一种硝酸盐还原假单胞菌ZKJ及其在降解有机污染物中的应用

一种硝酸盐还原假单胞菌zkj及其在降解有机污染物中的应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种硝酸盐还原假单胞菌(pseudomonas nitritireducens)zkj及其在降解乙酸芳樟酯等有机污染物中的应用。
(二)

背景技术：

2.乙酸芳樟酯是一种有机化合物，存在于天然香柠檬、熏衣草、香丹参及基他多各精油中。此外，也存在于可可子、芹菜、葡萄、桃、海带中。由芳樟醇加入乙酐和磷酸的混合物中(磷酸与乙酐形成复合体催化剂)，在较低温度下进行酯化反应则得。酯化反应后，用水洗涤，再用盐水洗涤至中性，加无水碳酸钠干燥后进行减压分馏，所得产品含酯最高(≥95％)，香气也较纯正。也可将芳樟醇加到经溶剂稀释的乙酐和无水乙酸钠中进行酯化反应，再经过分馏取得。其是有令人愉快的花香和果香的无色透明液体。其具有挥发性，微溶于水，不溶于甘油，微溶于水，溶于乙醇、丙二醇、乙醚、邻苯二甲酸二乙酯、苯甲酸苄酯、非挥发性油和矿物油香料。其化学性质稳定，不变色，常用于中高档香制品及皂用香精中。
3.乙酸芳樟酯虽属低毒类，但由于其具有挥发性，因此对人体仍然具有危害性。急性接触高浓度的乙酸芳樟酯可出现皮肤过敏、眼睛发炎、呼吸道发炎等症状。
4.因此研究环境中乙酸芳樟酯的高效降解对人类健康很有必要，通过文献检索，未发现有关假单胞菌以乙酸芳樟酯为唯一碳源来实现高效降解的报道。
(三)

技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种硝酸盐还原假单胞菌zkj及其在降解有机污染物中的应用，所述硝酸盐还原假单胞菌zkj能以乙酸芳樟酯等芳樟酯类污染物为唯一碳源实现降解，特别具有高效、较强的乙酸芳樟酯降解能力，并且生长环境温和，易扩大培养。该降解菌的发现对于工业废水废气中芳樟酯类污染物的高效净化具有重要意义。
6.本发明采用的技术方案是：
7.本发明提供一种新的乙酸芳樟酯降解菌——硝酸盐还原假单胞菌(pseudomonas nitritireducens)zkj，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m2023672，保藏日期：2023年05月04日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
8.本发明硝酸盐还原假单胞菌zkj的基本特征为：菌落呈淡黄色，表面光滑，无鞭毛。边缘较规则，不透光，较易挑取，菌苔基本沿划线生长，菌落四周均匀分布一层晕；好氧，革兰氏染色阴性。
9.本发明还提供一种所述硝酸盐还原假单胞菌zkj在降解有机污染物中的应用，具体所述的应用是将硝酸盐还原假单胞菌zkj经扩大培养获得的菌液或静息细胞加入ph＝4-9、含有机污染物的无机培养液中，在15-30℃、100-200rpm条件下进行培养，实现有机污染物的降解。
10.进一步，所述有机污染物包括乙酸芳樟酯、甲苯。
11.进一步，所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为54-270mg/l，优选108mg/l。
12.进一步，所述硝酸盐还原假单胞菌zkj静息细胞以干重计加入量为20-80mg/l，优选50mg/l；以菌液的od
600
计为0.01-0.05，优选0.02。
13.进一步，培养条件为15℃、160rpm。
14.进一步，所述无机盐培养液组成为：k2hpo4·
3h2o 0.942g/l、kh2po40.234 g/l、nano
3 1.7g/l、nh4cl 0.98g/l、mgcl2·
6h2o 0.2033g/l、cacl2·
2h2o 0.011g/l、fecl30.0162g/l，微量元素母液5ml/l，溶剂为去离子水，ph 7.0；其中微量元素母液组成：cuso4·
5h2o 0.02g/l、feso4·
7h2o 1.0g/l、mnso4·
4h2o 0.1g/l、namoo4·
2h2o 0.02g/l、cocl2·
6h2o 0.02g/l、h3bo
3 0.014g/l、znso4·
7h2o 0.10g/l，溶剂为去离子水。
15.进一步，所述硝酸盐还原假单胞菌zkj的静息细胞按如下步骤制备：
16.(1)斜面培养：
17.将硝酸盐还原假单胞菌zkj接种于斜面lb固体培养基，30℃培养24～36h，获得斜面菌体，所述lb固体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，琼脂18～20g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
18.(2)扩大培养：
19.用接种环挑取步骤(1)获得的斜面菌体接种至lb液体培养基中，15℃，160rpm培养24～36h，获得od600＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得假单胞菌zkj静息细胞；所述lb液体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
20.与现有技术相比，本发明有益效果体现在：
21.本发明提供的硝酸盐还原假单胞菌zkj取自污水厂污泥，对于芳樟酯类污染物具有高效的降解效果，可以较为完全地把污染物转化为co2、h2o等无害物质因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。
22.本发明所述的硝酸盐还原假单胞菌zkj能将乙酸芳樟酯完全降解为无机物(co2、h2o)和细胞生物质，实现完全矿化，且对于216mg/l以内的乙酸芳樟酯的去除率高于95％。
(四)附图说明
23.图1为菌株zkj在lb培养基上菌落形态照片。
24.图2为菌株zkj的透射电子显微镜照片。
25.图3为菌株zkj的系统发育树图。
26.图4为菌株zkj对于不同浓度乙酸芳樟酯的降解曲线。
27.图5为菌株zkj在不同ph下对于108mg/l的乙酸芳樟酯的降解率。
