一种脲类化合物及其外泌体负载方法和应用

1.本发明属于药物递送材料的制备技术领域，具体涉及一种脲类化合物及其外泌体负载方法和应用。


背景技术：

2.脲是由碳、氮、氧、氢组成的有机物。18世纪，人类首次由尿液内析离脲。19世纪，科学家发现可以无机物氰酸铵为原料合成脲，颠覆了传统的“生命力”学说，开辟了有机化学新的篇章。脲结构片段是重要药物开发优势骨架，在医药领域被广泛应用。例如，人体中黑色素浓缩激素(mch)与许多生理功能有关，尤其是在摄取食物和能量平衡方面发挥重要作用，具有脲结构的化合物g可作为mch拮抗剂，能够起到降低体重的功效；kotakadi报道了含有脲结构的化合物h对金黄色葡萄球菌的增殖具有极好的抑制作用；khan等人发现化合物i可有效抑制胰腺癌细胞和喉鳞癌细胞；lipton实验室发现化合物j对hiv-1蛋白酶表现出中等程度的抑制作用。目前已上市的含有脲类结构的抗肿瘤药物，包括用于治疗肾癌或甲状腺癌的lenvatinib，它是一种酪氨酸激酶抑制剂药物，可以有效的减缓或阻止肿瘤细胞的生长；还有sorafenib，是一种新型多靶向性的治疗肿瘤的口服药物。用于治疗对标准疗法无响应或不能耐受之胃肠道基质肿瘤和转移性肾细胞，能选择性地靶向某些蛋白的受体，被认为在肿瘤生长过程中起着一种分子开关的作用。它的上述适应证已在美国获得了fda授予的“快通道”审批地位。
3.ido1被认为是一种免疫调节剂，它在致病性炎症过程中起作用并产生对肿瘤抗原的免疫耐受，主要通过促进色氨酸消耗并产生一系列有毒的犬尿氨酸代谢物，进而激活gcn2通路、抑制mtor通路、犬尿氨酸的毒性作用以及促进调节性t细胞(treg)分化来达到免疫耐受。目前已经发现多种肿瘤组织中过表达ido1，ido1成为研究肿瘤免疫抑制的潜在靶点，已有多种ido1抑制剂类药物进行临床试验，例如epacadostat,indoximod,navoximod,eos-200271和bms-986205。为寻找更加新型高效的ido1抑制剂药物，我们通过点击反应把带有不同取代基的二苯基脲类化合物与带有不同取代基的三氮唑类化合物通过甲基结构或异丙基结构链接起来，得到5个结构新颖的二苯基脲链接三氮唑类衍生物，希望新的化合物能够结合二者的生物活性，在抗ido1活性方面有一定作用，并同时研究能够通过外泌体负载该类化合物的方式，使其能够有效的进入细胞。


技术实现要素：

4.本发明所述的一种脲类化合物及其外泌体负载方法和应用，其特征在于该脲类化
合物分子结构为：其中r1为甲氧基或溴，r2为氢原子或卤素或甲氧基；r3为氢原子或卤素或甲氧基。
5.本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种脲类化合物及其外泌体负载方法，其特征在于具体步骤为：
6.(1)：在带有搅拌的反应瓶中，在0℃条件下，把溶有一定量异氰酸苯酯类化合物的二氯甲烷溶液，缓慢滴加入溶有3-胺基-3-甲基-1丁炔和三乙胺的二氯甲烷中，保持0℃搅拌反应一段时间加入叔丁醇和水，升至室温，然后加入一定量的苄基叠氮类化合物和碘化亚铜，在室温条件下，继续反应一段时间把反应体系中加入水，搅拌后过滤，分出有机相，然后水相用二氯甲烷萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁干燥后浓缩，最后经过硅胶柱层析分离得到产物；所述的异氰酸苯酯类化合物与3-胺基-3-甲基-1丁炔与三乙胺的投料量摩尔比为1：1～1.1：1～1.1；所述的异氰酸苯酯类化合物与苄基叠氮类化合物投料量摩尔比为1：1～1.1；所述的苄基叠氮类化合物与碘化亚铜的投料量质量比为10：1；所述的异氰酸苯酯类化合物为4-甲氧基异氰酸苯酯或4-溴异氰酸苯酯；所述的苄基叠氮类化合物为3-溴苄基叠氮或3-溴苄基叠氮或3-甲氧基苄基叠氮。
