一种间苯三酚中芳香胺类遗传毒性杂质残留检测的方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，具体涉及间苯三酚中芳香胺类遗传毒性杂质残留检测的高效液相色谱分析方法。


背景技术：

2.间苯三酚（phloroglucinol）能直接作用于胃肠道和泌尿生殖道的平滑肌，是亲肌性、非阿托品、非罂粟碱类平滑肌解痉药。与其它平滑肌解痉药相比，其特点是不具有抗胆碱作用，在解除平滑肌痉挛的同时，不会产生一系列抗胆碱样副作用，不会引起低血压、心率加快、心律失常等症状，对心血管功能没有影响。
3.间苯三酚注射液于1993年12月1日在法国获批上市，商品名spasfon
®
，规格4ml：40mg，持证商teva sante公司，适应于对症治疗与胃肠道和胆道功能性疾病有关的急性疼痛、急性疼痛性痉挛事件和泌尿系统疾病（肾绞痛）、对症治疗妇科急性疼痛。其结构式如下所示：。
4.对原料药及制剂进行质量控制一直是药物研发中的重点和难点，而对杂质的研究又是质量控制中的重中之重。间苯三酚合成过程中的起始原料、中间体、副产物及降解产物等均可能成为残留在终产品中的杂质，进而影响产品质量。
5.药物中潜在遗传毒性杂质的过量残留可能会影响用药安全。2020年版《中华人民共和国药典》中新增了“遗传毒性杂质控制指导原则”，足见遗传毒性杂质研究在药物质量研究与控制中日益重要。为提供安全质量可控的间苯三酚注射液原料药，对间苯三酚原料药合成工艺进行调研，发现其合成过程可能存在的副产物5-（二甲氨基）-间苯二酚（简称杂质j）和2,6-二甲氨基-4-羟基苯胺（简称杂质p）为芳香胺类潜在遗传毒性杂质，具有遗传毒性警示结构，需对原料药中杂质j和杂质p的残留量进行检测和控制，杂质j和杂质p结构为：。
6.根据国际人用药品注册技术协调会（ich）指导原则，对于服药时间长达10年以上的药品，可接受的毒理学关注阈值为每人1.5，结合间苯三酚注射液用药说明书中的最大日剂量是0.2g，则杂质j和杂质p的可接受杂质限度为7.5ppm（1.5μg/0.2g），因而需要建立一种高灵敏度的分析方法用于间苯三酚原料药中芳香胺类遗传毒性杂质的痕量测定。目前对间苯三酚原料药中芳香胺类遗传毒性杂质的研究以及质控分析方法的研究鲜有文献报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的是解决现有技术中缺少间苯三酚芳香胺类遗传毒性杂质的研究以及质控分析方法，提供一种快速准确地检测间苯三酚中芳香胺类遗传毒性杂质残留的高效液相色谱分析方法。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：本技术发明人对间苯三酚合成过程中可能存在的杂质进行了深入分析，并结合欧洲药典ep10.0质量标准，共鉴定了间苯三酚杂质a~in1-g共计22种杂质，包括芳香胺类遗传毒性杂质j、杂质p，其结构如下所示：。
9.本发明所采用的高效液相色谱分析方法包括以下步骤：（1）色谱条件设置：采用反相c18柱，以磷酸氢二钾水溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，进行梯度洗脱；；（2）样品溶液配制：采用稀释剂溶解间苯三酚原料，配制成浓度为1～10mg/ml的溶液；（3）检测：取配制的间苯三酚溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
10.其中，步骤（1）中梯度洗脱优选采用以下方式：
11.步骤（3）中进样量选自10～100μl；根据本发明的实施方式，本发明公开的液相色谱法中反相c18柱优选：horizon aqua，规格为250
×
4.6mm，5μm。
12.根据本发明的实施方式，发明人研究发现，流动相a的ph会影响杂质j和p的出峰，发明人研究了不同流动相a的ph对供试品溶液中杂质j和杂质p的检出的影响：当流动相a的ph为3.5时，主峰与杂质p依次出峰，但杂质p与主峰基线不分离；当流动相a的ph约为4.5时，供试品溶液本身含有的未知小杂质与杂质j重合，流动相a的ph会影响杂质j和杂质p的出峰时间；当流动相ph为4.8时，杂质j和杂质p专属性良好，既不与上述22个特定杂质重合，也不与供试品中的未知杂质重合。综合考察本发明采用的高效液相色谱法中优选流动相a的ph为4.8。
13.根据本发明的实施方式，发明人研究了稀释剂对供试品溶液中杂质j和杂质p的检出的影响：当步骤（2）中稀释剂为0.1%vc的5%乙腈溶液时，杂质p峰型分裂，有溶剂效应；当稀释剂为加入适量的vc水溶液时，不仅杂质j和p峰型良好，且适量的vc能有效抑制杂质p和杂质j的降解，杂质p和杂质j的峰面积24h内基本一致，稀释剂优选0.05～0.5%（w/v）vc溶液，进一步地，稀释剂优选0.1%的vc水溶液。
14.根据本发明的实施方式，当步骤（1）中流动相a选自8～12mmol/l磷酸氢二钾水溶液，流动相a用磷酸调节ph至4.7~4.9，柱温选自25～35℃；检测波长选自210～240nm；流动相速度选自0.9～1.1ml/min时，杂质j和杂质p峰形良好，分离度高。进一步地，流动相a优选10mmol/l；流动相a用磷酸调节ph优选4.8；检测波长优选210nm，流动相速度优选1.0ml/min。