28.图6为菌株zkj在22h时不同ph下对于108mg/l的乙酸芳樟酯的降解率。
(五)具体实施方式
29.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
30.下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
31.所述无机盐培养液组成为：k2hpo4·
3h2o 0.942g/l、kh2po
4 0.234g/l、nano31.7g/l、nh4cl 0.98g/l、mgcl2·
6h2o 0.2033g/l、cacl2·
2h2o 0.011g/l、fecl
3 0.0162g/l，微量元素母液5ml/l，溶剂为去离子水，ph 7.0；其中微量元素母液组成：cuso4·
5h2o 0.02g/l、feso4·
7h2o 1.0g/l、mnso4·
4h2o 0.1g/l、namoo4·
2h2o 0.02g/l、cocl2·
6h2o 0.02g/l、h3bo
3 0.014g/l、znso4·
7h2o 0.10g/l，溶剂为去离子水。
32.所述lb固体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，琼脂18～20g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
33.所述lb液体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
34.实施例1：菌株zkj的分离、纯化及其鉴定。
35.1、菌株zkj的分离及纯化。
36.菌株zkj是从采集自某城市污水处理厂的活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阴性菌，具体步骤如下：
37.在300ml摇瓶中加入50ml无机盐培养液，并加入10ml活性污泥和54mg/l的乙酸芳樟酯，摇瓶密封，15℃、160rpm进行富集培养，采用实施例3方法检测乙酸芳樟酯浓度，待乙酸芳樟酯浓度为初始的50％时，从中取出5ml富集液于50ml新鲜无机盐培养液中，加入相同量的乙酸芳樟酯(54mg/l)，重复上述富集过程5次后，将最后一次富集液无菌水梯度稀释至10-6
，涂布lb固体培养基，15℃培养1-2天，选择单菌落再次接种至lb固体培养基进行分离平板画线纯化，将得到的备选菌接种至以54mg/l乙酸芳樟酯作为唯一的碳源及能源的无机盐培养液，15℃培养2天，采用实施例3方法检测乙酸芳樟酯浓度，选择乙酸芳樟酯降解率最高的培养液对应的备选菌，记为菌株zkj。
38.2、菌株zkj的鉴定
39.(1)菌株zkj特征：将菌株zkj接种至lb固体培养基，15℃培养1天，菌落照片见图1，菌落呈淡黄色、圆盘状；边缘整齐，不透光，易挑取。透射电镜(图2)下观察该菌体的形态为椭圆杆菌，无鞭毛，大小为4600
×
3500nm，革兰氏染色阴性。
40.(2)16s rrna序列分析
41.采用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取和纯化菌株zkj的dna，4℃保存。用细菌的通用引物对纯化的dna进行pcr扩增，引物分别为27f(agagtttgatcctggctcag)和1492r(ggttaccttgttacgactt)，pcr反应程序设定为94℃预变性4min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30个周期，最后72℃修复延伸10min。将pcr产物纯化回收后进行测序(浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))，16s rrna测序结果(seq id no.1所示)上传至ncbi，获得登录号oq829420，同时将该序列同ncbi数据库中的基因序列进行blast对比。发现其属于pseudomonas属，与pseudomonas entomophila str.l48 chromosome、pseudomonas hamedanensis strain swri65chromosome和pseudomonas crudulactis strain ucma17988 16sribosomal rna gene具有99％的同源性。从结果中选取10株pseudomonas具有代表性的菌株，以16srrna基因序列同源性为基础，采用mega7.0软件构建系统发育树，如图3。通过遗传距离及16s rrna序列对比，鉴定为pseudomonas nitritireducens。
42.16s rrna序列
43.1tgggagcttgctcccggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctgg
44.61tagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagc
45.121aggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgggg
46.181taaaggcctaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactgga
47.241actgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcg
48.301aaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcacttta
49.361agttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccaacagaataag
50.421caccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaa
