一种草地贪夜蛾产卵忌避信息素及其应用

1.本发明涉及忌避信息素技术领域，具体是一种草地贪夜蛾产卵忌避信息素及其应用。


背景技术：

2.草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda, j.e. smith)属鳞翅目夜蛾科，是影响广泛的农业害虫之一，其原发生于美洲地区，成虫具有很强的迁飞传播性。根据国内目前农作物的受损情况、境外虫源的持续迁入、国内虫源的逐步扩散等情况都说明草地贪夜蛾对我国农作物的生产与生态环境的安全造成严重威胁。
3.由于长期依赖于化学防治，草地贪夜蛾对多种农药已产生抗性；包括有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类及苏云金芽孢杆菌crylf杀虫蛋白等。过度使用化学农药，同样还存在对人畜产生危害、食物安全以及环境污染的问题。这不符合国家现有农业发展策略，与推行的新型绿色政策要求不一致。因此探索研发绿色安全、环境友好、可持续性发展的草地贪夜蛾防治技术成为本领域技术人员亟需解决的问题。
4.植食性昆虫成虫的嗅觉系统对其寄主植物的产卵选择起到重要作用；根据气味物质对应的昆虫行为开发出了多种昆虫行为调节剂。由于以往的研究更多注重引诱剂的筛选，已经取得了较多成果，因此，就目前来看，忌避剂的筛选显得更为迫切。昆虫产卵忌避信息素(insect oviposition deterring pheromones,简称odp)不仅可达到干扰其在寄主植物上产卵的目的，且对环境污染的威胁较小，化学稳定性较好，专一性强，具有较高的潜在开发价值，符合我国建设农业强国、农业绿色高质量发展的要求。
5.研制开发一种利用草地贪夜蛾自身卵表忌避信息素合成为主要成分的害虫忌避剂，用于草地贪夜蛾的生物防治，具有十分重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是提供一种草地贪夜蛾产卵忌避信息素及其应用，可以有效解决上述背景技术中提出的问题。
7.为解决上述问题，本发明所采取的技术方案是：一种草地贪夜蛾产卵忌避信息素其特征在于，信息素合成物包括邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸、十六碳烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸，其质量浓度依次为1.8mg/l-2.2mg/l、32mg/l-36mg/l、0.6mg/l-1.2mg/l、23mg/l-29mg/l、28mg/l-32mg/l、86mg/l-94mg/l、45mg/l-52mg/l。
8.优选的，所述邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸、十六碳烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸，其质量浓度依次为1.962mg/l、34.703mg/l、0.915mg/l、26.861mg/l、30.908mg/l、89.186mg/l、48.155mg/l。
9.优选的，由前面所述的一种草地贪夜蛾产卵忌避信息素的应用，其特征在于，将含有上述化合物的信息素喷洒在植物植株上，待植物叶上的液体自然风干，以影响草地贪夜蛾的产卵产所，以及抑制产卵。
10.各化合物对应的英文如下：邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate）、棕榈酸（hexadecanoic acid）、十六碳烯酸（palmitoleic acid）、硬脂酸（octadecanoic acid）、油酸（oleic acid）、亚油酸（9,12-octadecadienoic acid (z,z)-）、亚麻酸（linolenic acid）。
11.与现有技术相比，本发明提供了一种草地贪夜蛾产卵忌避信息素及其应用，具备以下有益效果：本发明提出的忌避信息素，对该害虫寻找寄主、定位产卵等行为活动均会产生影响，对田间害虫综合防控具有积极作用；经过实验验证，对草地贪夜蛾具有较好的产卵趋避及产卵抑制作用且防效稳定，可减缓草地贪夜蛾对药剂的抗药性。
附图说明
12.图1为本发明草地贪夜蛾卵表化合物 gc-ms 总离子流图；图2为本发明草地贪夜蛾卵表化合物鉴定结果表；图3为本发明不同浓度的化合物组合液配置表；图4为本发明不同浓度的信息素，对室内草地贪夜蛾产卵产所选择的忌避作用对比图；图5为本发明不同浓度的信息素，对室外草地贪夜蛾产卵产所选择的忌避作用对比图；图6为本发明产卵抑制率的计算公式；图7为本发明不同浓度组合物对草地贪夜蛾产卵能力的抑制作用；图8为本发明草地贪夜蛾产卵忌避信息素的田间缓释效果试验图。
