一种蜂源改造体抗菌肽AC-7及其制备和应用

一种蜂源改造体抗菌肽ac-7及其制备和应用
技术领域
1.本发明涉及一种蜂源改造体抗菌肽ac-7及其制备和应用，属于生物医学技术领域。


背景技术：

2.近年来，由于饲料抗生素在畜禽养殖业中的不合理、不规范使用引起了其在畜禽类产品的残留、环境污染、更为严重的是一些超级耐药细菌的产生。近年来耐药菌株的产生严重限制了畜牧业的可持续发展并对人类公共卫生安全造成了很大的困扰，因此寻求理想的抗生素替代品是十分迫切与必要的。
3.抗菌肽具有强大的生理功能，其不仅对细菌生长和繁殖具有抑制和杀灭功能，还能够抗真菌、杀死肿瘤细胞、抗病毒、杀灭寄生虫等作用。例如来源于人类唾液的组蛋白可以抗真菌、蛙源抗菌肽abaecin对于水产养殖中常见的nnv、vhsv、ipnv、svcv这几种病毒具有很好的抑制活性、dermaseptin的一种衍生物对在红细胞内寄生的恶性疟原虫具有杀灭作用，另外在dermaseptin家族中，ds-01肽段可有效杀灭枯氏锥虫。
4.当然天然抗菌肽也存在一定的不足，那就是天然抗菌肽的抑菌活性不够强烈、不稳定、具有一定的毒性。在获得一定的理论基础后，人们开始对抗菌肽进行改造，以期提高其抑菌效果、增强稳定性、降低细胞毒性获得具有优良特性的抗菌肽。例如在早前就有研究将天蚕素、蜂毒素进行杂合，设计出的新杂合肽不仅仅提高了抗菌肽的抑菌活性，还具有杀灭寄生虫的能力。周长林教授等人通过对蛇肽cathelicidin-bf(bf-30)进行改造获得的bf-16对ndm-1细菌(ndm-1是一种主要存在于大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的遗传物质，可以使细菌获得极强的抗药性。ndm-1细菌对碳青霉烯抗生素也具有耐药性，而碳青霉烯类抗生素通常被认为是紧急治疗抗药性病症的最后方法)具有很好的抑菌效果，可作为解决超级耐药菌的候选药物。基于现有的理论知识，人们往往通过以下几种指标对抗菌肽进行改造：净电荷、疏水性、两亲性、螺旋性等。
5.抗菌肽的作用机理主要是以抗菌肽与细胞膜之间的相互作用为基础的，净电荷主要影响的是这两者之间的静电相互作用以及抗菌肽的选择性。我们知道细菌的细胞膜中的质膜层大多是磷脂酰甘油(pg)、心磷脂(cl)、磷脂酰丝氨酸(ps)等带负电的物质，革兰氏阳性菌的肽聚糖层还带有负电的脂多糖。这些带负电的物质就有利于能够维持抗菌肽与细菌细胞膜之间的静电相互作用。而哺乳动物细胞膜组成主要是电中性的磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、鞘磷脂(sm)。其膜表面上含有能够保持磷脂双分子层稳定的的胆固醇。这也是抗菌肽选择性的基础。但是并不是抗菌肽表面所带的正电荷越多，对细菌的抑制作用就越强。其存在一定的阈值，超过阈值时，抑菌活性将降低。有研究表明，对于含有10～20个氨基酸残基的短肽来说，阳离子＞+6时，抗菌活性就不随着阳离子的增加而增强。
6.疏水性对于细胞的选择性影响也比较大，在现在所认为的抗菌肽抑菌机理中，抗菌肽的疏水面与细胞膜磷脂双分子层疏水部分的疏水相互作用扮演着重要的角色。在一定的范围内疏水相互作用增加，其抗菌活性也会增加，但是两者之间并不是简单的线性关系。
若疏水性过大，抗菌肽自身发生聚集，以沉淀的形式析出，抗菌活性降低且溶血性增强。若疏水性降低，则抗菌肽的疏水面与细胞膜的疏水部分作用力降低，活性下降。
7.两亲性在抗菌肽与细胞膜的绑定过程中发挥着重要的作用，使细胞具有较好的选择性。对于抗菌肽活性而言，疏水区域与亲水区域的相对含量是疏水性、两亲性、螺旋性这三者中最为重要的。