7.(2)：使用碳化硅微通道反应器，配制溶有一定量3-胺基-3-甲基-1丁炔的二氯甲烷溶液标记为a，配制溶有一定量苄基叠氮类化合物和碘化亚铜的叔丁醇，二氯甲烷和水的混合溶液标记为b，把a溶液和b溶液分别接入反应器的两个进料泵中，同时以一定速度进入反应器，反应器温度设置为40℃，两个反应溶液在反应器中混合发生反应然后通过出料口流入溶有异氰酸苯酯类化合物和三乙胺的二氯甲烷中，一边加入一边搅拌，当微通道反应器中溶液流出完全，继续搅拌一段时间过滤反应液，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁干燥后浓缩，最后经过烘干后得到产物；所述的3-胺基-3-甲基-1丁炔与苄基叠氮类化合物投料量摩尔比为1：1；所述的苄基叠氮类化合物与碘化亚铜的投料量质量比为10：0.4～0.5；所述的3-胺基-3-甲基-1丁炔与异氰酸苯酯类化合物的投料量摩尔比为1：1；所述的苄基叠氮类化合物为3-溴苄基叠氮或2-溴苄基叠氮或3-甲氧基苄基叠氮。
8.(3)：收集实验室培养的盐藻细胞上清液，通过超高速离心机进行超速离心，并用磷酸盐缓冲液重悬外泌体沉淀，将所得到外泌体与所得到的化合物超声共孵育，具体条件为：1000μg纯化外泌体分别与浓度为30μm，60μm，90μm，120μm的化合物1ml轻轻混匀，在恒温摇床上37
°
轻轻摇动孵育1h之后，将超声探头没入混合液内，超声分10个周期，(500v，2khz，4s pulse/2s pause)，整个过程在冰浴上进行，超声结束后，混合液用高速离心机离心(10000xg，10min)，初步去除未包被进外泌体的药物，最后将上述混合液加入外泌体纯化柱，低速离心(750xg，10min)，彻底去除多余的化合物得到负载后的外泌体。
9.(4)：收集实验室培养的盐藻细胞上清液，通过超高速离心机进行超速离心，并用磷酸盐缓冲液重悬外泌体沉淀，将所得到外泌体与所得到的化合物超临界二氧化碳孵育，
具体条件为：2000μg纯化外泌体分别与浓度为90μm和120μm的化合物2ml加入到容器为20ml的二氧化碳超临界反应容器中，开启二氧化碳钢瓶，打开进气阀门，开启二氧化碳泵，通入二氧化碳，观察反应釜压力达到7.2mpa时，此时反应容器内部呈现液体，维持该压力条件，在反应过程中注意观察反应釜内温度和压力的变化，缓慢搅拌0.5h后，缓慢释放反应釜中二氧化碳，压力释放完全后，打开反应器，混合液用高速离心机离心(10000xg，10min)，初步去除未包被进外泌体的药物，最后将上述混合液加入外泌体纯化柱，低速离心(750xg，10min)，彻底去除多余的化合物得到负载后的外泌体。
10.技术优势：本发明设计并得到了一类结构新颖的脲类链接三氮唑结构的化合物分子，该分子具有一定的刚性结构，能够抑制ido1的活性，可提高机体免疫力；并且通过微通道反应器发现了一种高效的脲类链接三氮唑结构的制备方法；发现了一种脲类链接三氮唑结构化合物与外泌体负载的方式，该方法不但高效，而且制备过程简单、清洁。
附图说明
11.图1是实施例1制备得到的产物的核磁图。
12.图2是实施例2制备得到的产物的核磁图。
13.图3是实施例4制备得到的产物的核磁图。
14.图4是实施例5制备得到的产物的核磁图。
15.图5是实施例7制备得到的产物的核磁图。
具体实施方式
16.以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
17.实施例1
[0018][0019]
