抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法。


背景技术：

2.创伤弧菌(vibrio vulnificus)、河流弧菌(vibrio fluvialis)和霍乱弧菌(vibrio cholerae)隶属于弧菌目(vibrionales)，弧菌科(vibrionaceae)，弧菌属(vibrio)，广泛存在于世界各地的河口、湖泊、海鲜及沿海水体环境中，是引起人和水产动物感染的重要病原菌。其中，创伤弧菌是流行最广、危害最严重的水产养殖细菌性疾病的病原之一，主要寄宿在温暖海域的海水、鱼、虾、贝类以及浮游生物中，在20～30℃水温条件下最适宜其繁殖；创伤弧菌感染的鱼类主要有罗非鱼、鳗鲡、石斑鱼、军曹鱼、黄姑鱼、矛尾腹虾虎鱼等，其能够引起多种鱼类、虾蟹类和贝类的败血症、腐皮病和脓疱病，给水产养殖业造成了严重的危害；霍乱弧菌能感染鱼、虾等水产动物，使其发生疾病，并造成大量死亡，水产动物中的鱼类被认为是霍乱弧菌的天然宿主，在较低温度的水环境中仍具有致病性，最适生长温度为24℃～30℃；霍乱弧菌感染圆鳍雅罗鱼、须条鳅、茴鱼、拟白鱼、河鳟，病鱼腹部和鳍基部出现出血症状、鳃部充血、眼球破裂。此外，霍乱弧菌感染鲤鱼、虹鳟鱼后，鱼体腹腔内存在积液，膀胱壁出现静脉充血症状，且快速死亡。
3.目前，用于创伤弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌引起的疾病的防治手段包括：抗生素和化学类药物、中草药、灭活疫苗和抗体等。其中，广泛使用的是抗生素和化学类药物，然而随着抗生素和化学药物的长期滥用，抗生素和化学类药物的使用存在以下问题：
4.1)、病原菌产生耐药性，导致抗生素的作用效果显著降低，甚至无效；
5.2)、造成严重的水体污染，并引发水环境微生态失衡；
6.3)、在动物体内出现抗生素残留，影响水产品的食品质量安全，并间接危害人体的健康。
7.研究发现，卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin,igy)具有特异性强、高效性、无毒副作用以及对环境无污染等优点，可将其作为抗生素和化学类药物的一种有效的替代品。而且卵黄抗体还具有低成本、高效益、生产便利、产量高和制备简单等特点，被作为疾病预防和控制的有效方法。具体在于：与现有的抗生素和化学药物相比，应用卵黄抗体具有以下几个优点：特异性强，与抗生素不同，卵黄抗体只针对相应的致病菌，不会对其它菌群产生影响；获取简单：卵黄抗体可从免疫蛋鸡的鸡蛋中获取，无需宰杀大量动物并且产生的抗体效价高、稳定性强；禽类与哺乳动物之间存在一定系统发育距离，少量抗原就可以引发有效的免疫应答；无残留：由于卵黄抗体属干免疫球蛋白，发挥作用后会被机体作为营养物质消化吸收；研发周期短、成本低、可长期保存，便于运输和应用。因此，卵黄抗体被广泛应用于动物疾病的防治和疾病诊断等方面，美国食品和药品管理局(fda)将卵黄抗体列入“公认安全使用物质(generally recognized as safe,gras)，特异性卵黄抗体通过饲喂、注射和浸浴等方式，对水产动物起到保护预防及疾病治疗作用，还可以应用于免疫学检测、水产品
保鲜和疾病诊断等领域。
8.但现有的卵黄抗体主要应用在包括抗罗氏沼虾野田病毒、抗贝氏隐孢子虫病、抗河流弧菌病、抗嗜水气单胞菌病、抗霍乱弧菌、抗灿烂弧菌和抗鳗弧菌病等中，在抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三者同时应用的卵黄抗体还未见报道。


技术实现要素：

9.本发明意在提供一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法，制备得到的三联卵黄抗体特异性强、纯度较高，并且对创伤弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌具有较强的抑制作用，而且该三联卵黄抗体的制备成本低、方便简单，适于大规模生产。有效的解决了上述问题。
10.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
11.抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
12.s1、创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌抗原的制备与灭活
13.分别利用液体培养基接种创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌，然后分别将其置于恒温摇床中振荡培养过夜，离心收集菌体，收集到的菌体利用缓冲液洗涤后得到菌悬浮液；
14.分别向菌悬浮液中加入固定液调节其浓度，然后在室温条件下灭活，再对其洗涤离心，并将离心得到的菌体沉淀物与缓冲液混匀，最后将创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌混合，调节菌液浓度得到菌悬液，即得到灭活的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌抗原，冷藏备用；
15.s2、免疫蛋鸡并收集鸡蛋
16.将蛋鸡进行基础免疫和加强免疫，免疫后每周收集鸡蛋，并将其冷藏备用；
17.s3、卵黄抗体的分离纯化
18.s3.1、将步骤s2得到的免疫鸡蛋的蛋壳进行消毒，然后分离卵黄，在卵黄中加入预冷无菌蒸馏水，并接着调节ph，混合溶液搅匀后将其静置过夜；
19.s3.2、将步骤s3.1的混合溶液进行离心，得到的上清液利用微孔滤膜过滤，得到卵黄抗体的水溶性组分；
20.s3.3、调节步骤s3.2的卵黄抗体的水溶性组分的饱和度，混合溶液搅匀后静置过夜；
