是由啤酒花的蛇麻腺分泌产生，目前被发现仅存在于啤酒花中，占啤酒花干重的0.1～1.0％。黄腐酚特殊的结构赋予其多重药理活性，大量研究表明黄腐酚在预防癌症、抗菌抗病毒、抗氧化、预防糖尿病、动脉粥样硬化以及抗骨质疏松等方面发挥重要作用。
4.cn101871924a公开了一种同步检测啤酒花中黄腐酚、异黄腐酚和8-异戊烯基柚皮素方法。
5.文献《identification of new phase ii metabolites of xanthohumol in rat in vivo biotransformation of hop extracts using high-performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry》(journal of chromatography a，2010jun 18；1217(25):4100-8.)报道了采用hplc-q-tof-ms/ms技术研究了黄腐酚在内的啤酒花及其提取物在大鼠体内的生物转化过程，并鉴定出2种ⅰ相代谢物，5种ⅱ相代谢物，其中ⅱ相代谢产物主要为黄腐酚硫酸酯。
6.文献《absorption,metabolism,and pharmacokinetic profile of xanthohumol in rats as determined via uplc-ms/ms》(biopharm drug dispos,2022feb；40(3):289-99)报道了采用uhplc-q-tof-ms/ms技术研究黄腐酚在sd大鼠体内(血浆、尿液、粪便)的吸收以及药物代谢动力学过程，其中发现了6种代谢物，分别为甲基化黄腐酚、黄腐酚葡萄糖醛酸酯、黄腐酚硫酸酯以及酸催化环化和氧化等的黄腐酚代谢物，同时为黄腐酚潜在的临床应用价值提供了参考。
7.文献《metabolism of xanthohumol and isoxanthohumol,prenylated flavonoids from hops(humulus lupulus l.),by human liver microsomes》(journal of mass spectrometry,2005feb；40:289-299)报道了利用人和大鼠混合肝微粒体研究了黄腐酚和异黄腐酚体外氧化代谢。采用液相色谱/串联质谱法(lc/ms/ms)鉴定代谢物，并与标准品比对，其中鉴定得到了19种化合物，主要为ⅰ相代谢产物。
8.然而，目前，黄腐酚在体内外的代谢过程和代谢产物尚不明确，如何从复杂的生物样品中筛选出代谢物仍然是一个难题，需要继续进一步研究。


技术实现要素：

9.本发明的目的是建立一种生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法，该方法能够较全面地检测黄腐酚的代谢产物。
10.本发明的目的通过如下技术方案实现。
11.本发明提供一种生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法，包括如下步骤：
12.(1)将生物样品进行处理，获得待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收黄腐酚后的含有黄腐酚及其代谢产物的含药血浆样品、含药尿液样品、含药粪便样品、含药肝脏样品和/或含药肝微粒体样品；
13.(2)将所述待测溶液采用液相色谱和质谱检测，其中：
14.液相色谱条件为：色谱柱：c
18
色谱柱；流动相：0.08～0.12vol％甲酸水溶液a与乙腈b；柱温：28～32℃；梯度洗脱程序：0～5min，90～95vol％b；5～10min，95～70vol％b；10～27min，70～50vol％b；27～27.1min，95～10vol％b；27.1～30min，10～95vol％b；流速：0.3～0.33ml/min；
15.质谱条件为：电喷雾离子源为正负离子模式；鞘气流速：40～45arb；辅助气流速：8～15arb；在正离子模式下的喷雾电压为3700～3800v，在负离子模式下的喷雾电压为3450～3500v；毛细管温度：310～320℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z：80～1200；一级质谱分辨率：68000～70000；二级质谱分辨率：17200～17500；归一化碰撞能量：15～45％；
16.(3)对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：c[5-35]，h[5-60]，o[1-20]，s[0-5]，环和不饱和键数[3-15]，质量精度误差在5ppm以内。
[0017]
根据本发明所述的检测方法，优选地，所述将生物样品进行处理，获得待测溶液的步骤包括：
[0018]
将固相萃取柱用甲醇进行活化，再用水进行平衡至除去甲醇，然后取生物样品加入所述固相萃取柱，依次以水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用甲醇溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。
[0019]
