包含肽的组合的护肤组合物的制作方法

1.本公开整体涉及用于改善细胞能量水平和更新细胞外基质的护肤组合物和方法。更具体地，本发明涉及一种协同地调节参与细胞能量产生和细胞外基质修复的某些基因的肽的组合。


背景技术：

2.皮肤是抵抗环境侵害的第一道防线，否则会损害敏感的下层组织和器官，并且皮肤在人的身体外观中起关键作用。皮肤老化迹象(诸如皮肤上的皱纹和老年斑)是青春消失的一个不受欢迎的提醒。因此，在现今重视青春的社会中，处理皮肤老化迹象已成为急速发展的行业。
3.皮肤由多种不同的细胞组成，这些细胞以动态、复杂的关系一起发挥作用以维持皮肤的健康。然而，随着皮肤细胞老化或受损，它们可能会失去维持年轻、健康的皮肤所需的功能。皮肤细胞可能会受到多种内源性和外源性应激源(例如紫外线辐射、污染、吸烟)的损伤。在一些情况下，这些应激源可导致反应性氧物质(ros)的产生，从而干扰正常的细胞过程。作为反应，细胞已进化出对抗ros的防御能力，但细胞的防御能力可能会被应激源诱导的ros的峰值所淹没，从而不仅导致细胞内稳态的急性改变，还导致细胞内稳态的慢性改变。当ros随时间聚积时，它们在细胞水平上引起氧化应激，这最终可表现为可见的老化迹象(例如，细纹、皱纹、色素沉着过度斑、皮肤变薄)。
4.肽在护肤组合物中的用途通常是已知的。可商购获得的肽的种类和这些肽的护肤有益效果的范围可使它们成为用于护肤组合物的有吸引力的成分。例如，us 9,597,274描述了使用衍生自生长因子(诸如生长分化因子11)的肽来改善皮肤的健康和/或外观。又如，us 10,668,000描述了可含有多种不同肽的护肤组合物，这些肽在ecm蛋白的合成中是活性的并且通常改善皮肤外观。然而，肽可能是昂贵的，尤其是已知提供护肤有益效果的那些。因此，通常以相对低的量将肽添加到护肤组合物中，因此选择在低浓度下提供良好功效的肽可能是重要的。
5.因此，期望提供一种含肽护肤组合物，其可以改善人类皮肤，特别是表现出可见老化迹象的皮肤的健康和外观。具体地，期望提供一种含肽护肤组合物，其通过靶向参与这些生物化学通路组的特定基因来改善皮肤细胞中的细胞能量产生和/或ecm修复和更新过程。还期望提供一种在低浓度下提供期望功效的肽的组合。


技术实现要素：

6.本文公开了一种护肤组合物，该护肤组合物包含：棕榈酰二肽-7(pal-kt)和乙酰基四肽-11(ac-ppyl)[seq id no:1]的组合；以及皮肤病学可接受的载体；还公开了一种处理皮肤状况的方法，该方法包括将本文的新型组合物施用于期望处理的目标皮肤部分。肽的组合可以改善细胞atp水平和/或上调参与ecm修复和更新过程的某些基因，在一些情况下两者协同地进行。
具体实施方式
[0007]
肽用于改善皮肤的健康和外观的用途通常是已知的。然而，现已令人惊讶地发现棕榈酰二肽-7(“pal-kt”)和乙酰基四肽-11(ac-ppyl)[seq id no:1]的组合可促进细胞能量产生和ecm修复和更新过程。具体地，选择pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]的组合可协同地调节已知参与细胞生物能学和ecm修复和更新的关键基因的表达。改善细胞能量产生和/或ecm修复和更新对于改善皮肤，特别是表现出可见老化迹象的皮肤的健康和/或外观是重要。
[0008]
本文对“实施方案”或类似方法的引用意指与该实施方案结合描述的具体材料、特征、结构和/或特性被包括在至少一个实施方案、任选多个实施方案中，但这并不意味所有实施方案包括所描述的材料、特征、结构和/或特性。此外，材料、特征、结构、和/或特性可以任何合适的方式结合在不同的实施方案中，并且材料、特征、结构、和/或特性可以省略或替换所描述的。因此，除非另外说明或声明不相容性，否则尽管未在组合中明确地例示，本文所述的实施方案和方面可包括其它实施方案和/或方面的元件或组件或者可与其它实施方案和/或方面的元件或组件组合。
[0009]
在所有实施方案中，除非另外特别说明，否则所有成分百分比均基于化妆品组合物的重量计。除非另外特别说明，否则所有比率均为重量比。有效数字的数表示既不表达对所示量的限制，也不表达对测量精确性的限制。所有数值应理解为被词“约”修饰，除非另外特别指明。除非另外指明，否则所有测量均被理解为是在大约25℃和环境条件下进行的，其中“环境条件”意指在约1个大气压和约50％相对湿度下的条件。所有数值范围都是包含性的并且能够组合以形成未明确公开的较窄范围。例如，所描绘的范围上限和下限是可互换的，以形成另外的范围。
[0010]
本发明的组合物可包含本文所述的基本组分以及任选的成分，基本上由其组成或由其组成。如本文所用，“基本上由...组成”意指组合物或组分可仅包含如下附加成分，所述附加成分不在本质上改变受权利要求书保护的组合物或方法的基本特征和新颖特征。如说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该(所述)”旨在也包括复数形式。
