一种提高细胞外囊泡产量、治疗活性的生产方法与流程

1.本发明属于生物医学工程领域，涉及一种提高细胞外囊泡产量、治疗活性的生产方法。


背景技术：

2.细胞外囊泡(extracellularvesicles，evs)是一种由细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡，其稳定携带了细胞上一些重要的成分，有望在多种疾病的早期诊断和治疗中发挥作用。现有的提高细胞外囊泡产量的方法包括提高细胞与培养基或培养皿的接触面积的方法和改变细胞培养条件的方法，其中，改变细胞培养条件的手段包括施加机械刺激、改变细胞环境酸碱度、升高细胞间离子霉素和钙离子含量等手段，但这些手段对于细胞完整性、细胞活性等有较为明显的影响，并且有可能削弱细胞外囊泡的治疗潜力。


技术实现要素：

3.为了解决以上技术问题，本发明提供了一种提高细胞外囊泡产量、治疗活性的生产方法，该方法同时促进干细胞增殖和促进干细胞分泌细胞外囊泡，从而提高细胞外囊泡的产量；并且，增产的细胞外囊泡具有增强的组织损伤治疗功能。
4.本发明提供的技术方案具体如下：
5.第一方面，本发明提供一种细胞外囊泡的生产方法，包括以下步骤：将能产生目标细胞外囊泡的细胞置于含表皮生长因子(egf)、肿瘤坏死因子(tnf-α)的细胞培养基中培养，提供低氧刺激条件，收集细胞培养上清，获得目标细胞外囊泡。
6.在本发明的一些实施方式中，能产生目标细胞外囊泡的细胞为干细胞、肿瘤细胞、纤维细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(nk细胞)、树突状细胞(dc细胞)、t细胞中的至少一种。
7.在本发明的一些实施方式中，培养基中egf含量为10ng/ml，tnf-α含量为50ng/ml。
8.在本发明的一些实施方式中，提供低氧刺激条件包括：将细胞培养基置于低氧培养箱内，设置氧含量＜5％。
9.第二方面，本发明提供一种用于促进干细胞分泌细胞外囊泡的组合物，包含egf、tnf-α和诱导细胞缺氧的组分。
10.第三方面，本发明提供一种用于生产细胞外囊泡的培养基，该培养基包含egf、tnf-α和诱导细胞缺氧的组分。
11.第四方面，本发明提供一种试剂盒，包含上述用于生产细胞外囊泡的培养基。
12.第五方面，本发明提供一种用于生产细胞外囊泡的系统，包括：
13.培养基模块，其包含egf和tnf-α；
14.低氧控制系统，其用于提供细胞低氧刺激环境。
15.第六方面，本发明提供上述用于促进干细胞分泌细胞外囊泡的组合物、上述用于生产细胞外囊泡的培养基、上述试剂盒、上述用于生产细胞外囊泡的系统在生产细胞外囊泡中的用途。
16.本发明具有以下优点和有益效果：
17.本发明采用egf、tnf-α、诱导细胞缺氧的三重刺激能够通过同时促进干细胞增殖和促进干细胞分泌细胞外囊泡，从而提高细胞外囊泡的产量；并且，增产的细胞外囊泡具有增强的组织损伤治疗功能。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1显示egf、tnf-α和1％o2组合刺激显著促进单个干细胞的细胞外囊泡产量；
20.图2显示egf、tnf-α和1％o2组合刺激显著促进干细胞增殖；
21.图3显示egf、tnf-α和1％o2组合刺激显著促进干细胞来源细胞外囊泡的组织损伤治疗潜能；(a)使用pbs(pbs组)、对照细胞外囊泡(对照囊泡组)、增产的细胞外囊泡(增产囊泡组)处理小鼠伤口后第4天的伤口代表性图像；(b)对照囊泡组、增产囊泡组相对pbs组的第4天伤口面积统计分析图。
具体实施方式
22.下面结合实施例对本发明进一步描述，该描述只是为了更好地说明本发明的技术方案而不是对权利要求进行限制。本发明并不限于这里所描述的特殊实施例和实施方案。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，都落入本发明的保护范围。
23.本发明主要针对的供体细胞为干细胞，由于其特殊性，在其他细胞中报道能提升细胞外囊泡产量的方法未必适用于干细胞。
24.本发明提供的细胞外囊泡的生产方法，包括以下步骤：将能产生目标细胞外囊泡的细胞置于含表皮生长因子(egf)、肿瘤坏死因子(tnf-α)的细胞培养基中培养，提供低氧刺激条件，收集细胞培养上清，获得目标细胞外囊泡。
25.现有技术中，能产生目标细胞外囊泡的细胞为干细胞、肿瘤细胞、纤维细胞、巨噬细胞、nk细胞、dc细胞、t细胞等细胞。本发明采用干细胞来获取细胞外囊泡，由于6代后活性下降，本发明采用的干细胞优选为3-6代干细胞。
26.在本发明的一些实施方式中，培养基中egf含量为10-25ng/ml，tnf-α含量为50-100ng/ml。优选的，培养基中egf含量为10ng/ml，tnf-α含量为50ng/ml。