51.481ttactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttggtaagatggatgtgaaatccccgggctc
52.541aacctgggaactgcatccataactgcctgactagagtacggtagagggtggtggaatttc
53.601ctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacct
54.661ggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctgg
55.721tagtccacgccgtaaacgatgtcgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcgca
56.781gctaacgcgataagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaat
57.841tgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaacc
58.901ttacctggccttgacatgtccggaatcttgcagagatgcgagagtgccttcgggaatcgg
59.961aacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgt
60.1021aacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttatggtgggcactctaaggagact
61.1081gccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcca
62.1141gggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagcta
63.1201atcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcgga
64.1261atcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacac
65.1321cgcc。
66.(3)菌株zkj对梅里埃gn卡上47种碳源的利用能力。
67.利用梅里埃全自动鉴定仪考察菌株zkj对47种不同碳源的代谢情况(委托给浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))。鉴定结果如表1所示。经梅里埃全自动鉴定仪vitek生化反应，菌株zkj可较强利用11种碳源，对其他36种碳源不能利用。
68.表1菌株zkj梅里埃全自动鉴定仪vitek生化反应结果(gn卡)
[0069][0070]
[0071]
表注：+，阳性反应；-：阴性反应
[0072]
通过菌落形态、16s rrna序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株zkj为pseudomonas nitritireducens，命名为硝酸盐还原假单胞菌(pseudomonas nitritireducens)zkj，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：cctcc no：m 2023672，保藏日期：2023年05月04日。
[0073]
实施例2、硝酸盐还原假单胞菌zkj静息细胞的获得
[0074]
1、斜面培养：
[0075]
将硝酸盐还原假单胞菌zkj接种至lb液体培养基中，在15℃，160rpm下培养24～36h，再将活化的细菌画线于固体lb平板30℃培养箱培养，取单菌落继续平板画线以检测细菌的纯度，进行lb试管斜面常规(4℃)保存。
[0076]
2、扩大培养
[0077]
将步骤1中斜面菌体接种至lb液体培养基中，在15℃，160rpm下培养24～36h，获得od600＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得硝酸盐还原假单胞菌zkj静息细胞。
[0078]
实施例3：硝酸盐还原假单胞菌zkj对不同浓度乙酸芳樟酯的降解性能检测。
[0079]
将无机盐培养液分装于体积均为300ml的摇瓶中，每瓶50ml，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到50mg/l(以细胞干重计)实施例2方法获得的静息细胞，然后加入乙酸芳樟酯作为唯一碳源使其终浓度分别为54、108、162、216、270mg/l，摇瓶密封后，15℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。采用安捷伦气相色谱测定摇瓶上方气相中乙酸芳樟酯的浓度，分析条件如下：色谱柱为hp-innowax polyethylene glycol(30m
×
320μm
×
0.50μm)，柱温240℃，柱内流量：0.5ml
·
min-1
，进样口温度250℃，分流比40:1，检测器为氢火焰离子化检测器(fid)，温度250℃，氢气流量40ml
·
min-1
，空气流量450ml
·
min-1
，进样量0.8ml。定时测定摇瓶中残留的乙酸芳樟酯浓度，绘制菌株不同初始浓度乙酸芳樟酯随着时间变化的去除率曲线，结果见图4所示。结果表明，当乙酸芳樟酯浓度低于216mg/l时，菌株zkj可以快速地降解所有添加的底物；当乙酸芳樟酯浓度270mg/l时，菌株zkj在所测试的时间内对底物的降解率80％左右。
[0080]
实施例4：硝酸盐还原假单胞菌zkj在不同初始ph环境下对108mg/l的乙酸芳樟酯的降解性能检测。
[0081]
用1mol/l naoh水溶液或1mol/l h2so4水溶液调节无机盐培养液为不同ph值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，在初始乙酸芳樟酯浓度为108mg/l的条件下接入实施例2方法制备的菌液，使各平行样中的初始菌液浓度以od
