一种选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒及其计数方法与流程

1.本发明涉及微生物选择性计数技术领域，尤其涉及一种选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒及其计数方法。


背景技术：

2.益生菌是在适当浓度下摄入时对机体有益的微生物。在食物中添加时，必须注意监测益生菌菌群数量。这些益生菌只有在发酵食品中以最低浓度存在时才能发挥最好的作用。益生菌建议的每日最低治疗剂量为106～107cfu/ml。研究表明，零售食品中的益生菌活性较低，需要进行适当的监测，以核实这些微生物的活性和浓度。到目前为止，只有分别针对双歧杆菌的iso 29981：2010和嗜酸乳杆菌的iso 20128：2006被认为发酵牛奶中益生菌计数的官方方案。但是目前还没有选择性强、计数结果准确的选择性计数干酪乳杆菌的培养基。因此根据干酪乳杆菌的特性优化选择性培养基，实现发酵乳中干酪乳杆菌的种水平活菌计数具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒及其计数方法。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒，包括petrifilm
tm
ac菌落总数计数片和菌种培养基；所述菌种培养基中添加万古霉素。
6.优选的，所述菌种培养基中万古霉素的浓度为8～12mg/l。
7.优选的，所述菌种培养基以mrs液体培养基为基础培养基。
8.优选的，所述菌种培养基中还包括2，3，5－三苯基氯化四氮唑。
9.优选的，2，3，5－三苯基氯化四氮唑的浓度为10～30mg/l。
10.本发明还提供了一种选择性计数发酵乳中干酪乳杆菌菌株的方法包括以下步骤：
11.(1)将发酵乳样品用所述的菌种培养基稀释8～12倍获得稀释液；
12.(2)取1ml步骤(1)获得的稀释液滴加在petrifilm
tm
ac菌落总数计数片上，在36～38℃厌氧培养46～50h后计数。
13.优选的，所述计数方法为目视、标准菌落计数器、照明放大镜计数中的一种，并结合参考判读卡计算菌落数。
14.本发明还提供了所述选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒在计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的应用。
15.优选的，所述发酵食品的发酵菌株包括干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、莱氏曼氏杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌和除yomix菌株外的嗜热链球菌中的一种或多种。
16.通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
17.在本发明的选择性计数培养基中，8～12mg/l的万古霉素对干酪乳杆菌有选择性的活性，并且低于30mg/l的2，3，5－三苯基氯化四氮唑不会抑制干酪乳杆菌生长。本发明的选择性计数培养基对发酵乳中的干酪乳杆菌菌株的计数有很好效果。
附图说明
18.图1为在添加不同浓度ttc的mrs琼脂上，微生物群的平均计数。经anova和tukey检验，微生物群的平均计数有统计学意义(p《0.05)，不同小写字母表示差异显著。
19.图2为干酪乳杆菌在嗜酸牛奶和酸奶中通过传统方法和替代的菌落总数测试片联合mrs,mrs-v和mrtlv的方法计数之间的关系。
20.图3为菌落总数测试片适宜计数范围内(25～250)的菌落数。
具体实施方式
21.本发明提供了一种选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒，包括petrifilm
tm
ac菌落总数计数片和菌种培养基；所述菌种培养基中添加万古霉素。
22.在本发明中，所述菌种培养基中万古霉素的浓度为8～12mg/l，优选为10mg/l；
23.在本发明中，所述菌种培养基以mrs液体培养基为基础培养基。
24.在本发明中，所述菌种培养基中还包括2，3，5－三苯基氯化四氮唑。
25.在本发明中，2，3，5－三苯基氯化四氮唑的浓度为10～30mg/l，优选为15～25mg/l，进一步优选为20mg/l。
26.本发明还提供了一种选择性计数发酵乳中干酪乳杆菌菌株的方法。
27.在本发明中，将发酵乳样品用所述的菌种培养基稀释8～12倍获得稀释液，优选的，稀释倍数为10倍。
28.在本发明中，还包括将稀释液滴加在petrifilm
tm
ac菌落总数计数片上的步骤，优选的，所述稀释液滴的添加量为1ml。
29.在本发明中，还包括将所述滴加稀释液的菌落总数计数片厌氧培养的步骤，培养温度为36～38℃，优选为37℃；培养时间为46～50h，优选为48h。
30.在本发明中，所述计数方法为目视、标准菌落计数器、照明放大镜计数中的一种，并结合参考判读卡计算菌落数。