在带有搅拌的反应瓶中，在0℃条件下，把溶有4-甲氧基异氰酸苯酯15g的二氯甲烷溶液200ml，缓慢滴加入溶有3-胺基-3-甲基-1丁炔8.4g和三乙胺10g的二氯甲烷200ml中，保持0℃搅拌反应1h，加入叔丁醇100ml和水100ml，升至室温，然后加入2-溴苄基叠氮21g和碘化亚铜2g，在室温条件下，继续反应2h，把反应体系中加入水300ml，搅拌后过滤，分出有机相，然后水相用二氯甲烷100ml萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁50g干燥后浓缩，最后经过硅胶柱层析分离得到产物29.01g；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.23(s,1h),7.99(s,1h),7.68(d,j＝12.0hz,1h),7.38(t,j1＝12.0hz,j2＝12.0hz,1h),7.30(t,j1＝12.0hz,j2＝12.0hz,1h),7.23-7.20(m,2h),7.06(d,j＝6.0hz,1h),6.78(d,j＝12.0hz,2h),6.40(s,1h),5.65(s,2h),3.68(s,3h),1.64(s,6h)。
[0020]
实施例2
[0021][0022]
在带有搅拌的反应瓶中，在0℃条件下，把溶有4-甲氧基异氰酸苯酯15g的二氯甲烷溶液200ml，缓慢滴加入溶有3-胺基-3-甲基-1丁炔8.4g和三乙胺10g的二氯甲烷200ml中，保持0℃搅拌反应1h，加入叔丁醇100ml和水100ml，升至室温，然后加入3-溴苄基叠氮21g和碘化亚铜2g，在室温条件下，继续反应2h，把反应体系中加入水300ml，搅拌后过滤，分出有机相，然后水相用二氯甲烷100ml萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁50g干燥后浓缩，最后经过硅胶柱层析分离得到产物24.57g；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.22(s,1h),8.05(s,1h),7.53(s,2h),7.36-7.29(m,2h),7.23-7.20(m,2h),6.78(d,j＝18.0hz,2h),6.39(s,1h),5.57(s,2h),3.67(s,3h),1.62(s,6h)。
[0023]
实施例3
[0024][0025]
使用德国chemttrix的碳化硅微通道反应器，配制溶有3-胺基-3-甲基-1丁炔0.85g的二氯甲烷溶液10ml标记为a，配制溶有3-溴苄基叠氮2.1g和碘化亚铜0.1g的叔丁醇4ml，二氯甲烷3ml和水3ml的混合溶液标记为b，把a溶液和b溶液分别接入反应器的两个进料泵中，同时以1ml/min的速度进入反应器，反应器温度设置为40℃，两个反应溶液在反应器中混合发生反应然后通过出料口流入溶有4-甲氧基异氰酸苯酯1.5g和三乙胺1g的二氯甲烷12ml中，一边加入一边搅拌，当微通道反应器中溶液流出完全，继续搅拌10min，过滤反应液，分出有机相，水相用二氯甲烷5ml萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁3g干燥后浓缩，最后经过烘干后得到产物4.16g；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.22(s,1h),8.05(s,1h),7.53(s,2h),7.36-7.29(m,2h),7.23-7.20(m,2h),6.78(d,j＝18.0hz,2h),6.39(s,1h),5.57(s,2h),3.67(s,3h),1.62(s,6h)。
[0026]
实施例4
[0027][0028]
在带有搅拌的反应瓶中，在0℃条件下，把溶有4-甲氧基异氰酸苯酯15g的二氯甲烷溶液200ml，缓慢滴加入溶有3-胺基-3-甲基-1丁炔8.4g和三乙胺10g加入到二氯甲烷200ml中，保持0℃搅拌反应1h，加入叔丁醇100ml和水100ml，升至室温，然后加入3-甲氧基苄基叠氮17g和碘化亚铜2g，在室温条件下，继续反应2h，把反应体系中加入水300ml，搅拌后过滤，分出有机相，然后水相用二氯甲烷100ml萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁50g