15.本发明的有益效果：（1）采用本发明的方法可有效保证遗传毒性杂质j和杂质p的峰型良好，具有良好的溶液稳定性；（2）本发明所公开的检测技术能实现间苯三酚中杂质j和杂质p与上述22个杂质、以及与原料药中其他未知杂质的分离测定；（3）利用本发明的方法可以快速准确地进行原料药间苯三酚中潜在遗传毒性杂质
j和杂质p的定性及定量分析，保证原料药间苯三酚的质量可控性。
附图说明
16.图1是实施例2中空白稀释剂的色谱图；图2是实施例2中系统适用性溶液的色谱图；图3是实施例2中杂质j和杂质p溶液的色谱图；图4是实施例2中原料药间苯三酚样品溶液与系统适用性溶液对比色谱图（从上到下依次为样品溶液、系统适用性溶液）；图5是实施例3中混合溶液的色谱图；图6实施例3中原料药间苯三酚批次1~3与混合溶液的叠图（从上到下依次为混合溶液、批次1样品溶液、批次2样品溶液、批次3样品溶液）；图7是实施例4中系统适用性溶液（溶剂为0.1%vc的5%乙腈溶液）的色谱图；图8是实施例4中系统适用性溶液（溶剂为0.1%vc的溶液）的色谱图；图9是实施例5中系统适用性溶液的色谱图；图10是实施例6中240nm波长下供试品溶液的色谱图；图11是实施例6中240nm波长下系统适用性溶液的色谱图；图12是实施例7中进样量10
µ
l样品溶液的色谱图；图13是实施例7中进样量10
µ
l系统适用性溶液的色谱图；图14是实施例8中流速1.1ml/min样品溶液的色谱图；图15是实施例8中流速1.1ml/min系统适用性溶液的色谱图；图16是实施例9中流速0.9ml/min样品溶液的色谱图；图17是实施例9中流速0.9ml/min系统适用性溶液的色谱图；图18是实施例10中稀释剂为0.05%vc样品溶液的色谱图；图19是实施例10中稀释剂为0.05%vc系统适用性溶液的色谱图；图20是实施例11中稀释剂为0.5%vc样品溶液的色谱图；图21是实施例11中稀释剂为0.5%vc系统适用性溶液的色谱图；图22是实施例12中柱温35℃样品溶液的色谱图；图23是实施例12中柱温35℃系统适用性溶液的色谱图；图24是实施例13中流动相a盐浓度12mmol/l样品溶液的色谱图；图25是实施例13中流动相a盐浓度12mmol/l系统适用性溶液的色谱图；图26是实施例14中流动相a盐浓度8mmol/l样品溶液的色谱图；图27是实施例14中流动相a盐浓度8mmol/l系统适用性溶液的色谱图；图28是实施例15中流动相a ph4.9样品溶液的色谱图；图29是实施例15中流动相a ph4.9系统适用性溶液的色谱图；图30是实施例16中流动相a ph4.7样品溶液的色谱图；图31是实施例16中流动相a ph4.7系统适用性溶液的色谱图。
具体实施方式
17.以下实施例仅对本发明内容作进一步说明，并不限定本发明。本发明的方法也并
不限于杂质j和p，任何采用本发明方法分离测定间苯三酚中芳香胺类遗传毒性杂质与选自上述杂质中的1～22个杂质的任意组合都落入本发明范围内，以及任何采用本发明方法分离测定间苯三酚中间苯三酚芳香胺类遗传毒性杂质与包含上述杂质中的1～22个杂质的任意组合都落入本发明范围内。
18.杂质j、杂质p的制备参照下述实施例1方法制备。
19.实施例1杂质对照品的制备杂质j的制备
20.称取2g反应物加入到反应瓶中，加入20ml二氯甲烷，降至0℃下，滴加2mol/l的三溴化硼二氯甲烷溶液（3eq），加毕，室温下反应，反应完全后，降至0℃下，缓慢滴加到降至0℃的甲醇的二氯甲烷溶液中，抽滤，滤饼少量水打浆，抽滤，得到1.2g固体，纯度98.7%。1h-nmr（dmso-d6）：δ8.80（2h，s），δ5.59（3h，s），δ2.77（6h，s）。
21.杂质p的制备
22.称取2g反应物加入到反应瓶中，加入20ml二氯甲烷，降至0℃下，滴加2mol/l的三溴化硼二氯甲烷溶液（2eq），加毕，室温下反应，反应完全后，降至0℃下，缓慢滴加到降至0℃的甲醇的二氯甲烷溶液中，抽滤，滤饼少量水打浆，抽滤，得到1.5g固体，纯度97.9%。1h-nmr（dmso-d6）：δ8.60（1h，s），δ6.03（2h，s），δ3.69（6h，s），δ3.54（2h，s）。
23.实施例2仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（磷酸调节ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
24.检测波长：210nm流速：1ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.075μg的溶液，作为系统适用性溶液（该溶液为供试品溶液和7.5ppm限度浓度杂质j和p的混合溶液）；供试品溶液：精密称取间苯三酚适量，置于量瓶中，用稀释剂溶解并稀释制成10mg/ml的溶液；测定：取稀释剂、系统适用性溶液、杂质j和杂质p贮备液、供试品溶液各100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
25.结果：空白稀释剂对测定无干扰；色谱图见图1，系统适用性溶液和杂质j和p贮备液图谱见图2~3，系统适用性溶液中api主峰（间苯三酚）、杂质p、杂质j依次出峰，保留时间分别为11.992min、23.093min、26.760min；供试品溶液和系统适用性溶液对比图谱见图4，由于系统适用性溶液为供试品溶液与杂质j/p加标7.5ppn限度浓度的混合溶液，对比发现间苯三酚中均未检出杂质j和杂质p，且供试品溶液中的其他未知杂质也均不干扰杂质j和杂质p的检测；。