根据本发明所述的检测方法，优选地，所述将生物样品进行处理，获得待测溶液的具体步骤包括：将固相萃取柱用甲醇进行活化，再用去离子水进行平衡至除去甲醇，然后取0.2～0.5倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以0.6～1倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的甲醇复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。
[0020]
根据本发明所述的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述固相萃取柱为grace pure
tm
spe c18-low固相萃取柱；所述色谱柱为waters acquity beh c18色谱柱。
[0021]
根据本发明所述的检测方法，优选地，梯度洗脱程序为：0～5min，95vol％b；5～10min，95vol％～70vol％b；10～27min，70vol％～50vol％b；27～27.1min，95vol％～10vol％b；27.1min～30min，10vol％～95vol％b。
[0022]
根据本发明所述的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述柱温为30℃；所述流速为0.3ml/min；进样量为2～3μl。
[0023]
根据本发明所述的检测方法，优选地，所述含药血浆样品由包括以下的步骤制备而得：取血样置于肝素钠离心管中，离心，取上层血浆，得到含药血浆样品。
[0024]
根据本发明所述的检测方法，优选地，所述含药尿液样品由包括以下的步骤制备而得：取尿样离心，取上清，得到含药尿液样品。
[0025]
根据本发明所述的检测方法，优选地，所述含药粪便样品由包括以下的步骤制备
而得：将粪样晾干后碾碎，按照1g:4.5～5.5ml的重量体积比的比例加入水，超声处理，离心，取上清液，得到含药粪便样品。
[0026]
根据本发明所述的检测方法，优选地，所述含药肝脏样品由包括以下步骤制备而得：取肝脏组织，加入生理盐水研磨，离心，取上清，得到含药肝脏样品。
[0027]
本发明的检测方法能够对生物样品中的黄腐酚及其众多代谢产物进行有效检测。根据本发明优选的实施方式，能够从含药血浆样品、含药尿液样品、含药粪便样品、含药肝脏样品和含药肝微粒体样品中包括原型在内的53个黄腐酚代谢产物。本发明的检测方法为阐明黄腐酚的体内外代谢机制研究提供了有力支撑。
具体实施方式
[0028]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0029]
本发明提供一种生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)对生物样品的进一步处理步骤；(2)采用液相色谱和质谱进行检测的步骤，和(3)对质谱数据进行数据处理的步骤。任选地，还包括获得生物样品的步骤。
[0030]
＜获得生物样品＞
[0031]
本发明中，生物样品包括生物体吸收黄腐酚后的含有黄腐酚及其代谢产物的含药血浆样品、含药尿液样品、含药粪便样品、含药肝脏样品和/或含药肝微粒体样品。优选地，生物样品包括生物体吸收黄腐酚后的含有黄腐酚及其代谢产物的含药血浆样品、含药尿液样品、含药粪便样品、含药肝脏样品和含药肝微粒体样品。这样有利于更全面地表征黄腐酚的体内外代谢产物，提高检测的准确性。
[0032]
本发明中，生物样品还可以包括空白生物样品，空白生物样品是指生物体(例如人或动物)正常饮食下的空白血浆样品、空白尿液样品、空白粪便样品、空白肝脏样品、空白肝微粒体样品。
[0033]
本发明中，所述动物优选为哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猴等。
[0034]
本发明的含药血浆样品由包括以下的步骤制备而得：取血样置于肝素钠离心管中，离心，取上层血浆，得到含药血浆样品。其中，离心的转速可以为3000～4000r/min，优选为3200～3800r/min，更优选为3500～3700r/min。离心时间可以为5～15min，优选为8～12min，更优选为10～11min。
[0035]
本发明的含药尿液样品由包括以下的步骤制备而得：取尿样离心，取上清，得到含药尿液样品。其中，离心的转速可以为8000～15000r/min，优选为9000～14000r/min，更优选为11000～12000r/min，离心时间可以为10～20min，优选为12～18min，更优选为15～16min。
[0036]
本发明的含药粪便样品由包括以下的步骤制备而得：将粪样晾干后碾碎，按照1g:4.5～5.5ml的重量体积比的比例加入水，超声处理，离心，取上清液，得到含药粪便样品。其中，所用水为去离子水或蒸馏水。超声处理0.5～1h。离心的转速为9000～16000r/min，优选为10000～16000r/min，更优选为13000～14000r/min，离心时间为20～40min，优选为25～35min，更优选为30～35min。本发明的所述按照1g:4.5～5.5ml的重量体积比的比例指的是
1g的碾碎后的粪样加入4.5～5.5ml的水，优选为5～5.5ml的水。
[0037]
本发明的含药肝脏样品由包括以下步骤制备而得：取肝脏组织，加入生理盐水研磨，离心，取上清，得到含药肝脏样品。其中，离心的转速为2500～4500r/min，优选为3000～4000r/min，更优选为3500～3800r/min，离心时间为9～18min，优选为10～15min，更优选为10～12min。