8.抗菌肽的螺旋性虽然对抗菌活性影响较小，但其对抗菌肽毒性的影响较大。有研究表明，用d—型氨基酸替代l—型氨基酸对抗菌肽螺旋性进行改造，结果发现抗菌肽活性不变且溶血性下降，可认为这是一种有效降低抗菌肽毒性的方法。还有一个对于螺旋性影响较大的因素就是氨基酸的螺旋倾向性，通常认为脯氨酸、甘氨酸具有较低的螺旋倾向性，尤其是脯氨酸可毁坏α-螺旋结构，有研究认为，随着肽链长度的增加，脯氨酸的含量增加，不利于α螺旋结构的产生。在设计螺旋型抗菌肽氨基酸序列时，通常不对两种氨基酸加以考虑。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种蜂源改造体抗菌肽ac-7及其制备和应用。
10.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种蜂源改造体抗菌肽ac-7，其氨基酸序列为：leu-leu-arg-arg-trp-lys-lys-leu-phe-lys-lys-ile-ile-arg-trp-pro-arg-pro-leu-pro-asn-pro-gly-his-nh2。
11.进一步的，上述蜂源改造体抗菌肽ac-7是根据抗菌肽abaecin的氨基酸序列经过改造获得的，抗菌肽abaecin的氨基酸序列为：phe-val-pro-tyr-asn-pro-pro-arg-pro-gln-gln-ser-lys-pro-phe-pro-ser-phe-pro-gly-his-gln-pro-phe-asn-pro-lys-ile-gln-trp-pro-tyr-pro-leu-pro-asn-pro-gly-his-nh2。
12.进一步的，上述蜂源改造体抗菌肽ac-7的净电荷数为+8。
13.上述一种蜂源改造体抗菌肽ac-7在制备广谱抗菌药物中的应用。
14.一种由上述蜂源改造体抗菌肽ac-7制备得到的广谱抗菌药物。
15.本发明的优点在于：本发明以蜂源抗菌肽abaecin为模板，根据现有的理论知识对其进行改造，通过减少肽序列长度、提高蜂源抗菌肽的两亲性、电荷(由+3升至+8)、螺旋性这些方面的改造修饰来提高抗菌肽的抑菌活性，设计出一条全新的α螺旋结构抗菌肽ac-7。经圆二色谱测定，抗菌肽ac-7在205～220nm处有吸收峰，在tfe溶液中形成α螺旋结构。
附图说明
16.图1：abaecin与ac-7的螺旋图及三维结构图。a，abaecin的螺旋结构图；b，ac-7的螺旋结构图；c，abaecin的模拟三维结构图；d，ac-7的模拟三维结构图。
17.图2：抗菌肽abaecin与ac-7的高效液相色谱图。
18.图3：抗菌肽abaecin与ac-7的液相色谱质谱联用图。
19.图4：抗菌肽abaecin与ac-7在不同溶液中的圆二色谱图。
20.图5：抗菌肽abaecin与ac-7的细胞毒性。
21.具体实施案例为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
22.实施例1：abaecin是一种蜂源天然免疫抗菌肽，其氨基酸序列为：fvpynpprpqqskpfpsfpghqpfnpkiqwpyplpnpgh-nh2。蜂源抗菌肽abaecin序列中带电荷氨基酸较少，总的电荷量为+3，两亲性不明显，其在发挥抗菌作用时穿过细胞膜，而不对膜产生破坏。蜂源抗菌肽abaecin进入细胞内部后与影响蛋白质折叠的dnak以及核糖体生物功能的hsp70结合，最终影响细菌的正常生理代谢、细菌生物功能紊乱，间接导致细菌细胞膜通透性升高，引发细菌的死亡，以此发挥抑菌效果。
23.本发明的设计思路是希望通过结合两种不同抑菌机制的肽序列增强抗菌活性，接着再对其进行氨基酸替换改造，获得理论上效果更好的抗菌肽序列，具体如下：1)截取蜂源抗菌肽abaecin的c端的12个氨基酸，得到序列1(iqwpyplpnpgh-nh2)；2)在序列1的n端加上α螺旋序列llrr，并将穿膜肽cecropin a的1～8位氨基酸序列wkklfkki接在α螺旋序列llrr和序列1之间，得到序列2(llrrwkklfkkiiqwpyplpnpgh-nh2)；3)将序列2的第14位的谷氨酰胺(q)和第17位的酪氨酸(y)替换成精氨酸(r)，得到抗菌肽ac-7序列(llrrwkklfkkiirwprplpnpgh-nh2)。