26.实施例3仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（磷酸调节ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
27.检测波长：210nm流速：1ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc溶液特定杂质单体定位溶液：取上述22个杂质各适量，精密称定，分别加乙腈水混合溶液溶解并稀释制成每1ml约含5~15μg的溶液，作为各特定杂质单体定位溶液；混合溶液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含0.075μg的溶液（混合溶液中杂质j/p的浓度为限度浓度7.5ppm）；供试品溶液：精密称取间苯三酚适量（多批次），置于量瓶中，用稀释剂溶解并稀释制成10mg/ml的溶液；取各特定杂质单体定位溶液、混合溶液各100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
28.上述22个特定杂质和混合溶液的保留时间结果如下表所示，各特定杂质不干扰杂质j和p的检测，专属性良好；按外标法计算，对比混合溶液（杂质j和杂质p为7.5ppm限度浓度，见图5）和多批次供试品图谱（见图6）可知，多批次供试品溶液中均未检出杂质j和杂质p。
29.。
30.实施例4仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）
流动相：10mmol/l磷酸二氢钾缓冲液（磷酸调节ph值为3.5）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
31.检测波长：210nm流速：1ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc的5%乙腈溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
32.结果：当流动相a的ph为3.5、稀释剂为0.1%vc的5%乙腈溶液时，系统适用性溶液色谱图见图7，此时杂质p与主峰基线不分离且杂质p峰型分裂，认为稀释剂中有机相比例会影响杂质p峰型，有溶剂效应，而流动相a的ph值会影响杂质p与主峰的分离度当稀释剂不加入任何有机溶剂时，杂质p峰型良好；当稀释剂为纯水，且加入适量的vc时（图谱见图8），不仅杂质j和p峰型良好，且适量的vc能有效抑制杂质p和杂质j的降解，杂质p和杂质j的峰面积24h内基本一致，但此时由于流动相a的ph值为3.5，杂质p和主峰基线未分离。
33.实施例5仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸二氢钾缓冲液为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
34.检测波长：210nm
流速：1ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
35.结果：系统适用性溶液色谱图见图9，当流动相为10mmol/l磷酸二氢钾缓冲液时（ph值约为4.5），供试品中未知杂质与杂质j重合，干扰杂质j的检出，该色谱条件不可行。说明流动相a的ph都会影响杂质j和p的出峰。
36.实施例6仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
37.检测波长：240nm流速：1ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
38.结果：样品溶液色谱图见图10，系统适用性溶液色谱图见图11，当波长为240nm时供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。
39.实施例7仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
40.检测波长：210nm流速：1ml/min柱温：25℃进样量：10μl稀释剂：0.1%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液10μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
41.结果：样品溶液色谱图见图12，系统适用性溶液色谱图见图13，当进样量为10μl时，供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。
42.实施例8仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
43.检测波长：210nm
流速：1.1ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