27.在本发明的一些实施方式中，提供低氧刺激条件包括：将细胞培养基置于低氧培养箱内，设置氧含量1％-12％，更优选为1％(v/v)。
28.第二方面，本发明提供一种用于促进干细胞分泌细胞外囊泡的组合物，包含egf、tnf-α和诱导细胞缺氧的组分。
29.第三方面，本发明提供一种用于生产细胞外囊泡的培养基，该培养基包含egf、tnf-α和诱导细胞缺氧的组分。
30.第四方面，本发明提供一种试剂盒，包含上述用于生产细胞外囊泡的培养基。
31.第五方面，本发明提供一种用于生产细胞外囊泡的系统，包括：
32.培养基模块，其包含egf和tnf-α；
33.低氧控制系统，其用于提供细胞低氧刺激环境。
34.第六方面，本发明提供上述用于促进干细胞分泌细胞外囊泡的组合物、上述用于生产细胞外囊泡的培养基、上述试剂盒、上述用于生产细胞外囊泡的系统在生产细胞外囊泡中的用途。
35.下面以干细胞为例，详细阐述本发明提供的生产方法，以下实施例和对比例中，通过将培养皿置于低氧培养箱中，提供1％o2刺激条件：
36.实施例1
37.(1)10ng/mlegf+50ng/mltnf-α+1％o2刺激干细胞
38.将1.5
×
106个3-6代干细胞种于15cm培养皿内，使用含10％胎牛血清的α-mem培养基以5％co2、37℃和21％o2条件培养24小时。接着，以10ng/mlegf、50ng/mltnf-α和1％o2刺激干细胞24小时后，换成含有10％free血清(去除了细胞外囊泡的血清)的α-mem培养基培养48小时后收集上清，用于下一步细胞外囊泡的分离纯化。同时，使用0.25％的胰蛋白酶将培养皿中的细胞消化下来，1200rcf离心收集细胞沉淀，1mlpbs重悬后，使用细胞计数仪检测细胞浓度，并计算细胞数量。
39.(2)细胞外囊泡的分离纯化
40.收集的上清以3000g转速离心20分钟用于去除细胞沉淀，取上清，重复一次上述步骤。使用超速离心机以120000g转速离心70分钟后，使用2-4ml市售pbs重悬细胞外囊泡沉淀，再使用超速离心机以120000g转速离心70分钟，最终使用50-100μl市售pbs重悬并保存细胞外囊泡，获得细胞外囊泡原液；取少量细胞外囊泡原液用于后续浓度检测，剩余细胞外囊泡原液于-80℃保存。
41.(3)细胞外囊泡浓度检测
42.使用3-4ml市售pbs稀释分离纯化的细胞外囊泡原液(约40000-80000倍)，纳米颗粒跟踪分析仪(nta)用于测量细胞外囊泡浓度。根据nta检测的细胞外囊泡浓度和步骤(1)中检测的细胞数量计算单个细胞分泌的细胞外囊泡产量。
43.(4)干细胞的细胞增殖情况检测
44.将5
×
104个3-6代干细胞种于6孔板内，待细胞生长24小时后，换液，并以10ng/mlegf、50ng/mltnf-α和1％o2刺激干细胞24小时。接着，用不含刺激因素的培养基培养干细胞48小时后，使用0.25％的胰蛋白酶将培养皿中的细胞消化下来，1200rcf离心收集细胞沉淀，1mlpbs重悬后，使用细胞计数仪检测细胞浓度，并计算细胞数量。(5)增产的细胞外囊泡的损伤治疗效果检测
45.根据(1)、(2)所述步骤分离使用10ng/mlegf、50ng/mltnf-α和1％o2刺激干细胞后增产的细胞外囊泡。构建1cm小鼠背腹侧伤口模型，将1
×
10
11
个增产的细胞外囊泡和等体积的pbs分别沿着伤口周围进行皮下多点注射，拍摄增产细胞外囊泡处理组和pbs处理组小鼠第四天的皮肤伤口图片，并测量伤口的面积。
46.对比例1：对照细胞外囊泡的制备
47.(1)正常培养干细胞
48.将1.5
×
106个3-6代干细胞种于15cm培养皿内，使用含10％胎牛血清的α-mem培养
基以5％co2、37℃和21％o2条件培养24小时。接着，换成含有10％free血清(去除了细胞外囊泡的血清)的α-mem培养基培养48小时后收集上清，用于下一步细胞外囊泡的分离纯化。同时，使用0.25％的胰蛋白酶将培养皿中的细胞消化下来，1200rcf离心收集细胞沉淀，1mlpbs重悬后，使用细胞计数仪检测细胞浓度，并计算细胞数量。
49.(2)细胞外囊泡的分离纯化
50.收集的上清以3000g转速离心20分钟用于去除细胞沉淀，取上清，重复一次上述步骤。使用超速离心机以120000g转速离心70分钟后，使用2-4ml市售pbs重悬细胞外囊泡沉淀，再使用超速离心机以120000g转速离心70分钟，最终使用50-100μl市售pbs重悬并保存细胞外囊泡，获得细胞外囊泡原液；取少量细胞外囊泡原液用于后续浓度检测，剩余细胞外囊泡原液于-80℃保存。
51.(3)细胞外囊泡浓度检测
52.使用3-4ml市售pbs稀释分离纯化的细胞外囊泡原液(约40000-80000倍)，纳米颗粒跟踪分析仪(nta)用于测量细胞外囊泡浓度。根据nta检测的细胞外囊泡浓度和步骤(1)中检测的细胞数量计算单个细胞分泌的细胞外囊泡产量。