21.s3.4、将步骤s3.3的混合溶液进行离心，得到沉淀物利用缓冲液稀释至原体积后，再次调节饱和度，混合溶液搅匀后静置2h；
22.s3.5、将步骤s3.4的混合溶液进行离心，沉淀物利用缓冲液重悬，得到三联卵黄抗体。
23.进一步地，在s1中，用于接种的液体培养基为2216e液体培养基；恒温摇床的温度为30℃；固定液为4％的多聚甲醛固定液；菌悬浮液的终浓度为0.4％，室温灭活时间为24h；冲洗菌体的缓冲液均为bs缓冲液；混合创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌的体积比为1：1：1；菌悬液的浓度为3x108cfu/ml；冷藏温度为4℃。
24.进一步地，在s2中，基础免疫的次数为1次，基础免疫的方法为：将步骤s1得到的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌抗原加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行胸肌分区注射免疫，免疫剂量为1ml/只；
25.加强免疫的次数为3次，加强免疫的方法为：将步骤s1得到的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌抗原加入等量的不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行胸肌分区注射免疫，免疫剂量为1.5ml/只，每次免疫间隔10天；
26.鸡蛋冷藏的温度为4℃。
27.进一步地，在s3.1中，利用酒精擦拭蛋壳进行消毒，利用卵黄分离器分离卵黄；加入预冷无菌蒸馏水的体积为卵黄体积的7倍；利用0.1m hcl调整混合溶液的ph浓度为5.0，静置过夜的温度为4℃；
28.在s3.2中，混合溶液在4℃，12000g条件下离心25min，微孔滤膜过滤的孔径为0.45μm和0.2μm；
29.在s3.3中，利用硫酸铵调节混合溶液的饱和度为55％，静置过夜的温度为4℃；
30.在s3.4中，混合溶液在4℃，12000g条件下离心20min，利用pbs缓冲液稀释沉淀物，利用硫酸铵调节混合溶液的饱和度为33％，静置的温度为4℃；
31.在s3.5中，混合溶液在4℃，12000g条件下离心20min，沉淀用pbs缓冲液重悬。
32.上述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法制备得到的抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体。
33.上述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法制备得到的抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体的检测方法，采用酶联免疫吸附试验检测抗体效价和sds-page电泳鉴定抗体的纯度；通过体外抑菌试验观察所述三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌的生长抑制作用；利用共聚焦激光扫描显微镜观察所述三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌的亲和性及凝集效果；利用扫描电子显微镜观察所述三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌表面结构和细胞完整性的破坏情况。
34.上述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法制备得到的抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体在制备创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌引起的疾病预防或治疗药物中的应用。
35.上述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法制备得到的抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体在创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌免疫学检测中的应用。
36.技术方案的有益效果是：
37.1、本发明制备得到的抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体，其由创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌的抗原免疫健康产蛋母鸡而得，具有特异性好、纯度较高、效价高的优点；
38.2、本发明制备得到的三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌具有较强的抑制作用，可用于创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌引起的疾病预防和治疗，以及免疫学检测；
39.3、本发明制备抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体的方法简单、安全无毒、成本低、产量高，易于产业化。
附图说明
40.图1为本发明实施例制备得到三联卵黄抗体的效价图；
41.图中，a为创伤弧菌；b为河流弧菌；c为霍乱弧菌
42.图2为本发明实施例制备得到三联卵黄抗体的还原型sds-page凝胶电泳图；
43.图中，m为蛋白maker；1为wsf；2为第一次盐析；3为第二次盐析
44.图3为本发明实施例制备得到三联卵黄抗体的western blot图；
