一种基于侧向层析技术的AFP-L3%检测方法与流程

一种基于侧向层析技术的afp-l3％检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于侧向层析技术的afp-l3％检测方法。


背景技术：

2.甲胎蛋白(afp)是目前临床应用最广泛的肝癌辅助诊断血清标志物。但是早期肝癌afp的检出率只有30％～40％，而且在肝脏良性疾病，特别是肝癌高危人群，如慢性肝炎、肝硬化中也有部分患者会出现afp升高。其较低的特异性，对afp轻度升高的肝癌和慢性肝病的鉴别诊断造成较大困难。
3.afp是一种单链糖蛋白，根据其与小扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin，lca)的亲和力从低到高依次分为afp-l1、afp-l2和afp-l3。afp-l1主要见于良性肝病，afp-l2主要由卵黄囊产生并多见于孕妇，而afp-l3主要来源于肝癌细胞，也被称为甲胎蛋白异质体。afp-l3对肝癌是高特异性的指标，特异性可达到95％以上，也是诊断肝癌特异性最强的肿瘤标记物。美国食品与药品监督管理局(fda)已于2005年批准afp-l3检测试剂和方法用于临床肝癌预警。
4.然而，afp亚型间的结构差异仅为糖基化基团，目前通常认为抗体无法有效特异性识别区分各亚型，因此无法通过常规的双抗体夹心等免疫检测手段进行afp-l3的检测。目前用于afp-l3的检测方法有植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法、免疫电泳法、亲和离心柱法、化学发光法等。日本和光纯药株式会社(wako)的μtaswako i30检测系统采用荧光电泳的方法，该检测试剂仅需一次进样即可得出afp-l3％的结果，但是该方法系统复杂，试剂昂贵，临床使用成本高。北京热景生物的甲胎蛋白异质体afp-l3亲和吸附离心管是国内最早获批的适用于afp-l3检测的方法。该方法采用琼脂糖凝胶偶联lca，通过亲和吸附和离心分离的方法分离afp-l3，再结合普通总afp检测试剂进行测定。但是，该方法采用手工操作，步骤繁琐，无法实现自动化，不利于高通量检测。已有公开技术资料公布了一种基于lca包被的磁珠的甲胎蛋白异质体(afp-l3)分离试剂。该方法利用含适量明胶的胶状液体基质，将磁性微球悬浮分散形成一种均相反应体系，结合岩藻糖竞争洗脱实现对afp-l3的分离。利用同样原理，另一种现有技术资料公开了一种可实现afp-l3的自动化检测的双磁珠系统，通过分离磁珠分离出afp-l3，经洗脱后再通过由检测磁珠及其他试剂成分组成的检测系统进行afp-l3的测定。但是，由于afp-l3分离步骤需要在37℃孵育20min，并进行清洗和洗脱，使得该试剂完成整个检测过程耗时较长。此外，检测系统中每引入一个环节，都不可避免的引入新的误差和不精密度。
5.然而在现有afp-l3检测技术中，植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法等方法操作繁琐，耗时，步骤复杂，对操作人员素质要求高，无法实现高通量检测。亲和吸附离心管法同样采用手工操作，步骤繁琐，无法实现自动化，对配套试剂及设备要求多，且需要结合其他afp检测试剂进行测定。日本和光i30检测系统采用荧光电泳的方法，一次进样即可得出afp-l3％的结果，但是该方法系统复杂，试剂昂贵，临
床使用成本高。双磁珠系统由分离磁珠和检测磁珠构成，其中分离磁珠利用lca和afp-l3的亲和力从样本中分离出afp-l3，检测系统则采用常规的双抗夹心的方法检测分离磁珠所分离的afp-l3。这种方法由于分离步骤的引入，检测所需时间较长，且多一次分离环节，不利于提高整个检测的精密度。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供的一种基于侧向层析技术的afp-l3％检测方法，操作简单，一次检测即可获得afp-l3在总afp中所占比例，即afp-l3％。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了组合物，包括生物素标记的凝集素、链霉亲和素、抗甲胎蛋白抗体和标记有抗甲胎蛋白抗体片段的标记物。