[0011]
序列表
[0012]
列出seq id no:1的氨基酸或核苷酸序列以及seq id no:2和seq id no:3的核苷酸序列(它们是一级序列并且包括其保守修饰的变体)的序列表作为名称为“15965_seq_list_st25”的ascii文本文件与本技术同时提交。该ascii文本文件创建于2021年1月19日并且大小为138kb。根据mpep
§
605.08和37 cfr
§
1.52(e)，该ascii文本文件中的主题以引用方式并入本文。
[0013]
定义
[0014]“约”通过指代等于加上或减去指定值的百分之二十(+/-20％)以下(例如，小于15％、10％或甚至小于5％)的范围来修饰特定值。
[0015]
如参照组合物所用的“施用(apply或application)”意指将本发明的组合物施用或铺展到人类皮肤表面，诸如表皮上。
[0016]“化妆品组合物”意指包含美容剂并且旨在用于非治疗性(即非医学)用途的组合物。化妆品组合物的示例包括有色化妆品(例如粉底、唇膏、遮瑕物和睫毛膏)、护肤组合物
(例如保湿剂和防晒剂)、个人护理组合物(例如洗去型和免洗型沐浴剂和皂)、毛发护理组合物(例如洗发剂和调理剂)。
[0017]
本文中“衍生物”意指给定化合物的酰胺、醚、酯、氨基、羧基、乙酰基和/或醇衍生物。
[0018]“有效量”是指足以在处理期的过程内显著诱导对角质组织的积极有益效果的化合物或组合物的量。积极有益效果可为健康、外观和/或感觉有益效果，其包括独立的或组合的本文所公开的有益效果。在一个具体示例中，蔗糖酯和脂肪醇的有效量是足以增加由于氧化应激而降低的细胞atp水平的量。
[0019]“护肤”是指调节和/或改善皮肤状况(例如，皮肤健康、外观或质地/感觉)。改善皮肤状况的一些非限制性示例包括通过提供更光滑、更均匀的外观和/或感觉来改善皮肤外观和/或感觉；增加皮肤的一个或多个层的厚度；改善皮肤的弹性或回弹性；改善皮肤的紧致度；和减少皮肤的油性的、有光泽的、和/或无光泽的外观、改善皮肤的水合状态或保湿状态、改善细纹和/或皱纹的外观、改善皮肤剥落或脱屑、使皮肤丰满、改善皮肤屏障特性、改善肤色、减少发红或皮肤疹斑的外观、和/或改善皮肤的亮度、光彩、或半透明性。
[0020]“护肤活性物质”是指当施用于皮肤时，向皮肤或通常存在于其中的细胞类型提供即时和/或长久有益效果的化合物或化合物的组合。护肤活性物质可调节和/或改善皮肤或其相关细胞(例如，改善皮肤弹性、水合、皮肤屏障功能，和/或改善细胞代谢)。
[0021]“护肤组合物”意指包含护肤活性物质并且调节和/或改善皮肤状况的组合物。
[0022]“协同作用”及其变型形式意指由棕榈酰二肽-7(pal-kt)和乙酰基四肽-11[seq id no:1]的组合提供的细胞能量产生和/或ecm修复效果大于这些成分单独的预期加性效应。例如，当pal-kt和乙酰基四肽-11的组合[seq id no:2]使ppara[seq id no:2]和/或msmo1[seq id no:3]的上调增加超过这些成分各自的计算加性效应时，证明存在协同作用。
[0023]
如本文所用，“处理期”是指将材料或组合物施用至目标皮肤表面的时间长度和/或频率。
[0024]“上调”及其变型形式意指基因表达的增加。相反，“下调”意指基因表达的减少。相对于特定基因，上调和下调可根据下文更详细描述的基因调节测定来确定。
[0025]
皮肤护理组合物
[0026]
本文的新型护肤组合物旨在局部施用于人类皮肤以改善细胞能量产生和/或ecm的健康。本发明的护肤组合物含有安全有效量的棕榈酰二肽-7(pal-kt)和乙酰基四肽-11(ac-ppyl)[seq id no:1]。有效量的这两种成分的组合已经被证实上调了ppara[seq id no:2]和msmo1[seq id no:3]，因此该组合被认为参与细胞能量产生。参见，lopez-leon,s等人，“sports genetics:the ppara gene and athletes'high ability in endurance sports.asystematic review and meta-analysis”，biology of sport，第33,1卷(2016年)：第3-6页。有效量的pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]还可以协同地上调msmo1(seq id no:3)，二者被认为参与胆固醇合成并参与皮肤屏障的修复和更新。参见he m.等人，“the role of sterol-c4-methyl oxidase in epidermal biology”，biochim biophys acta.2014年3月；1841(3):331-5。