45.图中，a为创伤弧菌；b为河流弧菌；c为霍乱弧菌；m为蛋白maker；1为三联卵黄抗体；2为非特异性卵黄抗体
46.图4为本发明实施例制备得到三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌的扫描电镜图；
47.图中，a为创伤弧菌；b为河流弧菌；c为霍乱弧菌；(a)为三联卵黄抗体；(b)为非特异性卵黄抗体
48.图5为本发明实施例制备得到三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌的共聚焦激光扫描显微镜图；
49.图中，a为创伤弧菌；b为河流弧菌；c为霍乱弧菌；(a)为三联卵黄抗体；(b)为非特异性卵黄抗体；(c)为空白组
50.图6为本发明实施例制备得到三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌的体外抑菌效果图；
51.图中，a为创伤弧菌；b为河流弧菌；c为霍乱弧菌
具体实施方式
52.下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明：
53.抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
54.制备弧菌抗原
55.将创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌接种于2216e液体培养基中，30℃恒温摇床振荡培养过夜，离心收集菌体，pbs缓冲液洗涤菌体3次，得到弧菌悬浮液；
56.弧菌抗原的灭活
57.向上述菌悬液中分别加入4％多聚甲醛固定液，使其终浓度为0.4％，室温灭活24h。用pbs缓冲液洗涤菌体4次，离心后的菌体沉淀物与pbs缓冲液混匀，将创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌1:1等比混匀后，调整菌液浓度为3x108cfu/ml，即得到灭活的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌抗原，放4℃冰箱备用；
58.免疫蛋鸡并收集鸡蛋
59.将蛋鸡进行1次基础免疫和3次加强免疫，灭活的弧菌抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行胸肌分区注射免疫，免疫剂量为1ml/只；加强免疫是将灭活的弧菌抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行胸肌分区注射免疫，免疫剂量为1.5ml/只，每次免疫间隔10天。首次免疫后的每周日开始收集鸡蛋，4℃冰箱保存备用；
60.从蛋黄中分离卵黄抗体
61.用酒精擦拭免疫鸡蛋的蛋壳，通过卵黄分离器分离卵黄，然后在卵黄中加入卵黄体积7倍的预冷无菌蒸馏水，用0.1m hcl调整ph浓度为5.0，混匀后于4℃冰箱静置过夜。然后在4℃，12000g条件下离心25min，上清液依次用0.45μm和0.2μm微孔滤膜过滤，即为卵黄
抗体的水溶性组分(wsf)。
62.卵黄抗体的纯化
63.向卵黄抗体水溶性组分中加入硫酸铵至饱和度为55％，充分搅拌均匀后4℃过夜，4℃，12000g条件下离心20min，将沉淀用pbs缓冲液稀释至原体积，再加入硫酸铵至饱和度为33％，充分搅拌均匀后4℃静置2h，4℃，12000g条件下离心20min，将沉淀用pbs缓冲液重悬，得到三联卵黄抗体。
64.实施例一
65.抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体的效价测定
66.将甲醛灭活的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌，分别用elisa包被液调整浓度为108cfu/ml，用于96孔板的包被，每孔100μl，4℃冰箱静置过夜。次日倒去孔内液体，用pbst洗涤3次后加入封闭液，每孔200μl，37℃封闭2h。pbst洗涤3次后，将上述制备的wsf用抗体稀释液按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1：25600、1:51200等梯度稀释每孔加入100μl，37℃孵育2h，以相应稀释倍数的非特异性性的wsf做阴性对照，每个梯度设3个重复。pbst洗涤3次，每孔加入100μl的1:100000稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鸡igy作为二抗，37℃孵育1h，洗涤5次后加入tmb底物显色液，室温避光孵育20min，随后加入2mol/l h2so4终止反应，用酶标仪读取波长450nm吸光值，待测样品与阴性对照od值的比值≥2.1，即为效价值，对应样品的最大稀释倍数为抗河流弧菌卵黄抗体的效价。
67.如图1所示，4个箭头分别表示初次免疫、二次免疫、三次免疫、四次免疫的时间，每次间隔10天；由图1可知，初次免疫后效价缓慢上升，4周后效价明显升高，6周达到峰值(1:51200)，持续时间4～5周左右，然后逐步下降。
68.实施例二
69.抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体的纯度测定
70.取上述方法制备得到的卵黄抗体的水溶性组分和三联卵黄抗体，进行igy纯度鉴定，用15％还原型sds-page检测。
71.如图2所示，图中，泳道m为蛋白marker；泳道1为卵黄抗体的水溶性组分(wsf)；泳道2为硫酸铵第一次盐析后所得溶液；泳道3为硫酸铵第二次盐析后所得溶液。由图2可知，卵黄抗体由两条重链和两条轻链组成，重链和轻链分别约68kda和25kda左右。
72.实施例三