9.在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中，所述标记有抗甲胎蛋白抗体片段中的所述抗体片段包括f(ab’)2片段、fab’片段、fab或fv片段中的一种或多种。
10.在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中，所述标记有抗甲胎蛋白抗体片段中的所述抗体片段还包括通过naio4氧化等方法去除fc片段的糖基化修饰的抗体。
11.在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物还包括羊抗鸡igy抗体、标记有igy抗体的标记物、样本垫、偶合物垫或硝酸纤维素膜中的一种或多种。
12.在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物包括：
13.所述凝集素包括小扁豆凝集素、橙黄网胞盘菌凝集素、刀豆凝集素或莲藕凝集素中的一种或多种；和/或
14.所述标记物包括胶体金颗粒、磁性微球、彩色微球、荧光微球、时间分辨荧光微球、负载有荧光染料的微球或负载有荧光蛋白的微球中的一种或多种；和/或
15.所述抗甲胎蛋白抗体片段包括抗甲胎蛋白抗体f(ab')2；和/或
16.制备所述样品垫的材料包括聚酯膜；和/或
17.制备所述偶合物垫的材料包括聚酯膜；和/或
18.所述微球具有表面功能团，所述表面功能团包括羧基、氨基、醛基或酰氯中的一种或多种。
19.本发明还提供了上述组合物在如下任意项中的应用：
20.(1)、制备获取afp-l3占总afp的比例的检测试剂；
21.(2)、制备获取afp-l3占总afp的比例的检测试剂盒；
22.(3)、制备获取afp-l3占总afp的比例的装置；
23.(4)、获取待测样品中afp-l3占总afp的比例；
24.所述装置包括侧向层析试剂条。
25.本发明还提供了试剂，包括上述组合物，以及可接受的辅料或助剂。
26.本发明还提供了试剂盒，包括上述组合物或上述试剂，以及可接受的辅料或助剂。
27.本发明还提供了装置，包括：
28.具有上述组合物；
29.所述生物素标记的凝集素包被于所述样品垫或不包被于所述样品垫；
30.所述链霉亲和素固定于所述硝酸纤维素膜；
31.所述抗甲胎蛋白抗体固定于所述硝酸纤维素膜；
32.所述标记有抗甲胎蛋白抗体片段的标记物固定于所述偶合物垫；
33.所述装置包括侧向层析试剂条。
34.本发明还提供了侧向层析试剂条，包括生物素标记的小扁豆凝集素、链霉亲和素、抗甲胎蛋白抗体和标记有抗甲胎蛋白抗体f(ab')2的荧光微球、羊抗鸡igy抗体、标记有igy抗体的荧光微球、样本垫、偶合物垫或硝酸纤维素膜；
35.制备所述样品垫的材料包括聚酯膜；
36.制备所述偶合物垫的材料包括聚酯膜；
37.所述生物素标记的小扁豆凝集素包被于所述样品垫或不包被于所述样品垫；
38.所述链霉亲和素固定于所述硝酸纤维素膜；
39.所述抗甲胎蛋白抗体固定于所述硝酸纤维素膜；
40.所述标记有抗甲胎蛋白抗体f(ab')2的荧光微球固定于所述偶合物垫；
41.所述标记有抗甲胎蛋白抗体f(ab')2的荧光微球固定于所述偶合物垫
42.所述羊抗鸡igy抗体固定于所述硝酸纤维素膜；
43.标记有igy抗体的荧光微球固定于所述偶合物垫。
44.本发明还提供了获取待测样本中afp-l3占总afp的比例的方法，其基于侧向层析技术获取。
45.在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括：
46.(a)、取上述组合物制备侧向层析试剂条，移取部分待测样本至所述侧向层析试剂条，获取所述侧向层析试剂条上的信号，获得afp-l3占总afp的比例；或
47.(b)、取上述试剂制备侧向层析试剂条，移取部分待测样本至所述侧向层析试剂条，获取所述侧向层析试剂条上的信号，获得afp-l3占总afp的比例；或
48.(c)、取上述试剂盒制备侧向层析试剂条，移取部分待测样本至所述侧向层析试剂条，获取所述侧向层析试剂条上的信号，获得afp-l3占总afp的比例；或