[0027]
已经证实ppara和msmo1由于皮肤的真皮老化(即，真皮的时间性老化和/或光老
care creations(new jersey)。
[0040]
皮肤病学可接受的载体
[0041]
本文的组合物包括皮肤病学可接受的载体(其可称为“载体”)。短语“皮肤病学可接受的载体”是指该载体适于局部施用于角质组织，具有良好的美学性质，与组合物中的活性物质相容，并且不引起任何不合理的安全或毒性问题。在一个实施方案中，载体以按组合物的重量计约50％至约99％、约60％至约98％、约70％至约98％、或约80％至约95％的含量存在。
[0042]
载体可为多种形式。在一些情况下，组分(例如提取物、防晒活性物质、附加组分)的溶解度或分散度可决定载体的形式和特征。非限制性示例包括简单溶液(例如含水的或无水的)、分散体、乳液和固体形式(例如凝胶、条棒、可流动的固体或无定形材料)。在一些情况下，皮肤病学可接受的载体为乳液的形式，该乳液具有连续水相(例如水包油或水包油包水乳液)或连续油相(例如油包水或油包水包油乳液)。乳液的油相可包含硅油、非硅油(诸如烃油、酯、醚)以及它们的混合物。水相可包含水和水溶性成分(例如，水溶性保湿剂、调理剂、抗微生物剂、湿润剂和/或其它护肤活性物质)。在一些情况下，水相可包含不是水的组分，该组分包括但不限于水溶性保湿剂、调理剂、抗微生物剂、湿润剂和/或其它水溶性护肤活性物质。在一些情况中，组合物的非水组分包括湿润剂，诸如甘油和/或其它多元醇。
[0043]
在一些情况下，本文的组合物为提供轻度且非油腻的知觉感觉的水包油(“o/w”)乳液的形式。本文的合适o/w乳液可包含按组合物的重量计大于50％的连续水相，并且剩余部分为分散的油相。水相可包含基于水相的重量计1％至99％的水，以及任何水溶性和/或与水混溶的成分。在这些情况下，分散的油相将通常以按组合物的重量计小于30％(例如，1％至20％、2％至15％、3％至12％、4％至10％、或甚至5％至8％)存在，以帮助避免油性组合物的一些不期望的感觉效果。油相可包括一种或多种挥发性油和/或非挥发性油(例如，植物油、有机硅油和/或烃油)。可适用于本发明组合物的油的一些非限制性示例公开于美国专利9,446,265和美国公布2015/0196464中。
[0044]
载体可包含一种或多种皮肤病学可接受的稀释剂。如本文所用，“稀释剂”是指本文的护肤活性物质能够分散、溶解或以其它方式掺入其中的材料。亲水性稀释剂的一些非限制性示例包括水、有机亲水性稀释剂诸如低级一价醇(例如c
1-c4)和低分子量二醇和多元醇，包括丙二醇、聚乙二醇(例如分子量200g/mol至600g/mol)、聚丙二醇(例如分子量425g/mol至2025g/mol)、甘油、丁二醇、1,2,4-丁三醇、山梨醇酯、1,2,6-己三醇、乙醇、异丙醇、山梨醇酯、丁二醇、醚丙醇、乙氧基化醚、丙氧基化醚以及它们的组合。
[0045]
调理剂
[0046]
本文的组合物可包含按重量计0.1％至50％的调理剂(例如，0.5％至30％、1％至20％、或甚至2％至15％)。添加调理剂可有助于为组合物提供期望的感觉特性(例如，施用时丝滑、润滑的感觉)。调理剂的一些非限制性示例包括烃油和蜡、硅氧烷、脂肪酸衍生物、胆固醇、胆固醇衍生物、甘油二酯、甘油三酯、植物油、植物油衍生物、乙酰甘油酯、烷基酯、烯基酯、羊毛脂、蜡酯、蜂蜡衍生物、甾醇和磷脂、它们的盐、异构体和衍生物、以及它们的组合。特别合适的调理剂示例包括挥发性或非挥发性硅氧烷流体，诸如聚二甲基硅氧烷共聚多元醇、二甲基聚硅氧烷、二乙基聚硅氧烷、混合的c1-30烷基聚硅氧烷、苯基聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷醇、聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷醇、硅氧烷交联聚合物、以及它们
的组合。聚二甲基硅氧烷可为尤其合适的，因为一些消费者将由某些聚二甲基硅氧烷流体提供的感觉特性与良好的保湿相关联。可适用作调理剂的硅氧烷流体的其它示例描述于美国专利5,011,681中。
[0047]
流变改性剂
[0048]
本文的组合物可包含0.1％至5％的流变改性剂(例如增稠剂)以向组合物提供合适的流变学和皮肤感觉特性。增稠剂的一些非限制性示例包括交联的聚丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、多糖、树胶、以及它们的混合物。在一个特别合适的示例中，组合物可包含超吸收聚合物增稠剂，诸如聚丙烯酸钠、淀粉接枝的聚丙烯酸钠、或这些物质的组合。超吸收聚合物增稠剂的一些非限制性示例描述于例如美国专利9,795,552中。
[0049]