干燥后浓缩，最后经过硅胶柱层析分离得到产物31.82g；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.23(s,1h),8.01(s,1h),7.29-7.20(m,3h),6.89-6.77(m,5h),6.39(s,1h),5.52(s,2h),3.72(s,3h),3.68(s,3h),1.63(s,6h)。
[0029]
实施例5
[0030][0031]
在带有搅拌的反应瓶中，在0℃条件下，把溶有4-溴异氰酸苯酯20g的二氯甲烷溶液200ml，缓慢滴加入溶有3-胺基-3-甲基-1丁炔8.4g和三乙胺10g加入到二氯甲烷200ml中，保持0℃搅拌反应1h，加入叔丁醇100ml和水100ml，升至室温，然后加入2-溴苄基叠氮21g和碘化亚铜2g，在室温条件下，继续反应2h，把反应体系中加入水300ml，搅拌后过滤，分出有机相，然后水相用二氯甲烷100ml萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁50g干燥后浓缩，最后经过硅胶柱层析分离得到产物27.74g；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.58(s,1h),8.01(s,1h),7.68(d,j＝12.0hz,1h),7.40-7.28(m,6h),7.05(d,j＝12.0hz,1h),6.57(s,1h),5.65(s,2h),1.64(s,6h)。
[0032]
实施例6
[0033][0034]
使用德国chemttrix的碳化硅微通道反应器，配制溶有3-胺基-3-甲基-1丁炔0.85g的二氯甲烷溶液10ml标记为a，配制溶有2-溴苄基叠氮2.1g和碘化亚铜0.1g的叔丁醇4ml，二氯甲烷3ml和水3ml的混合溶液标记为b，把a溶液和b溶液分别接入反应器的两个进料泵中，同时以1ml/min的速度进入反应器，反应器温度设置为40℃，两个反应溶液在反应器中混合发生反应，然后通过出料口流入溶有4-溴异氰酸苯酯2g和三乙胺1g的二氯甲烷20ml中，一边加入一边搅拌，当微通道反应器中溶液流出完全，继续搅拌30min，过滤反应液，分出有机相，水相用二氯甲烷5ml萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁3g干燥后浓缩，最后经过烘干后得到产物4.59g；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.58(s,1h),8.01(s,1h),7.68(d,j＝12.0hz,1h),7.40-7.28(m,6h),7.05(d,j＝12.0hz,1h),6.57(s,1h),5.65(s,2h),1.64(s,6h)。
[0035]
实施例7
[0036][0037]
在带有搅拌的反应瓶中，在0℃条件下，把溶有4-溴异氰酸苯酯20g的二氯甲烷溶液200ml，缓慢滴加入溶有3-胺基-3-甲基-1丁炔8.4g和三乙胺10g加入到二氯甲烷200ml中，保持0℃搅拌反应1h，加入叔丁醇100ml和水100ml，升至室温，然后加入3-溴苄基叠氮21g和碘化亚铜2g，在室温条件下，继续反应2h，把反应体系中加入水300ml，搅拌后过滤，分出有机相，然后水相用二氯甲烷100ml萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁50g干燥后浓缩，最后经过硅胶柱层析分离得到产物26.94g；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.58(s,1h),8.07(s,1h),7.54-7.52(m,2h),7.46-7.43(m,2h),7.36-7.34(m,2h),7.31-7.28(m,2h),6.57(s,1h),5.58(s,2h),1.63(s,6h)。
[0038]