49.(d)、取上述侧向层析试剂条，移取部分待测样本至所述侧向层析试剂条，获取所述侧向层析试剂条上的信号，获得afp-l3占总afp的比例；或
50.(e)、取如权利要求8所述的侧向层析试剂条，取待测样本与所述生物素标记的小扁豆凝集素混合获得混合液，移取混合液至所述侧向层析试剂条，获取所述侧向层析试剂条上的信号，获得afp-l3占总afp的比例。
51.本发明的检测方法有如下效果：
52.本发明利用侧向层析技术实现仅需一次侧向层析测试即可获取afp-l3占总afp比例(afp-l3％)的结果，操作简单，试剂保存条件要求低，便于运输。且利用了生物素-链霉亲和素体系和合理的检测线设置提高检测灵敏度。
附图说明
53.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
54.图1示基于侧向层析技术的afp-l3％检测试剂条结构示意图；
55.图2示基于侧向层析技术的afp-l3％检测原理示意图。
desalting columns进行纯化除去过量的biotin-peg-nhs。
65.3、微球包被：采用edc/nhs两步法缩合偶联的方式，将制备的f(ab’)2片段按照投料比例为每毫克微球投料10μg f(ab’)2包被到微球表面。具体地，10mg微球采用20mm mes缓冲液(ph 5.5)清洗3次。然后加入0.5ml含50mg/ml edc的mes缓冲液、及0.5ml含50mg/ml nhs的mes缓冲液，并在室温孵育30分钟。离心去上清后，采用20mm mes缓冲液清洗一次，加入1.0ml mes缓冲液将微球充分分散，并加入100μg f(ab’)2。充分混匀后在室温震荡孵育3小时。孵育结束后，离心去上清，并将微球分散在20mm tris缓冲液(ph 7.4)中，孵育15分钟后离心去上清。将微球分散在0.5wt％blockmaster db1130水溶液中，在室温下震荡孵育1小时进行封闭。封闭结束后，采用20mm tris缓冲液(ph 7.4)进行清洗，并分散保存在含1％bsa的20mm tris缓冲液(ph 7.4)中，得到标记有抗体的微球。
66.4、侧向层析试剂条制备：
67.(1)样本垫的处理：聚酯膜裁剪成13mm
×
300mm后在喷金划膜仪上喷涂0.1mg/ml生物素化的lca，并于37℃烤制过夜；作为对照，聚酯膜裁剪至相应尺寸后，不进行喷涂，备用。
68.(2)偶合物垫的处理：聚酯膜裁剪成13mm
×
300mm后在喷金划膜仪上喷涂5mg/ml包被有afp抗体片段f(ab’)2的荧光微球，并于37℃烤制过夜；
69.(3)划nc膜：将nc膜贴在pvc背板上，然后用喷金划膜仪上分别在c线，t1线，t2线位置以羊抗鸡igy抗体(1.0mg/ml)、链霉亲和素(2.0mg/ml)和afp抗体(2.0mg/ml)划膜，并于37℃烤制过夜。作为对照，将未经处理的植物凝集素按2.0mg/ml划线在nc膜的t1线处。另，为验证c线，t线划膜位置对检测灵敏度的影响，设置対照组：沿着层析方向依次以链霉亲和素(2.0mg/ml)、afp抗体(2.0mg/ml)和羊抗鸡igy抗体(1.0mg/ml)划膜，即依次为t1线，t2线和c线。
70.(4)层压：将吸水纸、已经喷有荧光微球的偶合物垫、喷有生物素化lca的样本垫贴到已经贴有nc膜并划有t线和c线的pvc底板上。
71.(5)切条并组装：将组装好的大板切成特定宽度，并用塑料镊子将切好的试纸条试剂条固定于底座定位槽中，盖上上盖，轻压以固定，然后装入含有干燥剂的铝箔袋室温密闭保存。
72.实施例2
73.免疫检测：
74.所述本发明检测方法采用如制备例所示方法制得的侧向层析试剂条，将待测样本滴加70μl至试剂条的样本孔位，并在室温静置孵育15min后。然后将试剂条插入我司gt-100时间分辨荧光免疫分析仪，并直接读t线及c线处的荧光信号强度。
75.将t1线的信号强度与c线的信号强度比值(r1)代入主曲线可计算得afp-l3浓度c1(c1＝f(r1))；样本中总afp的浓度则由c2+c1而得，其中c2则通过t2线的信号强度与c线的信号强度比值(r2)代入其对应的主曲线可计算得到。根据所得c1和c2的结果，计算得c1/(c1+c2)的结果，即为afp-l3％。将商业化afp-l3纯品(≥95％)稀释后经罗氏电化学发光甲胎蛋白测定试剂盒测定浓度为5.6ng/ml的样品作为低值校准品，以pbs为零浓度校准品，进行测试计算本发明检测方法检测afp-l3的最低检测限。