73.抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体的westernblot特异性性检测
74.分别把创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌与三联卵黄抗体和非特异性卵黄抗体室温孵育2h，煮沸离心，10％还原型sds-page电泳。用半干法将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，封闭液(含5％脱脂奶粉的tbst溶液)室温封闭2h。洗涤5次，然后与1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igy室温孵育1h。洗涤5次后，使用ecl化学发光超敏显色试剂避光显色。
75.如图3所示，二抗可以和三联卵黄抗体特异性结合，能被识别而显示出来相对应的蛋白条带。
76.实施例四
77.扫描电镜观察三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌表面结构的影响
78.三联卵黄抗体的wsf和非特异性卵黄抗体的wsf用超滤管超滤至终浓度16mg/ml，
与2216e液体培养基等比混匀，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌。分别调整创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌的浓度为106cfu/ml，37℃孵育2h。4000g离心10min，pbs洗涤3次，分别加入2ml 2.5％戊二醛固定液室温固定2h后，暂存在4℃冰箱，样品送到武汉赛维尔生物科技有限公司检测。
79.如图4所示，与非特异性卵黄抗体相比，在三联卵黄抗体作用下的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌的菌体表面粗糙，边缘不整，菌体凝集且相互黏附。
80.实施例五
81.共聚焦激光扫描显微镜观察三联卵黄抗体与创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌的亲和性
82.灭活的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌分别调整菌液浓度为106cfu/ml，取750μl菌液，分别加入等体积的三联卵黄抗体、非特异性卵黄抗体(16mg/ml)和pbs溶液，37℃孵育2h。pbs洗涤3次，加入400μlfitc标记的兔抗鸡igg(1:200稀释)，37℃避光孵育2h。用pbs洗涤4次重悬后，吸取10μl菌液滴于载玻片，盖玻片固定。用共聚焦激光扫描显微镜检测细菌的活性。
83.如图5所示，相比非特异卵黄抗体组(图5b)和空白组(图5c)，制备的三联卵黄抗体组(图5a)中，可观察到荧光标记较多，表明制备的三联卵黄抗体与创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌特异性结合能力较强，且fitc标记的igg与igy亲和性较好。
84.实施例六
85.体外抑菌试验
86.三联卵黄抗体、非特异性卵黄抗体的wsf分别用超滤浓缩管超滤浓缩，用超微量分光光度计调整抗体浓度，分别为2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、16mg/ml，以不含卵黄抗体的2216e液体培养基为空白对照。所有溶液均通过0.2μm微孔滤膜过滤除菌。分别取对数生长期的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌，用pbs重悬至浓度为105cfu/ml，取3ml菌液与不同浓度的三联卵黄抗体、非特异性卵黄抗体和pbs溶液1:1充分混合。将混合液置于30℃恒温振荡器(160rpm)振荡培养，每隔2h取150μl测定od620
nm
吸光度。
87.如图6所示，表明制备的三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌均具有明显抑制作用，并且呈现剂量依赖性。
88.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌抗原的制备与灭活分别利用液体培养基接种创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌，然后分别将其置于恒温摇床中振荡培养过夜，离心收集菌体，收集到的菌体利用缓冲液洗涤后得到菌悬浮液；分别向菌悬浮液中加入固定液调节其浓度，然后在室温条件下灭活，再对其洗涤离心，并将离心得到的菌体沉淀物与缓冲液混匀，最后将创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌混合，调节菌液浓度得到菌悬液，即得到灭活的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌抗原，冷藏备用；s2、免疫蛋鸡并收集鸡蛋将蛋鸡进行基础免疫和加强免疫，免疫后每周收集鸡蛋，并将其冷藏备用；s3、卵黄抗体的分离纯化s3.1、将步骤s2得到的免疫鸡蛋的蛋壳进行消毒，然后分离卵黄，在卵黄中加入预冷无菌蒸馏水，并接着调节ph，混合溶液搅匀后将其静置过夜；s3.2、将步骤s3.1的混合溶液进行离心，得到的上清液利用微孔滤膜过滤，得到卵黄抗体的水溶性组分；s3.3、调节步骤s3.2的卵黄抗体的水溶性组分的饱和度，混合溶液搅匀后静置过夜；s3.4、将步骤s3.3的混合溶液进行离心，得到沉淀物利用缓冲液稀释至原体积后，再次调节饱和度，混合溶液搅匀后静置2h；s3.5、将步骤s3.4的混合溶液进行离心，沉淀物利用缓冲液重悬，得到三联卵黄抗体。2.