[0038]
本发明的含药肝微粒体样品由包括以下步骤制备而得：将mgcl2和肝微粒体溶解于pbs(ph＝7.4)中，用该溶液溶解黄腐酚。设置给药组和空白组。向6孔板各孔分别加入上述混合液，空白组给予药物阴性溶液。加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)启动反应，继续孵育，分别在5，10，15，30，45，60，120，240min取上述系统溶液加入冷乙腈终止反应，离心，取上清液，即得含药肝微粒体样品。具体地，将mgcl2和肝微粒体溶解于pbs(ph＝7.4)中，最终mgcl2浓度为2.5～3mm，蛋白质量浓度为0.8～1mg/ml，用该溶液溶解黄腐酚，最终药物浓度为0.1mg/ml(可以先用甲醇配成高浓度母液再稀释，甲醇浓度＜1％)。设置给药组和空白组。向6孔板各孔分别加入900μl上述混合液，空白组给予药物阴性溶液。在37℃下预热5min后，加入100μl浓度为25mg/ml的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph，终浓度为25mg/ml)启动反应，继续在37℃孵育，分别在5，10，15，30，45，60，120，240min取100μl上述系统溶液加入200μl冷乙腈终止反应，离心，取上清液，得到含药肝微粒体样品。
[0039]
通过以上方法获得本发明所需的生物样品。
[0040]
＜生物样品的进一步处理步骤＞
[0041]
本发明中，所述生物样品的处理方法为：将固相萃取柱用甲醇进行活化，再用水进行平衡至除去甲醇，然后取生物样品加入所述固相萃取柱，依次以水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用甲醇溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。这样有利于提高检测的准确性。所用水优选为去离子水或蒸馏水。
[0042]
在本发明中，可以将固相萃取柱用1.4～2倍柱体积甲醇进行活化，优选用1.5～1.7倍柱体积甲醇进行活化。再用1.4～2倍柱体积的水进行平衡该固相萃取柱至完全除去甲醇，优选用1.5～1.7倍柱体积水进行平衡。
[0043]
在某些具体的实施方案中，将固相萃取柱用甲醇进行活化，再用去离子水进行平衡，然后取0.2～0.5倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以0.6～1倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的甲醇复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。
[0044]
其中，固相萃取柱为c18固相萃取柱，可以商购。优选采用grace pure
tm
spe c18-low固相萃取柱。
[0045]
本发明中，所述涡旋振荡时间可以为2～12min，优选为3～10min，再优选为3～5min。离心转速可以为10000～20000r/min，优选为12000～18000r/min，更优选为12000～15000r/min。离心时间可以为8～20min，优选为10～18min，更优选为12～15min。
[0046]
所述吹干的方式为常温下采用氮气或氩气吹干。
[0047]
采用本发明方法对生物样品进一步处理，可以得到适合采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测的待测溶液，提高检测的准确性。
[0048]
＜采用液相色谱和质谱进行检测的步骤＞
[0049]
本发明的检测方法采用液相色谱和质谱，优选采用液相色谱和质谱联用仪，更优
选采用超高效液相色谱-质谱联用仪(型号可以为uhplc-ltq-orbitrap)检测上述待测溶液。所述待测溶液为含药待测溶液或空白待测溶液。具体地，将含药待测溶液和空白待测溶液分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，分别得到相应的图谱，通过二者的对比，确定黄腐酚代谢产物的位置。这是本领域技术人员公知的，不再赘述。
[0050]
本发明中，色谱条件为：色谱柱：c
18
色谱柱；流动相：0.08～0.12vol％甲酸水溶液a与乙腈b；柱温：28～32℃；梯度洗脱程序：0～5min，90～95vol％b；5～10min，95～70vol％b；10～27min，70～50vol％b；27～27.1min，95～10vol％b；27.1～30min，10～95vol％b；流速：0.3～0.33ml/min。
[0051]
本发明中，所述色谱柱为waters acquity beh c
18
色谱柱。优选为acquity uplc beh c
18
色谱柱(2.1mm
×
100mm，1.7μm)。
[0052]
在某些具体的实施方案中，梯度洗脱程序为：0～5min，95vol％b；5～10min，95vol％～70vol％b；10～27min，70vol％～50vol％b；27～27.1min，95vol％～10vol％b；27.1min～30min，10vol％～95vol％b。
[0053]
在本发明中，柱温优选为30℃；流速优选为0.3ml/min；进样量可以为2～3μl，更优选为3μl。
[0054]
这样的色谱条件，有利于在短时间内实现黄腐酚及其众多代谢产物的有效分离，有利于进行质谱解析。