76.重复测定20次pbs，得出20次结果的r1值，计算其平均值(m)和标准差(sd)，得出m+2sd；另测试3次低值校准品，取平均值。根据pbs和低值校准品测试均值之间的浓度—r1值
进行两点线性回归拟合得出一次方程y＝0.00082x+0.0011，将m+2sd的值代入上述方程，求出对应的浓度值，即为afp-l3的最低检测限，具体结果如表1所示。
77.表1：本发明的afp-l3最低检测限测试
[0078][0079]
测试结果显示，本方法检测afp-l3的最低检测限为0.79ng/ml。
[0080]
实施例3
[0081]
相比于实施例2，本实施例未采用链霉亲和素-生物素体系，直接将植物凝集素固定在nc膜上t线，当样本随液体层析流经t线时，样本中afp-l3才可与固定在t线的植物凝集素接触并结合，反应时间大大缩短，对目标物的检测灵敏度也明显受到影响，如表2所示。
[0082]
表2：未采用链霉亲和素-生物素体系的对照组afp-l3最低检测限测试
[0083][0084]
测试结果显示，对照方法检测afp-l3的最低检测限为2.83ng/ml，灵敏度显著低于实验组方法。
[0085]
实施例4
[0086]
与实施例2的区别在于，沿着层析方向依次以链霉亲和素(2.0mg/ml)、afp抗体(2.0mg/ml)和羊抗鸡igy抗体(1.0mg/ml)划膜，即依次为t1线，t2线和c线。结果显示，测试c线处的荧光信号未受到明显影响，t1与t2处荧光信号在测试空白样本时与实施例2无明显区别，而测试低值校准品时获得的荧光信号则均低于实施例2。对灵敏度的测试结果如表3所示。
[0087]
表3：划膜位置对afp-l3最低检测限的影响
[0088]
[0089]
实验结果显示，当沿着层析方向依次以链霉亲和素(2.0mg/ml)、afp抗体(2.0mg/ml)和羊抗鸡igy抗体(1.0mg/ml)划膜，即依次为t1线，t2线和c线时，灵敏度稍低于实施例2。这是由于不同条件下c线位置发生的免疫结合均为nc膜上二抗与微球上标记的鸡igy结合，不受位置影响；当测试零值空白样本时，在t线处无免疫反应发生，仅为背景，因此，划膜位置不同并不产生影响；而当样本中有目标物时，则发生与微球上的抗体，以及溶液中的植物凝集素的免疫结合，t线越靠后，三者发生免疫结合的孵育时间越长，从而有利于形成更多免疫结合物，从而获得更高荧光信号。
[0090]
实施例5
[0091]
将商业化afp-l3纯品(＞95％)与普通重组afp抗原按不同比例混合，所得样品经北京热景生物afp-l3亲和吸附离心管分离并结合罗氏e-411上测定分离出的afp-l3及未分离的总afp的浓度，由此计算各配制样本的afp-l3％(对照组)。作为实验组，则将混合的样品直接滴加至本发明中如实施例1所示方法制备的侧向层析试剂条进行检测，结合t1线和t2线处的标准曲线，分别计算出afp-l3和总afp的浓度，并计算afp-l3％。
[0092]
表4：本发明检测afp-l3％与比对试剂的一致性评估
[0093][0094]
实验结果显示，配制的4个样品用实验组和对照组测试结果afp-l3％具有良好的一致性，相对差异在
±
15％以内。
[0095]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.组合物，其特征在于，包括生物素标记的凝集素、链霉亲和素、抗甲胎蛋白抗体和标记有抗甲胎蛋白抗体片段的标记物。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括羊抗鸡igy抗体、标记有igy抗体的标记物、样本垫、偶合物垫或硝酸纤维素膜中的一种或多种。3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，包括：所述凝集素包括小扁豆凝集素、橙黄网胞盘菌凝集素、刀豆凝集素或莲藕凝集素中的一种或多种；和/或所述标记物包括胶体金颗粒、磁性微球、彩色微球、荧光微球、时间分辨荧光微球、负载有荧光染料的微球或负载有荧光蛋白的微球中的一种或多种；和/或所述抗甲胎蛋白抗体片段包括抗甲胎蛋白抗体f(ab')2；和/或制备所述样品垫的材料包括聚酯膜；和/或制备所述偶合物垫的材料包括聚酯膜；和/或所述微球具有表面功能团，所述表面功能团包括羧基、氨基、醛基或酰氯中的一种或多种。