31.本发明还提供了所述选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒在计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的应用。
32.在本发明中，所述发酵食品的发酵菌株包括干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、莱氏曼氏杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌和除yomix菌株外的嗜热链球菌中的一种或多种。
33.在本发明中，检测的菌株详见表1。所有菌株均在-20℃保存于20％甘油冻存液中。使用时在无菌条件下接种划线于mrs固体培养基，37℃，24h，后接种于mrs肉汤培养基中37℃，150rpm，24h培养。
34.利用麦士比浊管将培养的到菌液浓度调为3
×
108cfu/ml。然后用倍比稀释法将菌液在0.9％生理盐水中稀释成不同浓度，4℃保存备用。
35.表1.菌株汇总
36.37.[0038][0039]
在本发明中，涉及到三种培养基：mrs肉汤培养基、mrs-v培养基、mrtlv培养基。其中，mrs-v培养基为添加了万古霉素的培养基，mrtlv培养基为鼠李糖乳杆菌-2,3,5-三苯基氯化四氮唑-氯化物-万古霉素的复合肉汤培养基。
[0040]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0041]
实施例1
[0042]
在mrs培养基中添加8mg/l的万古霉素、20mg/l的2，3，5－三苯基氯化四氮唑，与petrifilm
tm
ac菌落总数计数片共同组成选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒。
[0043]
实施例2
[0044]
在mrs培养基中添加10mg/l的万古霉素、30mg/l的2，3，5－三苯基氯化四氮唑，与petrifilm
tm
ac菌落总数计数片共同组成选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒。
[0045]
实施例3
[0046]
在mrs培养基中添加12mg/l的万古霉素、10mg/l的2，3，5－三苯基氯化四氮唑，与petrifilm
tm
ac菌落总数计数片共同组成选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒。
[0047]
实施例4
[0048]
在mrs培养基中添加11mg/l的万古霉素、25mg/l的2，3，5－三苯基氯化四氮唑，与petrifilm
tm
ac菌落总数计数片共同组成选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒。
[0049]
实施例5
[0050]
鼠李糖乳杆菌-2，3，5-三苯基氯化四氮唑-氯化物-万古霉素的复合肉汤培养基与petrifilm
tm
ac菌落总数计数片共同组成选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒。
[0051]
实验例1试验菌株化学物质的选择
[0052]
将受试菌株(表1)稀释至大约102cfu/ml，取200μl菌液均匀涂布在mrs琼脂上，并加入表2中不同浓度的各种化学物质。表2为本实验例中使用的选择性药剂及其测试浓度。所有药剂均制备为水溶液，并用0.22μm滤膜过滤备用。对照组受试菌接种在不含任何化学物质的mrs琼脂上。在37℃培养48h，然后计数菌落，结果以cfu/ml表示。所有试验做3个平行。
[0053]
表2.选择性物质及其浓度
[0054][0055][0056]
结果表明，氯化锂和丙酸钠对区分干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌没有选择作用；胆汁、氯化锂和丙酸钠均不能抑制其他测试菌株的生长；
[0057]
使用含萘啶酸的mrs不能抑制乳酸菌生长。三株嗜热菌中只有两株被这种培养基部分抑制；嗜热链球菌th-4在最高浓度下被抑制(p1/4 0.033)，嗜热链球菌st066在最低浓度下被抑制(p1/4 0.045)。此外，萘啶酸抑制了四株干酪乳杆菌的生长，说明这种物质不能
被认为对干酪乳杆菌有选择性。
[0058]
甲硝唑和万古霉素对干酪乳杆菌、副干酪乳球菌和鼠李糖乳杆菌的计数没有选择性。
[0059]
只有副干酪乳杆菌atcc 335、嗜酸乳杆菌la-5、嗜酸奶杆菌74-2、嗜热链球菌th-4和嗜热链球菌st066被测试的1.5mg/l的万古霉素浓度适当抑制。
[0060]
将10mg/ml的万古霉素加入到mrs培养基中进行菌株生长抑制实验。结果表明，万古霉素(10mg/ml)对干酪、副干酪、鼠李糖和部分“其他组乳酸菌”组(发酵乳杆菌、植物乳杆菌)的生长无明显抑制作用(p》0.05)，但对嗜热链球菌的生长有抑制作用(p《0.05)。
[0061]