一些消费者发现使用硅氧烷流体作为调理剂的组合物具有不期望的油腻感或厚重感。因此，可能期望提供不含或基本上不含硅氧烷流体的组合物。还可能期望定制超吸收聚合物增稠剂以例如通过调节组合物中水的量、水:油比率(例如，12:1至1:1)、和/或水与增稠剂或油与增稠剂的比率来为组合物提供轻盈的透气感。
[0050]
乳化剂
[0051]
当皮肤病学可接受的载体为乳液形式时，可能希望包含乳化剂以提供稳定组合物(例如，不发生相分离)。当包含乳化剂时，乳化剂可以0.1％至10％(例如，1％至5％、或2％至4％)的量存在。乳化剂可为非离子型、阴离子型或阳离子型。可适用于本文的乳化剂的一些非限制性示例公开于美国专利号3,755,560；4,421,769和mccutcheon的“洗涤剂和乳化剂(detergents and emulsifiers)”，北美版第317-324页(1986年)中。
[0052]
其它任选成分
[0053]
本发明的组合物可任选地包含一种或多种常用于化妆品组合物中的附加成分(例如，着色剂、皮肤护理活性物质、抗炎剂、防晒剂、乳化剂、缓冲液、流变改性剂、这些的组合等)，前提条件是该附加成分不会不利地改变由本发明组合物提供的皮肤健康或外观有益效果。当掺入组合物中时，附加成分应该适用于与人类皮肤组织接触，而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答等等。附加活性物质的一些非限制性示例包括维生素、矿物质、肽和肽衍生物、糖胺、防晒剂、控油剂、颗粒、类黄酮化合物、毛发生长调节剂、抗氧化剂和/或抗氧化剂前体、防腐剂、蛋白酶抑制剂、酪氨酸酶抑制剂、抗炎剂、保湿剂、剥落剂、亮肤剂、免晒美黑剂、润滑剂、抗痤疮活性物质、抗蜂窝炎活性物质、螯合剂、抗皱纹活性物质、抗萎缩活性物质、植物甾醇和/或植物激素、n-酰基氨基酸化合物、抗微生物剂和抗真菌剂。可以适用于本文的附加成分和/或护肤活性物质的其它非限制性示例描述于美国专利公布号2002/0022040、2003/0049212、2004/0175347、2006/0275237、2007/0196344、2008/0181956、2008/0206373、2010/00092408、2008/0206373、2010/0239510、2010/0189669、2010/0272667、2011/0262025、2011/0097286、us2012/0197016、2012/0128683、2012/0148515、2012/0156146和2013/0022557，以及美国专利号5,939,082、5,872,112、6,492,326、6,696,049、6,524,598、5,972,359和6,174,533中。
[0054]
当在本文的组合物中包含任选成分时，可能期望选择不与组合物中的其它成分，尤其是对ph敏感的成分如烟酰胺、水杨酸盐和肽形成络合物或以其它方式不期望地相互作用的成分。当存在时，任选成分可以按组合物的重量计0.0001％至50％；0.001％至20％；或甚至0.01％至10％(例如，50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或
0.1％)的量被包含。
[0055]
使用方法
[0056]
本发明的方法包括识别期望处理的目标皮肤部分，以及将包含有效量的维生素b3化合物、pal-kt、ac-ppyl[seq id no:1]以及任选地一种或多种附加护肤活性物质的组合物施用于目标皮肤部分。目标皮肤部分可在面部皮肤表面上(诸如前额、口周、颏、眶周、鼻部和/或面颊)或身体的另一部分(例如手、臂、腿、背、胸)。需要处理的人或目标皮肤部分可以是表现出皮肤老化迹象(例如，细纹、皱纹、色素沉着过度斑)的人或目标皮肤部分。在一些情况下，目标皮肤部分可能不表现出皮肤老化迹象，但是如果该皮肤部分是已知表现出可见老化迹象的皮肤部分(例如，暴露于阳光的皮肤)，则使用者可能仍然希望处理该皮肤部分。以这种方式，本发明的方法和组合物可以预防性地用于帮助延迟可见的皮肤老化迹象。
[0057]
可在处理期期间向目标皮肤部分，并且如果需要，向周围皮肤以每天至少一次、每天两次或以每天更频繁次数的方式施用组合物。当每天两次地施用时，第一次与第二次施用相隔至少1至12个小时。通常，组合物可在早上和/或晚上临睡觉前施用。本文的处理期理想地为对于pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]而言足以改善皮肤外观的时间。处理期可持续至少1周(例如，约2周、4周、8周或甚至12周)。在一些情况下，处理期将延长多个月(即3个月至12个月)。在一些情况下，组合物可在一周中的大多数时间(例如，每周至少4天、5天或6天)施用，在至少2周、4周、8周或12周的处理期期间至少每天一次或甚至每天两次。
[0058]