[0055]
本发明中，质谱条件为：电喷雾离子源为正负离子模式；鞘气流速：40～45arb；辅助气流速：8～15arb；毛细管温度：310～320℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 80～1200；一级质谱分辨率68000～70000；二级质谱分辨率17200～17500；归一化碰撞能量：15～45％。其中，喷雾电压的设置如下：在正离子模式下为3700～3800v，负离子模式下为3450～3500v。
[0056]
在本发明中，鞘气流速优选为42～45arb；辅助气流速优选为10～15arb；毛细管温度优选为315～320℃；一级质谱分辨率优选为69000～70000；二级质谱分辨率优选为17400～17500；归一化碰撞能量优选为15％，30％，45％。喷雾电压的设置如下：在正离子模式下优选为3750～3800v，在负离子模式下优选为3480～3500v。
[0057]
《对质谱数据进行数据处理》
[0058]
对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式通过thermo xcalibur 2.1工作站进行预测，相关参数设定如下：c[5-35]，h[5-60]，o[1-20]，s[0-5]，环和不饱和键数[3-15]，质量精度误差在5ppm以内。相关参数包括：所需计算化学式各原子个数、环和不饱和键的个数、分子(即各个代谢物)的质量精度误差。发明人发现，上述参数的设置至关重要，过高或过低均会影响数据处理的准确性。特别是对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测时的相关参数设定很关键，而这些参数的设置并不属于常规选择。
[0059]
对于黄腐酚及其代谢产物，在该条件下能够获得足够丰富的多级质谱碎片离子信息，同时还可保证碎片离子不会发生过度解离，提高检测分析的准确性。
[0060]
本领域技术人员知晓，黄腐酚为异戊二烯黄酮类化合物，有一个自由的羟基参与环化，因此能环化成黄烷酮，比如异黄腐酚。虽然黄腐酚是酒花中主要的含异戊二烯基类黄酮，但是由于其在啤酒酿造过程中查尔酮热异构化形成黄烷酮，所以他在啤酒中含量较少，不易检测。同时，黄腐酚含有多个羟基，高度亲脂并成酸性，在质谱中更容易发生去质子化，导致其本身及其代谢物在质谱检测过程中有所损失。而能量过小则导致碎片离子信息较少
而无法准确鉴定代谢物，因此现有的质谱分析方法采用的质谱条件不能得到足够丰富的信息碎片，因而只能得到少量代谢物信息，例如背景技术中的三篇文献仅分别得到7种、6种、19种代谢产物。
[0061]
而本发明经过大量研究和实验发现，本发明的处理方法，特别是上述相关参数的设定，能够在不遗漏重要的碎片离子信息的基础上，有效降低组分的化学结构解析难度。c作为有机化合物中至关重要的元素，其参数设定时需严谨，其参数过高或过低均会影响数据处理的准确性，且增加工作量浪费时间。若设置范围过小则可能导致一些重要的碎片离子被遗漏，影响最终结果的全面性。
[0062]
本发明中，所述质谱仪优选为高分辨质谱仪，例如美国thermo fisher公司的ltq-orbitrap xl质谱仪，其配有电喷雾离子源(esi)和xcalibur 2.1工作站。
[0063]
采用本发明的检测方法，能够从含药血浆样品、含药尿液样品、含药粪便样品、含药肝脏样品和/或含药肝微粒体样品中共检测到包括原型在内的53个代谢产物，从而为黄腐酚的药效物质基础和作用机制研究提供了有力支撑，并为进一步进行黄腐酚的体内外药代动力学评价、药学研究、质量标准、工业化生产质控指标的制定以及临床方案的制定提供依据。
[0064]
以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行示例性说明。
[0065]
实施例1
[0066]
1实验器材
[0067]
grace puretm spe c18-low固相萃取小柱(500mg/3ml)；
[0068]
xpe105dr型电子分析天平(梅特勒-托利多公司，瑞士)；
[0069]
sorvall st 8r型高速冷冻离心机(thermo fisher公司)；
[0070]
dionex ultimate 3000超高效液相色谱分析系统：美国thermo fisher公司；
[0071]
q-exactive orbitrap质谱仪：美国thermo fisher公司，配有电喷雾离子源(esi)和xcalibur 2.1工作站。
[0072]
黄腐酚对照品：成都曼思特生物科技有限公司产品(纯度大于98％)；
[0073]
甲酸(色谱纯)，甲醇(色谱纯)和乙腈(色谱纯)：美国thermo fisher公司。
[0074]
sprague dawley(sd)大鼠(雄性，体重200
±
10g)，购于济南朋悦实验动物技术有限公司，许可证号为scxk(鲁)20190003。
[0075]
2实验方法
[0076]
2.1生物样品的制备
[0077]
给药组以黄腐酚对照品进行灌胃，给药剂量为150mg/kg，连续给药三天。空白组给予同体积生理盐水。大鼠适应性喂养3天，自由饮食饮水，实验前12h，禁食不禁水，实验时灌胃给予相应溶液。
[0078]
各大鼠在最后一天灌胃给药后0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，6.0h分别眼眶静脉取血0.5ml。所采集的血样置于涂满肝素钠的离心管中，3500r/min离心10min，取上层血浆，于-80℃冰箱冻存。