600
计为0.02。摇瓶密封，将样品于15℃，160rpm恒温摇床里振荡培养，并做不加细菌的空白对照。采用实施例3方法定时测定摇瓶中残留的乙酸芳樟酯浓度，绘制菌株不同ph环境下乙酸芳樟酯随着时间变化的去除率曲线以及在22h时不同ph下对于108mg/l的乙酸芳樟酯的降解率，结果见图5和图6所示。结果表明，在各ph下，假单胞菌zkj均能降解乙酸芳樟酯，且在ph为7和8时对乙酸芳樟酯的降解效果最好。
[0082]
实施例5：硝酸盐还原假单胞菌zkj对不同有机物的降解性能检测。
[0083]
将无机盐培养液分装于体积均为300ml的摇瓶中，每瓶50ml，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到50mg/l(以细胞干重计)实施例2方法获得的静息细胞，然后分别加入乙酸芳樟酯、甲苯、氯苯、二氯甲烷作为唯一碳源使其终
浓度分别为80mg/l，摇瓶密封后，15℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。采用实施例3所述安捷伦气相色谱测定摇瓶气相中四种污染物的浓度。
[0084]
结果如表2所示。可以看出，假单胞菌zkj除了能降解乙酸芳樟酯外，对于甲苯有一定的降解能力，但是对于含氯的底物，如氯苯、二氯甲烷，几乎没有降解效果。
[0085]
表2各种底物测试效果
[0086]
底物36h剩余浓度(mg/l)降解率(％)乙酸芳樟酯4.894甲苯37.653氯苯7210二氯甲烷73.68
[0087]
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更改与润饰，均应属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.硝酸盐还原假单胞菌(pseudomonas nitritireducens)zkj，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m 2023672，保藏日期：2023年05月04日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。2.一种权利要求1所述硝酸盐还原假单胞菌zkj在降解有机污染物中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是将硝酸盐还原假单胞菌zkj经扩大培养获得的菌液或静息细胞加入ph＝4-9、含有机污染物的无机培养液中，在15-30℃、100-200rpm条件下进行培养，实现有机污染物的降解。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述有机污染物包括乙酸芳樟酯、甲苯。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为54-270mg/l。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，培养条件为15℃、160rpm。7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述无机盐培养液组成为：k2hpo4·
3h2o0.942g/l、kh2po
4 0.234g/l、nano
3 1.7g/l、nh4cl 0.98g/l、mgcl2·
6h2o 0.2033g/l、cacl2·
2h2o 0.011g/l、fecl
3 0.0162g/l，微量元素母液5ml/l，溶剂为去离子水，ph 7.0；其中微量元素母液组成：cuso4·
5h2o 0.02g/l、feso4·
7h2o 1.0g/l、mnso4·
4h2o 0.1g/l、namoo4·
2h2o 0.02g/l、cocl2·
6h2o 0.02g/l、h3bo
3 0.014g/l、znso4·
7h2o 0.10g/l，溶剂为去离子水。8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述硝酸盐还原假单胞菌zkj静息细胞以干重计加入量为20-80mg/l；以菌液的od
600
计为0.01-0.05。9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述硝酸盐还原假单胞菌zkj的静息细胞按如下步骤制备：(1)斜面培养：将硝酸盐还原假单胞菌zkj接种于斜面lb固体培养基，30℃培养24～36h，获得斜面菌体，所述lb固体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，琼脂18～20g/l，溶剂为去离子水，ph值自然；(2)扩大培养：用接种环挑取步骤(1)获得的斜面菌体接种至lb液体培养基中，15℃，160rpm培养24～36h，获得od
600
＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，无机盐培养基洗涤，获得假单胞菌zkj静息细胞；所述lb液体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。

技术总结
本发明公开了一种硝酸盐还原假单胞菌ZKJ及其在降解有机污染物中的应用，本发明硝酸盐还原假单胞菌ZKJ对于芳樟酯类污染物具有高效的降解效果，可以把污染物转化为CO2、H2O等无害物质，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。所述的硝酸盐还原假单胞菌ZKJ能将乙酸芳樟酯完全降解为无机物和细胞生物质，实现矿化，且对于216mg/L以内的乙酸芳樟酯的去除率高于95％。酯的去除率高于95％。


技术研发人员：寿登 周凯杰 成卓韦 陈建孟 陈东之 於建明
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.06.16
技术公布日：2023/9/14