施用组合物的步骤可通过局部施用来实现。关于组合物的施用，术语“局部的”、“局部”、“局部地”是指将组合物递送到目标区域(例如，皱纹或其部分)而使对不期望处理的皮肤表面的递送最小化。组合物可施用到并且轻轻揉进皮肤区域中。组合物或皮肤病学可接受的载体的形式应被选择成有利于局部施用。虽然本文的某些实施方案设想将组合物局部施用到某一区域，但应当理解，本文的组合物可更全面地或广泛地施用到一个或多个皮肤表面。在某些实施方案中，本文的组合物可以用作多步美容方案的一部分，其中本发明的组合物可以在一种或多种其它组合物之前和/或之后施用。
[0059]
基因调节测定
[0060]
该方法提供了测量化合物或材料调节靶基因诸如ppara[seq id no:2]或msmo1[seq id no:3]表达的能力的方式。
[0061]
细胞：叔角质细胞(tkc)
[0062]
bj成纤维细胞
[0063]
铺板：在处理前一天对细胞进行铺板。
[0064]
对于叔角质细胞：针对12孔板(例如，i型胶原包被的板，corning目录号356500)，在2ml体积培养基/孔中100,000个细胞/孔；或对于24孔板，在1ml体积培养基/孔中50,000个细胞/孔。
[0065]
对于bj成纤维细胞：针对12孔板(例如，corning目录号3512)，在2ml体积培养基/孔中88,000个细胞/孔；或对于24孔板，在1ml体积培养基/孔中44,000个细胞/孔。
[0066]
培养基：对于叔角质细胞：epilife(例如，thermo fisher scientific目录号mepi500ca+hkgs(例如，thermo fisher scientific目录号s-001-5)。
[0067]
对于bj成纤维细胞：emem(例如，atcc目录号30-2003)+10％ fbs(例如，hyclone目
录号sh30071.02)。
[0068]
在培养基中进行处理并等分到剂量板中。当需要处理细胞时，将所有的细胞板同时从培养箱中取出。一次使用一个板，除去培养基并加入处理物，如下：
[0069]
‑‑
从细胞板中滗出培养基。
[0070]
‑‑
将倒置的板简单地在纸巾上吸干。
[0071]
‑‑
将盖子放回到板上，并将板移入生物安全柜中。
[0072]
‑‑
使用多通道移液管将处理物从剂量板转移至细胞板，一次一个柱。
[0073]
一旦所有板都被处理，将它们移入37℃、5％ co2和90％湿度的培养箱中。在处理期结束前约15分钟至30分钟，经由显微镜观察来自每个处理的代表性孔的细胞，然后将板放回培养箱中。当处理时间结束时，将所有板从培养箱中取出。从每个板中滗出培养基，并将板在纸巾上吸干。将350μl qiagen buffer rlt添加到每个孔中以使细胞裂解，并将裂解物转移到2ml eppendorf管中并于-20℃储存直至准备用于基因组学。
[0074]
wafergen方法：总rna纯化和qpcr
[0075]
将细胞裂解物在4℃解冻，然后使用biomek fxp和rnadvance组织分离试剂盒(beckman coulter，部件编号a32646)分离。使用nandrop 8000(nanodrop，nd-8000)定量所得的rna。使用500ng总rna和applied biosystems high capacity cdna与逆转录测试试剂盒(applied biosystems部件编号4368814)产生cdna。使用wafergen nanodispenser将primetime geneexpression mastermix(idt，部件编号1055771)的cdna、测定物和稀释液铺板到wafergen mydesign smartchip(takarabio，部件编号640036)上。然后将玻片加载到smartchip循环仪中并使用以下pcr条件进行qpcr：
[0076]
保持阶段：50℃达2分钟(加热)，然后95℃达10分钟。
[0077]
pcr阶段(40个循环)：95℃达15秒，然后60℃达1分钟。
[0078]
以.txt文件格式导出数据用于分析。
[0079]
过氧化氢应激的atp测定
[0080]
皮肤细胞(例如角质细胞和成纤维细胞)通过使用能量产生酶和还原当量(例如gsh)来对抗反应性氧物质，这导致细胞atp水平的耗竭。较低的能量水平使得细胞易于降低适应和正常发挥功能的能力。因此，增加细胞atp水平可帮助细胞对抗应激并维持用于正常稳态的足够能量。
[0081]
过氧化氢是众所周知的ros替代物。当用高水平(例如200μm至500μm)的过氧化氢处理皮肤细胞时，一小时内在未受应激的细胞中观察到细胞atp水平降低约10％。细胞atp水平可以用来自promega的cell titer glo牌测定试剂盒或等同物定量，其中发光信号与存在的atp的量成比例。
[0082]
方法概述：
[0083]