表3为在加入10mg/l万古霉素的mrs琼脂中，对嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌德氏亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、莱氏曼乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌的菌落计数平均值。
[0062]
表3菌落计数平均值
[0063][0064][0065]
ng：未增长；*不同大写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0066]
表3表明，除发酵乳杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌yomix外，其余菌株均被10mg/l万古霉素抑制。说明当发酵乳中的菌种不含有发酵乳杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌yomix时，在mrs培养基中添加10mg/l的万古霉素能够实现对干酪乳杆菌的选择计数。
[0067]
实验例2选定菌株生长的培养条件
[0068]
将表1中的干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌菌株分别滴加至单独的mrs肉汤、添加10mg/l万古霉素的mrs肉汤(mrs-v)、和鼠李糖乳杆菌-2,3,5-三苯基氯化四氮唑-氯化物-万古霉素的复合肉汤(mrtlv)中，并将其滴加在petrifilm
tm
ac菌落总数测试片上，每组2个重复。其中一个重复组在37℃有氧培养48h，另一组在37℃厌氧条件下培养48h。培养后进行菌落计数，计数结果以cfu/ml表示。并记录菌落的形态特征。表4为好氧和厌氧条件下在petrifilmtmac平板上添加至mrs、mrs-v和mrtlv培养液中获得的选定菌株的计数结果。
[0069]
表4实验例2中的选定菌株的计数
[0070][0071][0072]
实验例3益生菌发酵乳的生产及mrs-v、mrtlv发酵液和菌落总数测试片联合应用
于干酪乳杆菌计数的评价
[0073]
嗜酸乳杆菌la-5是生产嗜酸乳的原料，而来自yomix的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的培养物是酸奶的原料。将干酪乳杆菌(表1)接种到这两种产品中即可得到益生菌发酵乳。
[0074]
嗜酸牛奶的制备：用无菌水中制备6组10％的脱脂乳粉,每组1000ml，90℃加热5min，冷却至37℃。在mrs肉汤培养嗜酸乳杆菌la-5，在nacl0.85％(w/v)中稀释10倍，获得106cfu/ml的最终浓度；同时，每个批次接种不同的干酪乳杆菌菌株(表1)，使最终浓度为106cfu/ml。然后将接种的嗜酸乳在37℃下培养24小时，之后记录ph值和粘度，以验证生产是否完成(ph值为4.6和凝结)。将最终得到的发酵乳置于无菌容器，4℃保存。
[0075]
酸奶的制备：利用如上所述的方法制备6组1000ml的脱脂牛奶。按说明书添加保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，并在42℃下培养4.5小时，记录ph值和粘度，以验证生产是否完成(ph值为4.6和凝固)。然后，将发酵产物冷却至37℃，将干酪乳杆菌菌株的培养物分别接种在mrs肉汤的不同试管中，以获得最终浓度为106cfu/g。将最终得到的酸奶置于无菌容器，4℃保存。
[0076]
准备好的发酵乳的样品在0小时(刚制备完发酵乳)，15天和30天采样。每个样品分别用mrs-v和mrtlv肉汤稀释10倍。取1mlmrsv稀释发酵液分别滴加在菌落总数测试片和mrs-v琼脂板；相同的方式将mrtlv肉汤稀释发酵液液分别滴加到菌落总数测试片和mrtlv琼脂板。将菌落总数测试片在37℃厌氧培养，将mrs-v和mrtlv琼脂平板在37℃有氧条件下培养。48h后对菌落进行计数，结果以cfu/g表示。所有实验均进行三个独立重复。表5为嗜酸牛奶和酸奶利用传统方法和菌落总数测试片联合mrs-v和mrtlv培养液的方法获得的菌株计数均值。
[0077]
表5实验例3中菌株计数均值。
[0078][0079]
*不同大写字母后的值差异有统计学意义(p《0.05)。
[0080]
由表5可以看出，无论是传统平板还是与菌落总数测试片，mrs-v相比mrtlv上获得的计数更高。仅酸奶组差异显著(p《0.05)。结果表明，两种选择性培养基都可以与菌落总数测试片联合使用，以便对酸奶和发酵乳混合培养物中的干酪乳杆菌进行计数。
[0081]
在本实验例中，还通过线性回归对所测试的培养基和培养方案的效果进行了评价。图2显示了通过常规平板和菌落总数测试片获得的结果。所获得的数据(图2)表明所有相关指数均达到显著水平(p《0.01)。与mrtlv(图2b,d)相比，mrs-v与菌落总数测试片在常规平板获得的数据之间具有更好的相关性(图2a,c)。通过传统培养基和菌落总数测试片观
察到的mrtlv上的计数的差异(表5)证明传统培养基与菌落总数测试片的相关性较差。因此，干酪乳杆菌可以利用mrs-v培养基进行选择性计数。
[0082]