根据权利要求1所述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在s1中，用于接种的液体培养基为2216e液体培养基；恒温摇床的温度为30℃；固定液为4％的多聚甲醛固定液；菌悬浮液的终浓度为0.4％，室温灭活时间为24h；冲洗菌体的缓冲液均为bs缓冲液；混合创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌的体积比为1：1：1；菌悬液的浓度为3x108cfu/ml；冷藏温度为4℃。3.根据权利要求1所述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在s2中，基础免疫的次数为1次，基础免疫的方法为：将步骤s1得到的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌抗原加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行胸肌分区注射免疫，免疫剂量为1ml/只；加强免疫的次数为3次，加强免疫的方法为：将步骤s1得到的创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌抗原加入等量的不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行胸肌分区注射免疫，免疫剂量为1.5ml/只，每次免疫间隔10天；鸡蛋冷藏的温度为4℃。4.根据权利要求1所述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在s3.1中，利用酒精擦拭蛋壳进行消毒，利用卵黄分离器分离卵黄；加入预冷无菌蒸馏水的体积为卵黄体积的7倍；利用0.1mhcl调整混合溶液的ph浓度为5.0，静置过夜的温度为4℃；在s3.2中，混合溶液在4℃，12000g条件下离心25min，微孔滤膜过滤的孔径为0.45μm和0.2μm；在s3.3中，利用硫酸铵调节混合溶液的饱和度为55％，静置过夜的温度为4℃；
在s3.4中，混合溶液在4℃，12000g条件下离心20min，利用pbs缓冲液稀释沉淀物，利用硫酸铵调节混合溶液的饱和度为33％，静置的温度为4℃；在s3.5中，混合溶液在4℃，12000g条件下离心20min，沉淀用pbs缓冲液重悬。5.根据权利要求1～4任一项所述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法制备得到的抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体。6.根据权利要求1～4任一项所述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法制备得到的抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体的检测方法，其特征在于，采用酶联免疫吸附试验检测抗体效价和sds-page电泳鉴定抗体的纯度；通过体外抑菌试验观察所述三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌的生长抑制作用；利用共聚焦激光扫描显微镜观察所述三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌的亲和性及凝集效果；利用扫描电子显微镜观察所述三联卵黄抗体对创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌表面结构和细胞完整性的破坏情况。7.根据权利要求1～4任一项所述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法制备得到的抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体在制备创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌引起的疾病预防或治疗药物中的应用。8.根据权利要求1～4任一项所述的一种抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法制备得到的抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌三联卵黄抗体在创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌免疫学检测中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了抗创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌卵黄抗体的制备方法，包括S1、创伤弧菌、河流弧菌和霍乱弧菌抗原的制备与灭活；S2、免疫蛋鸡并收集鸡蛋；S3、卵黄抗体的分离纯化；并公开了对该卵黄抗体的效价和纯度鉴定、对三种弧菌的生长抑制作用、对三种弧菌的亲和性及凝集效果、对三种弧菌表面结构和细胞完整性的破坏情况的检测方法；还公开了该卵黄抗体在制备三种弧菌引起的疾病预防或治疗药物中和在免疫学检测中的应用；本发明制备得到的卵黄抗体特异性强、纯度较高，并且对创伤弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌具有较强的抑制作用，而且该卵黄抗体的制备成本低、方便简单，适于大规模生产。适于大规模生产。适于大规模生产。


技术研发人员：秦真东 张林鹏 林蠡 刘春 滕功名
受保护的技术使用者：仲恺农业工程学院
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/16