具体实施方式
13.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
14.实施例一：1、昆虫饲养草地贪夜蛾的饲养温度为27
±
1℃，湿度为60%-70%，光周期 l:d=16:8；幼虫使用种子黑糯301种植出来的玉米叶片饲喂，六孔细胞板中饲养；成虫用10%的蜂蜜水饲喂，在 pvc 板和直径为10cm 的培养皿做成的笼子中饲养。成虫化蛹后，按照虫蛹的雌雄特征将蛹分开，雌蛹和雄蛹单独存放，待蛹羽化后挑选翅膀完整的雌虫和雄虫交配作为待测生物。
15.2、化合物提取鉴定（1）卵表化合物提取在草地贪夜蛾雌虫2日龄后，进行第一次交配产卵，产卵8-16h后收集5个来自不同雌虫的卵块，每个卵块约收集400粒卵。采用正己烷作为溶剂提取卵表化合物，将收集的卵粒放入2 ml的色谱瓶中并加入正己烷定容至1 ml，轻轻摇动小瓶使卵充分浸泡，置于4 ℃冰箱下保存。浸泡24 h后取0.5 ml上清液到新的色谱瓶中，并保存在4℃冰箱中。
16.(2)卵表化合物定性定量采用的gc-ms气相色谱-质谱联用仪，型号为agilent 7890b，色谱柱为毛细管柱db-wax（长
×
内径
×
膜厚=30m
×
320μm
×
0.25μm），升温程序为：200
°
c保持0分钟；以8
°
c/min
升温到240
°
c于25分钟，总运行时间30min。吸取上述保存的上清液采取分流进样，每次进样2μl。溶剂延迟为2.2min，加热器温度300℃，载气为高纯度氦气，流速6ml/min，四级杆150℃，离子源温度230℃。质谱分析条件为：电子轰击（ei）离子源，电子能量70ev，电子倍增器电压350v，质量范围扫描35~335amu。使用windowsnt/massspectralsearch program程序（v.1.7）用于数据分析。根据国际标准技术研究所（nist）库中已建立的标准，使用定制的gc-ms库检测。
17.对检测物质进行定性分析后，购买标准品化合物对检测出的组合的离子图谱和保留时间进行比对核实，（总离子流图如图1所示）。对检测的化合物采用内标法进行定量分析，以月桂酸作为内标参比物，应用上述相同的gc-ms检测条件，计算标准品化合物与月桂酸的检测相关系数，得出相应化合物的浓度值。标准化合物配置方法：将每个化合物配置10mg/ml的母液，然后混合稀释到1mg/ml，然后在200μl标准化合物中加入10μl10mg/ml的月桂酸，并以月桂酸作为内标进行了定量计算。对全部检索结果进行核对定量分析，试验重复进行3次，定量结果如图2所示。
18.实施例二：产卵忌避信息素的室内活性测定（1）产卵忌避信息素的组配由于烷烃类不为主要忌避信息素的组合物，故本实验采用的化合物组合为上述化合物鉴定结果去除烷烃类后的7种化合物，采用的化合物组合为邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸（十六酸）、十六碳烯酸（棕榈油酸）、硬脂酸（十八烷酸）、油酸、亚油酸（(z,z)-9,12-十八二烯酸二聚物）和亚麻酸。溶剂为正己烷，用分析天平称量各化合物溶解于正己烷中。
19.以配置800粒卵当量的信息素组合物为例，首先称量10个卵块（4000粒卵）当量的各个化合物溶解于10ml的正己烷中作为该化合物的母液，而后稀释5倍化合物母液配置为2卵块（800粒卵）当量的待测组合物。
20.具体称量过程：使用分析天平与称量纸各称量邻苯二甲酸二丁酯3.924mg、棕榈酸6.941mg、十六碳烯酸1.809mg、硬脂酸5.372mg、油酸6.182mg、亚油酸17.837mg、亚麻酸9.631mg各用10ml正己烷溶解装于15ml色谱瓶中作为母液备用；棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸5种化合物各吸取母液100μl，邻苯二甲酸二丁酯、十六碳烯酸这2种化合物各吸取母液10μl，再吸取480μl正己烷定容至1ml；此为4000粒卵浓度组合物制备过程，需扩大组合物容积，则按比例放大。将4000粒卵浓度组合物放大比例配置为10ml，而后进行5倍稀释（1：4），配置出800粒卵当量的浓度。
21.按照上述方法，配置出800粒卵当量的浓度后，进行2倍稀释、4倍稀释、8倍稀释出400粒卵浓度、200粒卵浓度、100粒卵浓度。而后使用100粒卵浓度再进行2倍稀释、4倍稀释、20倍稀释配置出50粒卵当量、25粒卵当量、5粒卵当量浓度的组合物（如图3所示）存于4℃冰箱备用。