使用来自储备的膨胀tkc进行该测定。将细胞在培养瓶中扩增5天，胰蛋白酶化，接种，然后在96孔板中生长。在96孔板中生长1天后，不处理也不应激第1柱细胞，用过氧化氢(培养基中300μm)处理第2柱至第12柱细胞，不用测试材料处理第2柱，而用测试材料的系列稀释液处理第3柱至第12柱达1小时(37℃，5％ co2培养箱)。
[0084]
细胞制备：
[0085]
1.将细胞以10,000个细胞/孔、100ul总体积/孔接种在合适的96孔板(例如，
corning牌白色透明底板#3903或等同物)中。
[0086]
2.将细胞在37℃、5％ co2、95％湿度下培养24小时直至处理日。例如，可在星期一接种细胞并在星期二测定。
[0087]
处理：
[0088]
1.从细胞板中吸出培养基。
[0089]
2.向第1柱孔a1至h1中添加100ul培养基。
[0090]
3.向第2柱至第12柱的所有孔中添加含有300μm过氧化氢的100μl培养基。
[0091]
4.向第2柱(a2至h2)中添加载体对照，并向第3柱至第11柱中添加1ul处理的系列稀释液。
[0092]
5.向第12柱的所有孔中添加1μl 40.9mm烟酰胺，使烟酰胺的最终水平为409μm(阳性对照)。
[0093]
6.在37℃、5％ co2培养箱中放置1小时。
[0094]
7.从所有孔中吸出培养基。
[0095]
8.根据制造商说明书向每个孔中添加100ul cell titer glo牌试剂。
[0096]
9.在室温下温育5分钟至10分钟。
[0097]
10.在合适的读板机上读取发光值。
[0098]
发光检测：
[0099]
使用来自biotek的synergy neo牌读板机或等同物。
[0100]
实施例
[0101]
实施例1：制剂。
[0102]
下表1提供了本发明的护肤组合物的实施例。通过用合适的搅拌器(例如，tekmar rw20dzm或等同物)共混a相组分并加热至70℃至80℃的温度，并且在搅拌的同时保持温度，来制备示例性组合物。单独地，用合适的搅拌器共混b相组分并加热至70℃至75℃，同时在混合期间保持温度。将相b添加到相a中，同时充分混合以形成水包油(o/w)乳液。然后使用合适的研磨机(例如，tekmar t-25或等同物)将乳液研磨5分钟。当乳液处于60℃时，添加相c，同时继续混合。处于40℃时，将相d和相e的成分添加到乳液。然后将乳液研磨5分钟以提供均匀的组合物。
[0103]
表1
[0104][0105][0106]
实施例2：pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]协同地上调ppara[seq id no:2]和msmo1[seq id no:3]。
[0107]
该实施例证明了pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]的组合能够协同地上调ppara[seq id no:2]。如上文在基因调节测定中所述制备了测试组合物和对照组合物，并相应地
进行了测试。该实施例中使用的pal-kt是来自sederma(france)的palestrina牌pal-kt，ac-ppyl是来自basf care creations(new jersey).的syniorage牌四肽。该测试的结果汇总于下表2中。p+a是指pal-kt(p)和ac-ppyl(a)[seq id no:1]的组合。
[0108]
协同因子计算如下：
[0109][0110]
其中p值≤0.05的大于1.00的协同因子指示统计意义上显著的协同效应。优选的协同因子为1.3或更大。
[0111]
表2
[0112][0113][0114]
如表2中可见，并不是pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]的所有组合都产生期望的协同效应。含有1ppm pal-kt(pal-kt与四肽的比率为1:13.5至100:1.35)的测试样品组合对于上调msmo1[seq id no:3]没有表现出1.3或更大的协同因子。含有7.5ppm pal-kt的测试样品组合在约1:2的比率下仅表现出所期望的上调ppara[seq id no:2]的协同作用，尽管其它组合表现出较低的协同地上调ppara[seq id no:2]的能力。含有1ppm的测试样品中的仅一个测试样品能够协同地上调ppara[seq id no:2]，并且没有一个测试样品表现出1.3或更大的协同因子。因此，数据表明，肽的浓度和肽的比率对于上调ppara[seq id no:2]和msmo1[seq id no:3]都可能是重要的。
[0115]
实施例3：pal-kt和ac-ppyl[seq id no:3]改善细胞生物能学。
[0116]
该实施例证明了pal-kt和ac-ppyl[seq id no:3]能够对抗ros诱导的atp耗竭。暴露于过氧化氢(一种众所周知的反应性氧物质)的测试细胞通常将表现出降低的atp水平。