实施例8
[0039][0040]
使用德国chemttrix的碳化硅微通道反应器，配制溶有3-胺基-3-甲基-1丁炔0.85g的二氯甲烷溶液10ml标记为a，配制溶有3-溴苄基叠氮2.1g和碘化亚铜0.1g的叔丁醇4ml，二氯甲烷3ml和水3ml的混合溶液标记为b，把a溶液和b溶液分别接入反应器的两个进料泵中，同时以1ml/min的速度进入反应器，反应器温度设置为40℃，两个反应溶液在反应器中混合发生反应然后通过出料口流入溶有4-溴异氰酸苯酯2g和三乙胺1g的二氯甲烷20ml中，一边加入一边搅拌，当微通道反应器中溶液流出完全，继续搅拌15min，过滤反应液，分出有机相，水相用二氯甲烷5ml萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁3g干燥后浓缩，最后经过烘干后得到产物4.68g；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.58(s,1h),8.07(s,1h),7.54-7.52(m,2h),7.46-7.43(m,2h),7.36-7.34(m,2h),7.31-7.28(m,2h),6.57(s,1h),5.58(s,2h),1.63(s,6h)。
[0041]
实施例9
[0042]
从co2培养箱中取出具有活力的人宫颈癌hela细胞培养皿，分别进行如下操作：在酒精灯旁进行无菌操作，打开皿盖，吸出培养液于废液缸中，用2ml的pbs洗培养瓶中的培养液两次，用0.25％的胰蛋白酶进行消化，待观察发现出现细胞间隙增大、细胞变成小圆圈形状时终止消化，使用移液枪吹打培养瓶底部使细胞脱落，将所得的细胞悬浮液转移至无菌离心管中，设置离心机为1000r/min，3min，进行离心，然后缓慢倾倒离心管中的上清液，加入2～5ml的培养液，于倒置显微镜下进行细胞计数。根据计数结果，将处于对数期生长的具有活力的人宫颈癌hela细胞以每孔50000个细胞的数目铺于96孔细胞培养板中，用含10％胎牛血清的rpmi1640培养5～6小时，加入100μl用培养基稀释好的待测化合物(浓度分别为
0.1μm，1.0μm，10.0μm，0.3μm，3.0μm，30.0μm)和重组人源干扰素γ(终浓度为100ng/mg)激活hela细胞中的ido1表达。操作完后将96孔细胞培养板放入富含5％二氧化碳的37℃细胞培养箱中培养18小时后，用一定量的6.1n的三氯乙酸终止反应，然后置于50℃孵育30分钟。细胞培养液经沉淀后，取上清液用对-二甲基氨基苯甲醛显色后经多功能酶标仪检测480nm处的吸光度。将不含药物只有ifnγ培养基处理的组作为100％(at)，只含0.1％dmso培养基处理的组作为空白对照0％(ab)；根据下面的公式计算不同条件处理时的吸光度：吸光度％＝(a-ab)/(at-ab)，a：药物处理+100ng/ml ifnγ，ab：空白对照，at：没有药物只含有100ng/ml ifnγ；根据使用graph pad prism 8.0软件生成具有ic
50
值的抑制曲线。通过进行ido1抑制初步实验发现，部分化合物对ido1具有一定的抑制效果，后续可进行深入研究。
[0043]
药物信息ido1(ic
50
,μm)实施例1得到的化合物》10实施例2得到的化合物1.73
±
0.97实施例4得到的化合物5.82
±
2.65实施例5得到的化合物》10实施例7得到的化合物》10
[0044]
实施例10
[0045]
为了更好的使化合物能够进入到细胞内部，我们尝试使用外泌体进行负载，外泌体是细胞分泌出来的一种囊状小泡，可以很便捷的透过细胞膜进入细胞内部，是优良的药物载体；收集实验室培养的盐藻细胞上清液，通过超高速离心机进行超速离心，并用磷酸盐缓冲液重悬外泌体沉淀，将所得到外泌体与实施例2得到的化合物超声共孵育，具体条件为：1000μg纯化外泌体分别与浓度为30μm，60μm，90μm，120μm的化合物1ml轻轻混匀，在恒温摇床上37