24.蜂源抗菌肽abaecin和抗菌肽ac-7的理化性质预测结果如表1所示，抗菌肽ac-7相较原肽abaecin电荷量有很大的提升(由+3升至+8)、肽链长度缩短(39至24)、两亲性提升(0.054至0.688)。
25.表1抗菌肽ac-7与abaecin理化性质预测注：a净电荷；b分子量(mw)；c疏水性(h)；d疏水力矩(μhrel)；e等电点。
26.实施例2：抗菌肽ac-7交由上海吉尔生化公司通过fmoc固相合成法进行合成，通过反式高效液相色谱(rp-hplc)确定抗菌肽ac-7的纯度(》95％)，并通过电喷射质谱进一步对其氨基酸序列进行鉴定，氨基酸序列预测结果与抗菌肽ac-7的设计序列一致。蜂源抗菌肽abaecin和抗菌肽ac-7的高效液相色谱图见图2，液相色谱质谱联用图见图3。
27.实施例3：采用圆二色谱法测定多肽的二级结构。
28.抗菌肽ac-7溶解于无菌水，样品与三氟乙醇以1：1的体积比混匀，使得混合液中抗菌肽ac-7终浓度为128μg/ml、三氟乙醇终浓度为50％。采用j-1500spectropolarimeter(jasco,tokyo,japan)测定抗菌肽ac-7的圆二色光谱。设置扫描波长λ＝190～250nm，光径0.1cm,温度25℃，频率50nm/min。测量3次平行。结果如图4所示，原肽abaecin在无论在无菌
水中还是三氟乙醇溶液中都呈现的是无规则卷曲结构；抗菌肽ac-7在tfe溶液中为α螺旋结构，其相较于原肽增加了α-螺旋结构，这对其发挥抑菌活性具有很大的影响。
29.实施例4：抗菌肽ac-7抗菌活性检测。
30.采用2倍稀释法测定最小抑菌浓度：选择大肠埃希氏菌atcc 8739、大肠希氏菌atcc25922、大肠埃希氏菌atcc 8099、大肠埃希氏菌cmcc 44102、鼠伤寒沙门菌cicc21483、福氏志贺菌cmcc 51571、副溶血性弧菌atcc 17802、荧光假单胞菌cicc 21620、荧光假单胞菌atcc 13525、铜绿单胞atcc27853、阪崎克罗诺肠杆菌atcc 29544、乙型副伤寒沙门菌cmcc 50094、甲型副伤寒沙门菌cmcc 50093、肠道出血性大肠埃希氏菌o157 cicc21530、金黄色葡萄球菌atcc6538、金黄色葡萄球菌atcc29213、金黄色葡萄球菌atcc12600、金黄色葡萄球菌atcc2592、耐甲氧西林金黄色萄球菌43300、蜡样芽胞杆菌cmcc63301这20株菌进行mic测定实验。首先将冻存管中保存的菌种进行活化，在37℃、转速为180r/min的摇床中过夜培养；次日早上进行转接培养，在摇床中37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜mhb液体培养基将培养至对数生长期的菌株培养液稀释到1
×
105cfu/ml待用。
31.用二倍稀释法进行稀释；抗菌肽ac-7浓度依次为128、64、32、16、8、4、2μg/ml。以培养基作为空白对照，菌液作为阳性对照。最后将96孔板放置于培养箱中37℃过夜培养12小时，测定mic值。结果如表2和表3所示。
32.由表2～3可见，抗菌肽ac-7表现出极强的抗菌活，对于绝大多数革兰氏阴性菌效果稳定且有效、mic为2～4μg/ml，对于革兰氏阳性菌的抑制效果较弱、mic值为4～16μg/ml；原肽abaecin对革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌的mics均》128μg/ml，表明抗菌肽ac-7的抑菌活性较原肽abaecin极大提高。