22.（2）室内活性测定本室内试验采用产卵选择法对草地贪夜蛾进行产卵忌避生测试验。采用5组不同浓度的组合物进行试验。浓度分别为5、25、100、400、800粒卵当量，配置不同浓度组合物方法与室外试验中的组合物配置方法相同，具体浓度（如图3所示）。采用将长30cm宽20cm的不锈钢4mm*8mm孔网卷成直径为9cm,长为20cm的圆筒状网笼，两端为直径为12cm的滤纸，同时使用盖板将滤纸与网笼相贴合封闭。其中一端滤纸均匀涂加1ml待测组合物溶液为处理，另
一侧滴加等量溶剂正己烷作为对照，待滤纸晾干后固定于产卵笼两侧。网笼中央用棉线悬挂加入适量蜂蜜水的棉球供雌虫取食。在整个操作过程中特别注意不能让加有蜂蜜水的棉球碰触生测笼的任何位置以免影响结果。
23.取交配后的雌虫放置于产卵笼中，待雌虫产卵后，统计雌虫选择产卵的位置。在放置生测笼时，注意光照方向一致，同时打开通风保持空气流通。每组至少进行60次生物学重复，记录产卵结果后采用卡方检验进行统计分析（如图4所示）。
24.结果表明，在室内试验中，在5种浓度组合物下，草地贪夜蛾选择对照组产卵的次数均显著高于选择在处理组产卵的次数。在组合物最低浓度5粒卵当量下，雌虫选择对照组产卵的次数同样显著高于处理组的产卵次数（p《0.05），这说明草地贪夜蛾雌虫在感知该化合物后，对产卵地点的定位发生改变。
25.图4中，具体组合物浓度由附图3所展示。对照组为纯正己烷；*、**、***表明p＜0.05、p＜0.001、p＜0.0001的概率水平上差异显著（卡方检验）。
26.实施例三：产卵忌避信息素的室外测定（1）玉米种植生物测试（简称生测）使用的玉米为种子黑糯301，玉米种植前先用自来水浸泡12h，后将种子捞出清洗，种植在育苗盆上育苗。待玉米苗长出3叶后，挑选健康苗株移栽到花盆中（盆高19.8cm，盆口外直径21cm，底部直径14.5cm），用有机土种植，放置在阳光能正常照射的地方。定时给玉米浇水和施肥，保证玉米能正常生长，并进行定期观察虫害的发生和人工除虫（不使用农药）。生测玉米培育至玉米喇叭口期，即玉米土表高度45
±
3cm，茎周长3.5
±
0.5cm，叶片11
±
1片，共种植玉米20株。
27.（2）田间模拟试验室外试验分为6种不同浓度的组合液进行生物行为测定。6组浓度分别为25粒卵当量、50粒卵当量、100粒卵当量、200粒卵当量、400粒卵当量、800粒卵当量，具体浓度（如图3所示）。
28.在室外进行试验时，温度为30
±
5℃，湿度为55%-65%。
29.实验操作：分为处理组和对照组，使用小型喷壶均匀喷洒上述配置的信息素组合物于处理组的玉米植株上；对照组玉米喷洒正己烷做空白对照；静置3h等玉米叶上的液体自然风干。处在长2m，宽1.8m，高1.65m的昆虫笼中两边各摆放10株玉米，处理组玉米和对照组玉米放置距离不小于60m，同组玉米株间隔15cm，和蚊帐间隔15cm，在蚊帐中间放入装有10%的蜂蜜水的棉花，于5cm直径的培养皿，给成虫补充营养。同时提前给每盘玉米浇水，防止玉米缺水造成叶片卷缩。取20对第一次交配的雌虫和雄虫于8h内进行生物测试。将成虫放入蚊帐中，待其产卵后分别记录玉米上的卵粒数和卵块的数量（摘除卵块），实验重复6组。
30.分析不同浓度处理对草地贪夜蛾交配、产卵能力的抑制作用，以及对产卵产所的忌避作用。实验中雌蛾可以自由地选择在处理或对照的玉米叶上产卵。结果表明，在双选测试中草地贪夜蛾更愿意在对照组玉米叶上产卵，化合物对草地贪夜蛾雌虫具有显著的产卵趋避作用（如图5所示），在25粒卵浓度、50粒卵浓度、100粒卵浓度、200粒卵浓度、400粒卵浓度、800粒卵浓度6种浓度下，对照组玉米叶上的产卵块数显著高于在处理组玉米叶上的产卵块数。表明该组合物在不同浓度下对草地贪夜蛾产卵行为均起到趋避作用，且各浓度下
该组合物产生的差异均达到极显著水平（p《0.0001）。按照公式（如图6所示）计算不同浓度组合物处理的产卵抑制率。对草地贪夜蛾的产卵量也有抑制作用(如图7所示），草地贪夜蛾在对照组玉米叶上的平均产卵量均显著高于处理组玉米叶的平均产卵量，且二者存在极显著差异（p《0.01），结果表明，各浓度下的化合物，其抑制率均在88%以上。
31.图5中，字母ck表示对照组，字母ct表示处理组，具体浓度由图3所展示，对照组为纯正己烷，采用配对样本t检验的分析方法****表明在 p《0.0001 的水平上差异显著；图7中，字母ck表示对照组，字母ct表示处理组,数据均为平均值
±
标准误差，采用配对样本t检验的分析方法，p＜0.001水平差异显著。