53.(4)干细胞的细胞增殖情况检测
54.将5
×
104个3-6代干细胞种于6孔板内，待细胞生长24小时后，换液培养24小时后(此步骤对应实施例1的步骤(4)的24小时刺激)，再次换液培养48小时。接着，使用0.25％的胰蛋白酶将培养皿中的细胞消化下来，1200rcf离心收集细胞沉淀，1mlpbs重悬后，使用细胞计数仪检测细胞浓度，并计算细胞数量。
55.(5)对照细胞外囊泡的损伤治疗效果检测
56.将正常收集的干细胞培养上清通过超速离心分离获得对照细胞外囊泡。构建1cm小鼠背腹侧伤口模型，将1
×
10
11
个对照细胞外囊泡和等体积的pbs分别沿着伤口周围进行多点皮下注射，观察对照细胞外囊泡处理组和pbs处理组小鼠第四天皮肤伤口的大小。
57.如图1所示，egf、tnf-α和1％o2三因素同时刺激干细胞，显著提升了单个细胞分泌细胞外囊泡的产量。
58.如图2所示，egf、tnf-α和1％o2三因素同时刺激干细胞能够促进干细胞的增殖，从另一层面上促进细胞外囊泡的产量。
59.如图3所示，通过egf、tnf-α和1％o2三因素组合刺激干细胞获得的增产的细胞外囊泡相比对照细胞外囊泡和pbs具有显著的组织损伤治疗效果。
60.除非另外说明，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管可在本发明的实践或测试中使用本文描述的那些类似或相当的任何方法，但本文将描述优选的方法。
61.以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种细胞外囊泡的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：将能产生目标细胞外囊泡的细胞置于含表皮生长因子、肿瘤坏死因子的细胞培养基中培养，提供低氧刺激条件，收集细胞培养上清，获得目标细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的生产方法，其特征在于：所述细胞为干细胞、肿瘤细胞、纤维细胞、巨噬细胞、nk细胞、dc细胞、t细胞中的至少一种。3.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的生产方法，其特征在于：培养基中含表皮生长因子含量为10-25ng/ml，肿瘤坏死因子含量为50-100ng/ml。4.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的生产方法，其特征在于：所述提供低氧刺激条件包括：向细胞培养基内加入诱导细胞缺氧的组分。5.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的生产方法，其特征在于：所述提供低氧刺激条件包括：将细胞培养基置于低氧培养箱内，设置氧含量＜5％。6.一种用于促进干细胞分泌细胞外囊泡的组合物，其特征在于，包含表皮生长因子、肿瘤坏死因子和诱导细胞缺氧的组分。7.一种用于生产细胞外囊泡的培养基，其特征在于，包含表皮生长因子、肿瘤坏死因子和诱导细胞缺氧的组分。8.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求7所述的用于生产细胞外囊泡的培养基。9.一种用于生产细胞外囊泡的系统，其特征在于，包括：培养基模块，其包含表皮生长因子和肿瘤坏死因子；低氧控制系统，其用于提供细胞低氧刺激环境。10.权利要求6所述的用于促进干细胞分泌细胞外囊泡的组合物、权利要求7所述的用于生产细胞外囊泡的培养基、权利要求8所述的试剂盒、权利要求9所述的用于生产细胞外囊泡的系统在生产细胞外囊泡中的用途。

技术总结
本发明公开了一种提高细胞外囊泡产量、治疗活性的生产方法，该生产方法包括以下步骤：将能产生目标细胞外囊泡的细胞置于含表皮生长因子(EGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的细胞培养基中培养，提供低氧刺激条件，收集细胞培养上清，获得目标细胞外囊泡。本发明采用EGF、TNF-α和诱导细胞缺氧的三重刺激，能够通过同时促进干细胞增殖和促进干细胞分泌细胞外囊泡，从而提高细胞外囊泡的产量；并且，增产的细胞外囊泡具有增强的组织损伤治疗功能。胞外囊泡具有增强的组织损伤治疗功能。胞外囊泡具有增强的组织损伤治疗功能。


技术研发人员：陈刚 李晔 陈吟雪 吴敏 夏厚福 余自力
受保护的技术使用者：珈泌生物科技（武汉）有限责任公司
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/9/14