°
轻轻摇动孵育1h之后，将超声探头没入混合液内，超声分10个周期，(500v，2khz，4s pulse/2s pause)，整个过程在冰浴上进行，超声结束后，混合液用高速离心机离心(10000
×
g，10min)，初步去除未包被进外泌体的药物，最后将上述混合液加入外泌体纯化柱，低速离心(750
×
g，10min)，彻底去除多余的化合物，将外泌体加入1mlpbs中，搅拌均匀，吸取100μl后，利用酶标仪在300nm处测定吸光度。
[0046] 1μg/μl0.5μg/μl0.25μg/μl0.125μg/μl0.0625μg/μl复孔10.5990.50.4160.3930.354复孔20.5180.4810.4250.3150.366
[0047]
将实施例2得到的化合物与外泌体进行负载后可见吸光度比负载前有所提高，到达90μm的时候达到最高，继续增大化合物浓度，负载量不明显，说明使用该方法，在该条件下的最大的负载量浓度为90μm。
[0048][0049][0050]
实施例11
[0051]
收集实验室培养的盐藻细胞上清液，通过超高速离心机进行超速离心，并用磷酸盐缓冲液重悬外泌体沉淀，将所得到外泌体与实施例2得到的化合物超临界二氧化碳孵育，具体条件为：2000μg纯化外泌体分别与浓度为90μm和120μm的化合物2ml加入到容器为20ml的二氧化碳超临界反应容器中，开启二氧化碳钢瓶，打开进气阀门，开启二氧化碳泵，通入二氧化碳，观察反应釜压力达到7.2mpa时，此时反应容器内部呈现液体，维持该压力条件，在反应过程中注意观察反应釜内温度和压力的变化，缓慢搅拌0.5h后，缓慢释放反应釜中二氧化碳，压力释放完全后，打开反应器，混合液用高速离心机离心(10000
×
g，10min)，初步去除未包被进外泌体的药物，最后将上述混合液加入外泌体纯化柱，低速离心(750
×
g，10min)，彻底去除多余的化合物，将外泌体加入pbs1ml中，搅拌均匀，吸取100μl后，利用酶标仪在300nm处测定吸光度，90μm浓度的复孔吸光度分别为1.242和1.164，120μm浓度的复孔吸光度分别为1.317和1.378。
[0052]
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

技术特征：
1.一种脲类化合物及其外泌体负载方法和应用，其特征在于该脲类化合物分子结构为：其中r1为甲氧基或溴，r2为氢原子或卤素或甲氧基；r3为氢原子或卤素或甲氧基。2.根据权利要求1所述的一种脲类化合物及其外泌体负载方法，其特征在于该化合物制备的具体过程为：(1)、异氰酸苯酯类化合物与3-胺基-3-甲基-1丁炔缩合后与苄基叠氮类化合物反应得到目标化合物；(2)、3-胺基-3-甲基-1丁炔与苄基叠氮类化合物反应后再与异氰酸苯酯类化合物反应得到目标化合物；(3)、脲类化合物经超声与外泌体进行负载；(4)、脲类化合物经二氧化碳超临界方式与外泌体进行负载。3.根据权利要求2所述的一种脲类化合物及其外泌体负载方法，其特征在于步骤(1)的具体过程为：在带有搅拌的反应瓶中，在0℃条件下，把溶有一定量异氰酸苯酯类化合物的二氯甲烷溶液，缓慢滴加入溶有3-胺基-3-甲基-1丁炔和三乙胺的二氯甲烷中，保持0℃搅拌反应一段时间加入叔丁醇和水，升至室温，然后加入一定量的苄基叠氮类化合物和碘化亚铜，在室温条件下，继续反应一段时间把反应体系中加入水，搅拌后过滤，分出有机相，然后水相用二氯甲烷萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁干燥后浓缩，最后经过硅胶柱层析分离得到产物；所述的异氰酸苯酯类化合物与3-胺基-3-甲基-1丁炔与三乙胺的投料量摩尔比为1：1～1.1：1～1.1；所述的异氰酸苯酯类化合物与苄基叠氮类化合物投料量摩尔比为1：1～1.1；所述的苄基叠氮类化合物与碘化亚铜的投料量质量比为10：1；所述的异氰酸苯酯类化合物为4-甲氧基异氰酸苯酯或4-溴异氰酸苯酯；所述的苄基叠氮类化合物为3-溴苄基叠氮或3-溴苄基叠氮或3-甲氧基苄基叠氮。