32.实施例四：产卵忌避信息素的田间缓释效果试验称取1.2 g聚乙烯醇到250 ml三颈烧瓶中，加入60ml去离子水，以300r/min的速度搅拌并调节温度至80 ℃，加热1 h，然后称取12g苯乙烯， 0.6g二乙烯苯和0.2g偶氮二异丁腈，三种物质混均匀后加到三颈烧瓶中，调节机器搅拌速度至500 r/min，温度不变，搅拌6 h；待反应完成后抽滤，用蒸馏水洗涤三次放入真空干燥箱干燥，得到p（st-bma）纳米微球。将10种化合物按照定量结果中的质量比例配置成混合化合物，而后将混合后的化合物加入到10g 的p（st-bma）纳米微球中，混匀后溶于含有千分之一吐温80的水中，使其化合物的总浓度为1mg/l 、10mg/l 、100mg/l 和500mg/l的浓度。进行田间测试中，每个浓度重复6次，每个重复田块中玉米株数为1000株， 从出苗开始，每10天喷施一次。从出苗到喇叭口期结束，统计玉米的危害株数，对不同浓度下玉米的危害株率进行差异性显著性分析。
33.参照图8，试验结果表明，对照组玉米的危害株率为20.65
±
2.11%，当忌避信息素的浓度为1mg/l时，玉米危害率为 20.28
±
2.22%，其忌避效果与对照比差异不显著；当浓度为10mg/l时，能够产生显著的忌避效果，其危害株率为 9.36
±
0.71%；当浓度为100mg/l时能够产生与500mg/l相当的忌避效果，在100mg/l与500mg/l的浓度下，其植株危害率分别为3.20
±
0.71%与0.35
±
0.12% 。
34.综上所述，室内室外试验均验证该组合物对草地贪夜蛾的产卵行为调控，对草地贪夜蛾产卵地选择行为起到有效的调控作用，当草地贪夜蛾感知到组合物的存在后，则会避免在该植株上产卵；在雌虫产卵地选择过程中起到关键作用，同时对雌虫的产卵量也起到抑制作用。可将该组合物用于草地贪夜蛾的无公害防治、应用前景广阔。
35.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种草地贪夜蛾产卵忌避信息素，其特征在于，信息素合成物包括邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸、十六碳烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸，其质量浓度依次为1.8mg/l-2.2mg/l、32mg/l-36mg/l、0.6mg/l-1.2mg/l、23mg/l-29mg/l、28mg/l-32mg/l、86mg/l-94mg/l、45mg/l-52mg/l。2.根据权利要求1所述的一种草地贪夜蛾产卵忌避信息素，其特征在于，所述邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸、十六碳烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸，其质量浓度依次为1.962mg/l、34.703mg/l、0.915mg/l、26.861mg/l、30.908mg/l、89.186mg/l、48.155mg/l。3.根据权利要求1或2所述的一种草地贪夜蛾产卵忌避信息素的应用，其特征在于，将含有上述化合物的信息素喷洒在植物植株上，待植物叶上的液体自然风干，以影响草地贪夜蛾的产卵产所，以及抑制产卵。

技术总结
本发明涉及忌避信息素技术领域，具体是一种草地贪夜蛾产卵忌避信息素，信息素合成物包括邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸、十六碳烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸，其质量浓度依次为1.8mg/L-2.2mg/L、32mg/L-36mg/L、0.6mg/L-1.2mg/L、23mg/L-29mg/L、28mg/L-32mg/L、86mg/L-94mg/L、45mg/L-52mg/L。本发明提出的忌避信息素，对该害虫寻找寄主、定位产卵等行为活动均会产生影响，对田间害虫综合防控具有积极作用；经过实验验证，对草地贪夜蛾具有较好的产卵趋避及产卵抑制作用且防效稳定，可减缓草地贪夜蛾对药剂的抗药性。贪夜蛾对药剂的抗药性。贪夜蛾对药剂的抗药性。


技术研发人员：胡黎明 申建梅 张金玟 何沐阳 曾秋妹 梁康源
受保护的技术使用者：仲恺农业工程学院
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/16