可以恢复由于暴露于ros而耗竭的atp水平的测试试剂是期望的。可协同地恢复atp水平并表现出1.3或更大的协同因子的测试试剂是优选的。根据上述过氧化氢应激的atp测定来测试肽。该测试的结果汇总于下表3中。其中p值≤0.05的大于1.00的协同因子指示统计意义上显著的协同效应。优选的协同因子为1.3或更大。
[0117]
表3：ros诱导的atp恢复
[0118][0119]
如表3所示，并不是pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]的所有组合都能协同地恢复细胞内ros耗竭的atp水平。事实上，仅含有比率为约10:1至1:10的pal-kt和ac-ppyl的组合能够协同地增加atp产生。在该实施例中，pal-kt与ac-ppyl[seq id no:1]的比率为约1:1的测试样品似乎表现出最高的协同因子。
[0120]
实施例4：二肽特异性。
[0121]
该实施例证明了选择特定二肽以提供ppara[seq id no:2]和/或msmo1[seq id no:3]的期望的协同上调的重要性。在该测试中，来自pal-kt的氨基酸重排以形成新的二肽pal-tk。如上文在基因调节测定中所述制备了测试组合物和对照组合物，并相应地进行了测试。该测试的结果汇总于下表4中。倍数变化因子计算如下。
[0122][0123]
需要大于1的倍数变化因子，优选1.3或更大的倍数变化因子。
[0124]
令人惊奇的是，pal-kt能够比pal-tk显著更好地上调ppara[seq id no:2]和msmo1[seq id no:3]，并且对于上调ppara[seq id no:2]和msmo1[seq id no:3]表现出大于1.3的倍数变化因子。
[0125]
表4-pal-kt对pal-tk的特异性
[0126][0127]
令人惊讶地，如表4中可见，具有与pal-kt相同的氨基酸但以不同顺序排列的二肽不提供期望的协同效应。这些数据表明特定的肽序列对于提供期望的协同作用是重要的。
[0128]
示例性组合
[0129]
a.一种护肤组合物，包含：
[0130]
a)棕榈酰二肽-7(pal-kt)和乙酰基四肽-11(ac-ppyl)[seqid no:1]的组合，其中该pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]的组合上调ppara(seq id no:2)和msmo1(seq id no:3)中的至少一者；以及
[0131]
b)皮肤病学可接受的载体。
[0132]
b.根据段落a所述的组合物，其中该pal-kt和ac-ppyl的组合[seq id no:1]协同地上调ppara(seq id no:2)和msmo1(seq id no:3)中的至少一者。
[0133]
c.根据段落a或b所述的组合物，其中该pal-kt和ac-ppyl的组合[seq id no:1]表现出至少1.3的协同因子。
[0134]
d.根据任一前述段落所述的组合物，其中该pal-kt以0.00005％至5％存在。
[0135]
e.根据任一前述段落所述的组合物，其中该ac-ppyl[seq id no:1]以0.00005％至5％存在。
[0136]
f.根据任一前述段落所述的组合物，其中该pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]以10:1至1:10的比率存在。
[0137]
g.根据任一前述段落所述的组合物，还包含至少一种附加成分，该至少一种附加成分选自维生素、矿物质、肽、糖胺、防晒剂、控油剂、类黄酮化合物、抗氧化剂、蛋白酶抑制剂、酪氨酸酶抑制剂、抗炎剂、保湿剂、剥落剂、亮肤剂、抗痤疮剂、抗皱剂、植物甾醇、n-酰基氨基酸化合物、抗微生物剂、抗真菌剂、ph调节剂、增稠剂、防腐剂以及它们的组合。
[0138]
h.根据段落g所述的组合物，其中该附加成分包括维生素b3化合物、维生素a化合物、维生素e化合物、糖类或植物提取物。
[0139]
i.一种用化妆品处理皮肤的方法，包括：
[0140]
a)识别期望处理的目标皮肤部分；以及
[0141]
b)在处理期的过程内将根据任一前述段落所述的护肤组合物施用于目标皮肤部分，该护肤组合物包含棕榈酰二肽-7(pal-kt)和乙酰基四肽-11(ac-ppyl)[seq id no:1]的组合以及皮肤病学可接受的载体。
[0142]
j.根据段落i所述的方法，其中该pal-kt和ac-ppyl的组合[seq id no:1]上调ppara[seq id no:2]和msmo1[seq id no:3]中的至少一者，优选该pal-kt和ac-ppyl的组合[seq id no:1]协同地上调ppara[seq id no:2]和msmo1[seq id no:3]中的至少一者。
[0143]