4.根据权利要求2所述的一种脲类化合物及其外泌体负载方法，其特征在于步骤(2)的具体过程为：使用碳化硅微通道反应器，配制溶有一定量3-胺基-3-甲基-1丁炔的二氯甲烷溶液标记为a，配制溶有一定量苄基叠氮类化合物和碘化亚铜的叔丁醇，二氯甲烷和水的混合溶液标记为b，把a溶液和b溶液分别接入反应器的两个进料泵中，同时以一定速度进入反应器，反应器温度设置为40℃，两个反应溶液在反应器中混合发生反应然后通过出料口流入溶有异氰酸苯酯类化合物和三乙胺的二氯甲烷中，一边加入一边搅拌，当微通道反应器中溶液流出完全，继续搅拌一段时间过滤反应液，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取多次，合并有机相后用无水硫酸镁干燥后浓缩，最后经过烘干后得到产物；所述的3-胺基-3-甲基-1丁炔与苄基叠氮类化合物投料量摩尔比为1：1；所述的苄基叠氮类化合物与碘化亚铜的投料量质量比为10：0.4～0.5；所述的3-胺基-3-甲基-1丁炔与异氰酸苯酯类化合物的投料量摩尔比为1：1；所述的苄基叠氮类化合物为3-溴苄基叠氮或2-溴苄基叠氮或3-甲氧基苄基叠氮。
5.如权利要求1所述的脲类化合物在抑制ido1酶活的应用。6.根据权利要求2所述的一种脲类化合物及其外泌体负载方法，其特征在于步骤(3)的具体过程为：收集实验室培养的盐藻细胞上清液，通过超高速离心机进行超速离心，并用磷酸盐缓冲液重悬外泌体沉淀，将所得到外泌体与所得到的化合物超声共孵育，具体条件为：将一定量纯化外泌体分别与一定体积的化合物溶液轻轻混匀，在恒温摇床上37
°
轻轻摇动孵育1h之后，将超声探头没入混合液内，超声分10个周期，(500v，2khz，4s pulse/2spause)，整个过程在冰浴上进行，超声结束后，混合液用高速离心机离心(10000xg，10min)，初步去除未包被进外泌体的药物，最后将上述混合液加入外泌体纯化柱，低速离心(750xg，10min)，彻底去除多余的化合物得到负载后的外泌体。7.根据权利要求2所述的一种脲类化合物及其外泌体负载方法，其特征在于步骤(4)的具体过程为：收集实验室培养的盐藻细胞上清液，通过超高速离心机进行超速离心，并用磷酸盐缓冲液重悬外泌体沉淀，将所得到外泌体与所得到的化合物超临界二氧化碳孵育，具体条件为：将一定量纯化外泌体分别与一定体积的化合物溶液加入到二氧化碳超临界反应容器中，开启二氧化碳钢瓶，打开进气阀门，开启二氧化碳泵，通入二氧化碳，观察反应釜压力达到7.2mpa时，此时反应容器内部呈现液体，维持该压力条件，在反应过程中注意观察反应釜内温度和压力的变化，缓慢搅拌一段时间后，缓慢释放反应釜中二氧化碳，压力释放完全后，打开反应器，混合液用高速离心机离心(10000xg，10min)，初步去除未包被进外泌体的药物，最后将上述混合液加入外泌体纯化柱，低速离心(750xg，10min)，彻底去除多余的化合物得到负载后的外泌体；所述的反应时间为0.5～1h；所述的纯化外泌体质量与负载体系体积比为1：1。

技术总结
本发明公开了一种脲类化合物及其外泌体负载方法和应用，属于药物递送材料的合成技术领域。本发明的技术方案要点为：该脲类化合物分子结构为：其中R1为甲氧基或溴，R2为氢原子或卤素或甲氧基；R3为氢原子或卤素或甲氧基。本发明发现了一种可以高效的脲类链接三氮唑结构的制备方法；该化合物分子可以对IDO1靶点具有抑制作用，可提高机体免疫力；发现了一种与外泌体负载的方式，该方法简单、高效，可用于药物递送。可用于药物递送。可用于药物递送。


技术研发人员：梁高峰 刘高见 毛龙飞 杨如月 任玉霞 蒋溢涵 王澜 詹桉 吴紫源 王熙 安君岭 高社干
受保护的技术使用者：河南科技大学
技术研发日：2023.03.23
技术公布日：2023/9/14