33.表2抗菌肽ac-7与abaecin对革兰氏阴性菌的抑菌活性
表3抗菌肽ac-7与abaecin对革兰氏阳性菌的抑菌活性实施例5：采用mtt法测定抗菌肽ac-7细胞毒性。
34.铺板：将对数期小鼠巨噬细胞raw细胞用pbs缓冲液(0.01m，ph7.2)冲洗、离心收集
(2000r/min，3min)；移除pbs缓冲液(0.01m，ph7.2)后加入细胞培养基制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至1
×
105个/ml。吸取100μl至96孔板中，放入培养箱培养24h。
35.加样：把前一天铺好的96孔板从培养箱中取出，吸出培养基，加入新的培养基90μl。将抗菌肽ac-7用pbs稀释，最终样品浓度为128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml，每孔加入10μl，每个浓度设置5组平行。最后1列为100μl的pbs缓冲液(0.01m，ph7.2)作为空白对照。接着将96孔板放入培养箱中继续培养24h。
36.加入mtt：在96孔板的每个孔洞中避光加入10μl的mtt(5mg/ml)，放入培养箱培养4h。
37.终止培养，溶解结晶：将孔板中的培养基吸出，并加入150μl二甲基亚砜，在金属浴中以37℃、600r/min孵育10分钟。使结晶物充分溶解。最后在酶联免疫检测仪od
570
nm处测量各孔的吸光值。
38.结果如图5所示，原肽abaecin对小鼠巨噬细胞raw 264.7未见毒性；ac-7使用浓度为64μg/ml时，细胞存活率可达100％，当浓度升高至128μg/ml时，细胞存活率略有下降，保持在80.44％。

技术特征：
1.一种蜂源改造体抗菌肽ac-7，其特征在于：其氨基酸序列为： leu-leu-arg-arg-trp-lys-lys-leu-phe-lys-lys-ile-ile-arg-trp-pro-arg-pro-leu-pro-asn-pro-gly-his-nh2。2.根据权利要求1所述的一种蜂源改造体抗菌肽ac-7，其特征在于：所述蜂源改造体抗菌肽ac-7是根据抗菌肽abaecin的氨基酸序列经过改造获得的，所述抗菌肽abaecin的氨基酸序列为：phe-val-pro-tyr-asn-pro-pro-arg-pro-gln-gln-ser-lys-pro-phe-pro-ser-phe-pro-gly-his-gln-pro-phe-asn-pro-lys-ile-gln-trp-pro-tyr-pro-leu-pro-asn-pro-gly-his-nh2。3.根据权利要求1所述的一种蜂源改造体抗菌肽ac-7，其特征在于：所述蜂源改造体抗菌肽ac-7的净电荷数为+8。4.如权利要求1所述的蜂源改造体抗菌肽ac-7在制备广谱抗菌药物中的应用。5.一种由权利要求1所述蜂源改造体抗菌肽ac-7制备得到的广谱抗菌药物。

技术总结
本发明公开了一种蜂源改造体抗菌肽AC-7及其制备和应用。所述蜂源改造体抗菌肽AC-7是根据抗菌肽Abaecin的氨基酸序列经过改造获得的。相较于抗菌肽Abaecin，抗菌肽AC-7具有较高的两亲性且带有较多的电荷量。抑菌实验表明，抗菌肽AC-7具有强效广谱的抑菌效果，对革兰氏阴性菌的抑制效果稳定且有效MIC为2~4μg/mL，革兰氏阳性菌MIC值为4~16μg/mL。革兰氏阳性菌MIC值为4~16μg/mL。


技术研发人员：韩金志 杨捷 倪莉 吕旭聪 武培汾 陈舜娴 林雅艺 翁燕琳 陈治颖 于丰凡
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：2023.07.22
技术公布日：2023/9/16