k.根据段落i所述的方法，其中根据过氧化氢应激的atp测定，该pal-kt和ac-ppyl的组合[seq id no:1]改善细胞atp水平，优选协同地改善细胞atp水平。
[0144]
l.根据段落i所述的方法，其中该处理器为至少2周。
[0145]
m.根据段落所述的方法，其中该方法改善可见的皮肤老化迹象。
[0146]
n.一种协同地上调皮肤细胞内ppara[seq id no:2]和msmo1[seq id no:3]中的至少一者的方法，包括：使皮肤与有效量的pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]的组合接触，其中该有效量的pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]上调ppara[seq id no:2]和msmo1[seq id no:3]中的至少一者。
[0147]
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
[0148]
除非明确排除或以其它方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本技术对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。对任何文献的引用不是对其作为与本发明的任何所公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何一个或多个参考文献的组合提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义
与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。
[0149]
虽然已示出和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种其它变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有此类变化和修改。

技术特征：
1.一种化妆用护肤组合物，包含：a)棕榈酰二肽-7(pal-kt)和乙酰基四肽-11(ac-ppyl)[seq id no:1]的组合；以及b)皮肤病学可接受的载体。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述pal-kt以0.00005％至5％存在。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述ac-ppyl[seq id no:1]以0.00005％至5％存在。4.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述pal-kt和ac-ppyl[seq id no:1]以10:1至1:10的比率存在。5.根据任一前述权利要求所述的组合物，还包含至少一种附加成分，所述至少一种附加成分选自维生素、矿物质、肽、糖胺、防晒剂、控油剂、类黄酮化合物、抗氧化剂、蛋白酶抑制剂、酪氨酸酶抑制剂、抗炎剂、保湿剂、剥落剂、亮肤剂、抗痤疮剂、抗皱剂、植物甾醇、n-酰基氨基酸化合物、抗微生物剂、抗真菌剂、ph调节剂、增稠剂、防腐剂以及它们的组合。6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述附加成分包括维生素b3化合物、维生素a化合物、维生素e化合物、糖类或植物提取物。7.根据权利要求5所述的组合物，还包含0.1％至5％的流变改性剂。8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物是水与油的重量比为12:1至1:1的水包油，并且所述流变改性剂包含超吸收聚合物增稠剂。9.一种处理皮肤的非治疗性方法，包括：a)识别期望处理的目标皮肤部分；以及b)在处理期的过程内向所述目标皮肤部分施用根据任一前述权利要求所述的护肤组合物。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述处理期为至少2周，优选4周。11.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述方法改善可见的皮肤老化迹象。

技术总结
本发明提供了一种护肤组合物，其包含棕榈酰二肽-7、乙酰基四肽-11、其它任选的皮肤成分和皮肤病学可接受的载体的组合。该肽的组合协同地改善细胞ATP水平和/或上调过氧化物酶体增殖物激活受体α和/或甲基固醇单加氧酶1的表达以帮助提供改善的皮肤健康和外观。表达以帮助提供改善的皮肤健康和外观。


技术研发人员：L
受保护的技术使用者：宝洁公司
技术研发日：2022.01.21
技术公布日：2023/9/14