[0079]
给药24h代谢后，解剖大鼠，取肝组织于液氮中淬灭，-80℃保存。取1g肝脏组织，加入10ml生理盐水研磨，3500rpm离心10min，取上清。
[0080]
大鼠最后一天灌胃给药后，将动物置于代谢笼中(禁食不禁水)，收集24h各组大鼠
的尿液和粪便。取尿样于12000r/min下离心15min，取上清，-80℃冰箱冻存。粪样置于通风厨中晾干后碾碎，取2g粪便粉末，加10ml纯水，超声处理0.5h，离心取上清液。
[0081]
将mgcl2和肝微粒体溶解于pbs(ph＝7.4)中，最终mgcl2浓度为3mm，蛋白质量浓度为1mg/ml，用该溶液溶解各对照品，最终药物浓度为0.1mg/ml(可以先用甲醇配成高浓度母液再稀释，甲醇浓度＜1％)。设置给药组和空白组。向6孔板各孔分别加入900μl上述混合液，空白组给予药物阴性溶液。在37℃下预热5min后，加入100μl浓度为25mg/ml的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph，终浓度为25mg/ml)启动反应，继续在37℃孵育，分别在5，10，15，30，45，60，120，240min取100μl上述系统溶液加入200μl冷乙腈终止反应，离心取上清液。
[0082]
2.2生物样品处理
[0083]
将grace pure
tm
spe c18-low固相萃取柱用5ml甲醇进行活化，再用5ml去离子水进行平衡至完全除去甲醇，然后分别取1ml上述的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以3ml去离子水和3ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用300μl甲醇溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液进行分析。
[0084]
3.液质分析条件
[0085]
液相色谱条件：色谱柱：waters acquity beh c18色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液a与乙腈b；柱温：30℃；梯度洗脱程序：0～5min，95vol％b；5～10min，95vol％～70vol％b；10～27min，70vol％～50vol％b；27～27.1min，95vol％～10vol％b；27.1min～30min，10vol％～95vol％b；流速：0.3ml/min；进样量：3μl；
[0086]
质谱条件：电喷雾离子源为正负离子模式；鞘气流速：45arb；辅助气流速：10arb；喷雾电压：3800/3500v(+/-)；毛细管温度：320℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 80～1200；一级质谱分辨率70000；二级质谱分辨率17500；归一化碰撞能量：15％，30％，45％。
[0087]
对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式通过thermo xcalibur 2.1工作站进行预测，相关参数设定为：c[5-35]，h[5-60]，o[1-20]，s[0-5]以及环和不饱和键数[3-15]，质量精度误差在5ppm以内。
[0088]
4.实验结果
[0089]
采用uhplc-q-exactive orbitrap ms/ms技术结合在sd大鼠血浆、尿液、粪便、肝组织和肝微粒体中检测53种黄腐酚代谢物。其中，在血浆、尿、粪、肝和肝微粒体中分别鉴定出27、16、21、1和8种代谢物(不同生物样品中会有相同的代谢物)。
[0090]
具体见表1和表2。
[0091]
在不使用本发明的检测方法的情况下，通过查阅文献得知黄腐酚体内代谢主要有黄腐酚异构化形成异黄腐酚，异黄腐酚再与葡萄糖醛酸，硫酸酯基结合等产物。本发明的检测方法实现了对黄腐酚代谢物的深入挖掘，其中包括一些ⅰ相或ⅱ相代谢产物的发现。
[0092]
表1
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注：表1中，p表示正离子模式；n表示负离子模式。
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表2
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注：表2中，√表示检测到；-表示未检测到。p表示“血”；f表示“粪”；u表示“尿”；l表示“肝”；lm表示“肝微粒体”，即分别代表检测的含药血浆样品、含药尿液样品、含药粪便样品、含药肝脏样品、含药肝微粒体样品。结构式中的glua表示葡萄糖醛酸基团。此表内涉及化合物部分因其为同分异构体，tr或其可检测位置(如：p、u、f、l、lm)不同，所以未对其进行合并。
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本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

技术特征：