44.结果：样品溶液色谱图见图14，系统适用性溶液色谱图见图15，当流速为1.1ml/min时，供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。
45.实施例9仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
46.检测波长：210nm流速：0.9ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
47.结果：样品溶液色谱图见图16，系统适用性溶液色谱图见图17，当流速为0.9ml/min时，供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。
48.实施例10仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
49.检测波长：210nm流速：1.0ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.05%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
50.结果：样品溶液色谱图见图18，系统适用性溶液色谱图见图19，当稀释剂为0.05%vc的水溶液时，供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。
51.实施例11仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
[0052][0053]
检测波长：210nm流速：1.0ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.5%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
[0054]
结果：样品溶液色谱图见图20，系统适用性溶液色谱图见图21，当稀释剂为0.5%vc的水溶液时，供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。
[0055]
实施例12仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
[0056]
检测波长：210nm流速：1.0ml/min柱温：35℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制
成每1ml约含7.5μg的溶液；对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
[0057]
结果：样品溶液色谱图见图22，系统适用性溶液色谱图见图23，当柱温为35℃时，供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。
[0058]
实施例13仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：12mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
[0059]
检测波长：210nm流速：1.0ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
[0060]
结果：样品溶液色谱图见图24，系统适用性溶液色谱图见图25，当流动相a盐浓度为12mmol/l时，供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。
[0061]
实施例14仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪
色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：8mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.8）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
[0062]
检测波长：210nm流速：1.0ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
[0063]
结果：样品溶液色谱图见图26，系统适用性溶液色谱图见图27，当流动相a盐浓度为8mmol/l时，供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。
[0064]
实施例15仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.9）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
[0065]
检测波长：210nm流速：1.0ml/min柱温：25℃
进样量：100μl稀释剂：0.1%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
[0066]