实验例4ttc对细菌的抑菌效果评价
[0083]
ttc为2，3，5－三苯基氯化四氮唑的简称。ttc是一种可以使菌落总数测试片中的菌落可视化的染料。在联合使用菌落总数测试片与选择性培养基来对菌株计数时，需要对ttc的敏感性进行评估。ttc不仅可以使菌落显红色，便于区分菌落和杂质，更利于计数；还可以有效的防止平板上的菌落蔓延，抑制某些特定菌株的生长。
[0084]
将表1中的菌株稀释至大约102cfu/ml，取200μl菌液均匀涂布在mrs琼脂上，分别添加三种不同浓度的ttc(15、30和45mg/ml)，对照组不添加ttc。37℃培养48h，进行菌落计数，结果以cfu/ml表示。所有试验做3个平行。并对各供试菌株的菌落形态特征进行了评价。图1为在本实验中添加了不同浓度的ttc的测试微生物群在mrs琼脂上的平均计数。
[0085]
结果表明，干酪乳杆菌在添加了45mg/l的ttc的mrs上被抑制，在含有30mg/l的ttc的培养基上干酪乳杆菌形成了小的、棕红色的菌落。测试浓度的ttc对副干乳杆菌和鼠李糖乳杆菌无抑制作用；然而，这些菌落的形态因菌株而异：副干酪乳杆菌atcc 335被完全抑制，但被归为“其他乳酸菌”(发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、莱氏曼乳杆菌、植物乳杆菌)的菌株不受ttc浓度的抑制。30和45mg/l的ttc对嗜热链球菌也有抑制作用(图1)。
[0086]
综上所述，采用ttc作为染料增强干酪乳杆菌的可视化是可行的。
[0087]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒，其特征在于，包括petrifilm
tm
ac菌落总数计数片和菌种培养基；所述菌种培养基中添加万古霉素。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述菌种培养基中万古霉素的浓度为8～12mg/l。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述菌种培养基以mrs液体培养基为基础培养基。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述菌种培养基中还包括2，3，5－三苯基氯化四氮唑。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，2，3，5－三苯基氯化四氮唑的浓度为10～30mg/l。6.一种选择性计数发酵乳中干酪乳杆菌菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将发酵乳样品用权利要求1所述的菌种培养基稀释8～12倍获得稀释液；(2)取1ml步骤(1)获得的稀释液滴加在petrifilm
tm
ac菌落总数计数片上，在36～38℃厌氧培养46～50h后计数。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述计数方法为目视、标准菌落计数器、照明放大镜计数中的一种，并结合参考判读卡计算菌落数。8.权利要求1～5任意一项所述选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒在计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的应用。9.根据权利要求8所述的应用，所述发酵食品的发酵菌株包括干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、莱氏曼氏杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌和除yomix菌株外的嗜热链球菌中的一种或多种。

技术总结
本发明提供了一种选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的试剂盒及其计数方法，属于微生物选择性计数领域。本发明通过在MRS培养基中添加8～12mg/L的万古霉素，对发酵食品中的大部分菌株有抑制效果，而不会抑制干酪乳杆菌的生长，从而达到对发酵食品中干酪乳杆菌计数的目的。在本发明中，添加10～30mg/L的2，3，5－三苯基氯化四氮唑可以使菌落总数测试片中的菌落可视化，还可以有效的防止平板上的菌落蔓延，抑制某些特定菌株的生长，但是不会抑制干酪乳杆菌的活性。本发明中的试剂盒可以达到选择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的目的。择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的目的。择性计数发酵食品中干酪乳杆菌菌株的目的。


技术研发人员：彭昊 李常挺 凌丹 黄丘明 黄超玄 廖玉英 李军 马春霞 白慧丽 彭红艳
受保护的技术使用者：南宁市武鸣区动物疫病预防控制中心 南宁市武鸣区水产畜牧兽医技术推广站
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/9/14