1.一种生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将生物样品进行处理，获得待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收黄腐酚后的含有黄腐酚及其代谢产物的含药血浆样品、含药尿液样品、含药粪便样品、含药肝脏样品和/或含药肝微粒体样品；(2)将所述待测溶液采用液相色谱和质谱检测，其中：液相色谱条件为：色谱柱：c
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色谱柱；流动相：0.08～0.12vol％甲酸水溶液a与乙腈b；柱温：28～32℃；梯度洗脱程序：0～5min，90～95vol％b；5～10min，95～70vol％b；10～27min，70～50vol％b；27～27.1min，95～10vol％b；27.1～30min，10～95vol％b；流速：0.3～0.33ml/min；质谱条件为：电喷雾离子源为正负离子模式；鞘气流速：40～45arb；辅助气流速：8～15arb；在正离子模式下的喷雾电压为3700～3800v，在负离子模式下的喷雾电压为3450～3500v；毛细管温度：310～320℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z：80～1200；一级质谱分辨率：68000～70000；二级质谱分辨率：17200～17500；归一化碰撞能量：15～45％；(3)对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：c[5-35]，h[5-60]，o[1-20]，s[0-5]，环和不饱和键数[3-15]，质量精度误差在5ppm以内。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述将生物样品进行处理，获得待测溶液的步骤包括：将固相萃取柱用甲醇进行活化，再用水进行平衡至除去甲醇，然后取生物样品加入所述固相萃取柱，依次以水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用甲醇溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述将生物样品进行处理，获得待测溶液的具体步骤包括：将固相萃取柱用甲醇进行活化，再用去离子水进行平衡至除去甲醇，然后取0.2～0.5倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以0.6～1倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的甲醇复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固相萃取柱为grace pure
tm
spe c18-low固相萃取柱；所述色谱柱为waters acquity beh c18色谱柱。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，梯度洗脱程序为：0～5min，95vol％b；5～10min，95vol％～70vol％b；10～27min，70vol％～50vol％b；27～27.1min，95vol％～10vol％b；27.1min～30min，10vol％～95vol％b。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述柱温为30℃；所述流速为0.3ml/min；进样量为2～3μl。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含药血浆样品由包括以下的步骤制备而得：取血样置于肝素钠离心管中，离心，取上层血浆，得到含药血浆样品。8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含药尿液样品由包括以下的步骤制备而得：取尿样离心，取上清，得到含药尿液样品。9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含药粪便样品由包括以下的步骤制备而得：将粪样晾干后碾碎，按照1g:4.5～5.5ml的重量体积比的比例加入水，超声处理，
离心，取上清液，得到含药粪便样品。10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含药肝脏样品由包括以下步骤制备而得：取肝脏组织，加入生理盐水研磨，离心，取上清，得到含药肝脏样品。

技术总结
本发明公开了一种生物样品中黄腐酚及其体内外代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)将生物样品进行处理，获得待测溶液；(2)将所述待测溶液采用液相色谱和质谱检测，(3)对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[5-35]，H[5-60]，O[1-20]，S[0-5]，环和不饱和键数[3-15]，质量精度误差在5ppm以内。本发明的检测方法能够检测到生物样品中较多的黄腐酚体内外代谢产物。生物样品中较多的黄腐酚体内外代谢产物。


技术研发人员：张加余 王少平 袁晓庆 王红
受保护的技术使用者：滨州医学院
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/9/14