4.如权利要求1至3任一项所述的组合物在如下任意项中的应用：(1)、制备获取afp-l3占总afp的比例的检测试剂；(2)、制备获取afp-l3占总afp的比例的检测试剂盒；(3)、制备获取afp-l3占总afp的比例的装置；(4)、获取待测样品中afp-l3占总afp的比例；所述装置包括侧向层析试剂条。5.试剂，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的组合物，以及可接受的辅料或助剂。6.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的组合物或如权利要求6所述的试剂，以及可接受的辅料或助剂。7.装置，其特征在于，包括：具有如权利要求1至3任一项所述的组合物；所述生物素标记的凝集素包被于所述样品垫或不包被于所述样品垫；所述链霉亲和素固定于所述硝酸纤维素膜；所述抗甲胎蛋白抗体固定于所述硝酸纤维素膜；所述标记有抗甲胎蛋白抗体片段的标记物固定于所述偶合物垫；所述装置包括侧向层析试剂条。8.侧向层析试剂条，其特征在于，包括生物素标记的小扁豆凝集素、链霉亲和素、抗甲胎蛋白抗体和标记有抗甲胎蛋白抗体f(ab')2的荧光微球、羊抗鸡igy抗体、标记有igy抗体的荧光微球、样本垫、偶合物垫或硝酸纤维素膜；制备所述样品垫的材料包括聚酯膜；制备所述偶合物垫的材料包括聚酯膜；所述生物素标记的小扁豆凝集素包被于所述样品垫或不包被于所述样品垫；所述链霉亲和素固定于所述硝酸纤维素膜；所述抗甲胎蛋白抗体固定于所述硝酸纤维素膜；
所述标记有抗甲胎蛋白抗体f(ab')2的荧光微球固定于所述偶合物垫；所述标记有抗甲胎蛋白抗体f(ab')2的荧光微球固定于所述偶合物垫所述羊抗鸡igy抗体固定于所述硝酸纤维素膜；标记有igy抗体的荧光微球固定于所述偶合物垫。9.获取待测样本中afp-l3占总afp的比例的方法，其特征在于，基于侧向层析技术获取。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，包括：(a)、取如权利要求1至3任一项所述的组合物制备侧向层析试剂条，移取待测样本至所述侧向层析试剂条，获取所述侧向层析试剂条上的信号，获得afp-l3占总afp的比例；或(b)、取如权利要求6所述的试剂制备侧向层析试剂条，移取待测样本至所述侧向层析试剂条，获取所述侧向层析试剂条上的信号，获得afp-l3占总afp的比例；或(c)、取如权利要求7所述的试剂盒制备侧向层析试剂条，移取待测样本至所述侧向层析试剂条，获取所述侧向层析试剂条上的信号，获得afp-l3占总afp的比例；或(d)、取如权利要求8所述的侧向层析试剂条，移取待测样本至所述侧向层析试剂条，获取所述侧向层析试剂条上的信号，获得afp-l3占总afp的比例；或(e)、取如权利要求8所述的侧向层析试剂条，取待测样本与所述生物素标记的小扁豆凝集素混合获得混合液，移取混合液至所述侧向层析试剂条，获取所述侧向层析试剂条上的信号，获得afp-l3占总afp的比例。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于侧向层析技术的AFP-L3％检测方法。本发明提供了组合物及其应用、侧向层析试纸条、获取甲胎蛋白异质体的方法。甲胎蛋白异质体(AFP-L3)占总AFP水平的百分比(AFP-L3％)的检测对于原发性肝癌的辅助预测、诊断、疗效评估、预后判断及复发监测中均有重要应用价值。但受限于检测技术的复杂性、可靠性等因素，AFP-L3％的检测在临床诊断中应用有限。本发明提出的基于侧向层析技术的AFP-L3％检测方法操作简单，一次检测即可获得AFP-L3在总AFP中所占比例，即AFP-L3％。L3％。


技术研发人员：陈干超 陈明峰 郑筱雯
受保护的技术使用者：深圳市国赛生物技术有限公司
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/9/16