结果：样品溶液色谱图见图28，系统适用性溶液色谱图见图29，当流动相a ph为4.9时，供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。
[0067]
实施例16仪器：thermo scientific u3000高效液相色谱仪色谱柱：horizon aqua （250
×
4.6mm，5μm）流动相：10mmol/l磷酸氢二钾缓冲液（用磷酸调ph值为4.7）为流动相a；甲醇为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱：
[0068]
检测波长：210nm流速：1.0ml/min柱温：25℃进样量：100μl稀释剂：0.1%vc的水溶液杂质j和杂质p贮备液：取杂质j和杂质p各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含7.5μg的溶液；
[0069]
对照品溶液：精密量取杂质j和杂质p贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质j和杂质p各0.75μg的溶液，作为对照品溶液；
[0070]
样品溶液：称取间苯三酚适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液；
[0071]
系统适用性溶液：称取间苯三酚适量，加入杂质j和杂质p贮备液适量，制成每1ml中含间苯三酚约10mg，含杂质j和杂质p约0.75μg的溶液，作为混合溶液；
[0072]
测定：样品溶液、系统适用性溶液100μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
[0073]
结果：样品溶液色谱图见图30，系统适用性溶液色谱图见图31，当流动相a ph为4.7时，供试品中未知杂质不干扰杂质j、p的检出，系统适用性溶液中杂质p和j依次出峰，专
属性良好，供试品溶液中未检出杂质j、p。

技术特征：
1.一种间苯三酚中芳香胺类杂质j和杂质p残留检测的高效液相色谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）色谱条件设置：采用反相c18柱，以磷酸氢二钾水溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，设置柱温、检测波长、流动相速度，进行梯度洗脱；（2）样品溶液配制：采用稀释剂溶解间苯三酚原料，配制成浓度为1～10mg/ml的溶液；（3）检测：取配制的间苯三酚溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；其中，梯度洗脱采用以下方式：，所述的杂质j和杂质p的结构为：。2.根据权利要求1所述的一种间苯三酚中芳香胺类杂质j和杂质p残留检测的高效液相色谱分析方法，其特征在于，步骤（1）中所述的反相c18柱选自horizon aqua，规格为250
×
4.6mm，5μm。3.根据权利要求1所述的一种间苯三酚中芳香胺类杂质j和杂质p残留检测的高效液相色谱分析方法，其特征在于，步骤（1）中所述的流动相a为8～12mmol/l磷酸氢二钾水溶液，优选10mmol/l，用磷酸调节ph为4.7~4.9。4.根据权利要求1所述的一种间苯三酚中芳香胺类杂质j和杂质p残留检测的高效液相色谱分析方法，其特征在于，步骤（1）中所述的流动相a为10mmol/l磷酸氢二钾水溶液，优选10mmol/l，用磷酸调节ph为4.8。5.根据权利要求1所述的一种间苯三酚中芳香胺类杂质j和杂质p残留检测的高效液相色谱分析方法，其特征在于，步骤（1）中所述的柱温选自25～35℃。6.根据权利要求1所述的一种间苯三酚中芳香胺类杂质j和杂质p残留检测的高效液相色谱分析方法，其特征在于，步骤（1）中所述的检测波长选自210～240nm，优选210nm。7.根据权利要求1所述的一种间苯三酚中芳香胺类杂质j和杂质p残留检测的高效液相色谱分析方法，其特征在于，步骤（1）中所述的流动相速度选自0.9～1.1ml/min。8.根据权利要求1所述的一种间苯三酚中芳香胺类杂质j和杂质p残留检测的高效液相
色谱分析方法法，其特征在于，所述的流动相速度选自1.0ml/min。9.根据权利要求1所述的一种间苯三酚中芳香胺类杂质j和杂质p残留检测的高效液相色谱分析方法，其特征在于，步骤（2）中所述的稀释剂为0.05～0.5%（w/v）vc溶液，优选0.1%的vc水溶液。

技术总结
本发明公开了一种间苯三酚中芳香胺类遗传毒性杂质残留检测的高效液相色谱分析方法，该方法采用反相C18柱，以8～12mmol/L磷酸氢二钾水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；其中其中溶解间苯三酚稀释剂为0.05～0.5%（w/v）Vc溶液，流动相A用磷酸调节pH为4.7～4.9。本方法可对间苯三酚中芳香胺类遗传毒性杂质进行快速准确稳定的定性及定量分析。性杂质进行快速准确稳定的定性及定量分析。性杂质进行快速准确稳定的定性及定量分析。


技术研发人员：朱克玉 肖云华 万澄玉 孙井龙 梁溪
受保护的技术使用者：南京科默生物医药有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/9/14