一种高效抗氧化驴精子稀释液及其制备方法和应用

1.本发明涉及牲畜类精子抗氧化技术领域，尤其涉及一种高效抗氧化驴精子稀释液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.驴具有很高的经济使用价值，驴皮是制作名贵中药阿胶的主要原料，具有滋阴、补肺、补血等功效，驴肉是美味营养的食品，深受广大消费者青睐。随着我国社会经济的发展和国民收入的增加，以及饮食结构的调整和保健养生意识的增强，国内外市场对驴产品的需求量急速增长，驴产品市场不断扩大，出现了驴资源紧缺的现象，致使驴的价格也不断上升，从而给养驴业带来了新的活力。
3.然而，我国虽为养驴大国，养驴历史悠久，但由于驴产业在国内的发展起步晚，农役需求转向商用养殖的时间较短，肉驴的养殖业以分散散养的比例为主，标准化规模养殖程度低，饲养管理较粗放，生产方式落后，尚未形成配套的繁育体系、饲养标准和饲料生产技术体系，缺乏配套的规模化驴场的规划设计参数和环境质量控制技术，导致养驴业生产相对滞后，在技术研究领域还存在许多空白，所以发展规模化养殖体系已成为势在必行的发展趋势。
4.规模化养殖一大养殖要点就是繁殖技术，人工输精技术是繁殖技术的基础，也成为驴产业发展的基石。驴是一种发情期较长难以把握排卵时间的单胎动物，集中发情期为每年的3月份到8月份，从母驴体现发情表现到排卵，持续3-13天不等，期间优势卵泡持续发育直至排卵，情期受胎率为30％-50％，繁殖率为60％左右。驴是一种子宫内射精的动物，驴生殖管道较长，射精量较大，一般公驴射精量平均70ml。若规模化驴场开展人工输精，为保证受胎率输精量不低于2亿个精子，且精子活力不能低于80％。因此，开发延长精子体外存活的稀释液是基础中的基础。
5.由于精子在离开公驴身体后，其活力会逐渐下降。然而，目前市场上售卖的精液稀释液在维持精子的活力方面效果有限，精子稀释后活力下降明显，所以导致受胎率无法保障；同时，在输精管穿过阴道时，容易将环境中及阴道内的细菌带入子宫，使母驴引发子宫炎，不仅影响母驴的子宫健康，还会影响胚胎着床，进一步影响受胎率。为了提高母驴受胎率，提高精子体外存活率，并保证母驴的子宫健康，对驴精液稀释液配方进行改良优化显得尤为重要。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种高效抗氧化驴精子稀释液及其制备方法和应用，以便有效提高母驴受胎率、降低子宫炎发病率，提高体外精子活力。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种高效能抗氧化驴精子稀释液，包括基础液和添加物，其中：
9.所述基础液是每1000ml水中包括以下重量的成分：葡萄糖30～60g、4-羟乙基哌嗪
乙磺酸钠4～6g、脱脂奶粉12～24g、柠檬酸钾0.5～1.1g；
10.所述添加物是每1000ml基础液中包括以下重量的成分：萝卜硫素5mg～10mg、豆甾醇0.1mg～0.2mg、恩诺沙星浓液40μg～100μg、头孢噻呋钠3mg～5mg。
11.本发明提供了一种高效能抗氧化驴精子稀释液的制备方法，包括如下步骤：
12.(1)将基础液的各成分进行混匀，制得基础液；
13.(2)将所述基础液灭菌，在无菌环境下加入所述添加物，即得高效抗氧化驴精子稀释液。
14.优选地，步骤(2)所述灭菌的条件为：基础液在压力100.4～106.4kpa、温度111.3～131.3℃的条件下，维持15～30分钟，进行灭菌。
15.优选地，所述添加物中萝卜硫素、豆甾醇、恩诺沙星分别用二甲基亚砜溶解后添加到所述基础液中。
16.优选地，所述萝卜硫素与二甲基亚砜的溶解比例为5mg～10mg：1ml，豆甾醇与二甲基亚砜的溶解比例为0.1mg～0.2mg：100μl。
17.优选地，所述恩诺沙星的添加是将5～15mg恩诺沙星粉末溶于0.5～1.5ml二甲基亚砜中制备得到恩诺沙星浓缩液，后将40μg～100μg恩诺沙星浓缩液加入到1000ml基础液中。
18.本发明还提供了一种高效能抗氧化驴精子稀释液在驴精子抗氧化中的应用。
19.本发明通过添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠，既保证维持稀释液ph为7.5，又能为精子提供钠离子，保证精子钠钾泵的正常运行，维持精子渗透压；通过添加柠檬酸钾，既保证为精子提供柠檬酸根离子，又能为精子提供钾离子，保证精子钠钾泵的正常运行，维持精子渗透压。
20.本发明添加的萝卜硫素可有效降低精子因剧烈运动产生的自由基，抑制脂质过氧化反应，保护线粒体膜和线粒体功能，及精子质膜等膜系统，降低辐射、药物、有毒物质、剧烈运动等因素引起的精子氧化应激；本发明添加的豆甾醇具有抗氧化和抗炎作用，可提高精子膜流动性继而提高精子获能的效率。
21.本发明添加的恩诺沙星和头孢噻呋钠，可有效抑制稀释后精液内细菌繁殖，进一步提高了精子体外存活的能力，起到1+1大于2的作用。
22.目前规模化牧场长期人工输精易造成致病菌产生抗药性，恩诺沙星对由耐药性致病菌引起的严重感染有效，与其它抗菌素无交叉耐药性，可有效降低母驴发生子宫炎的几率，保证母驴健康的子宫环境，促进本稀释液的应用推广，可进一步提高受胎率。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
24.图1为实验例1中实验组1和对照组1的精子活力检测结果；
25.图2为实验例1中24h时实验组1和对照组1的精子ros检测结果；
26.图3为实验例1中24h时实验组1和对照组1的高效抗氧化驴精子稀释液处理驴精液
后精子蛋白磷酸化的富集分析。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
28.实施例1
29.一种高效能抗氧化驴精子稀释液的制备方法，包括以下步骤：
30.将50g的葡萄糖、5.2g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠、24g的脱脂奶粉、0.8g的柠檬酸钾加纯水定容至1000ml制备得到基础液；将基础液在121.3℃、103.4kpa下灭菌25min。
31.将9mg的萝卜硫素粉末溶于1ml的二甲基亚砜(dmso)、将0.1mg的豆甾醇粉末溶于100μl的二甲基亚砜(dmso)后加入基础液中；将10mg恩诺沙星粉末溶于1ml二甲基亚砜(dmso)中，得到恩诺沙星浓液，取100μg加入基础液中，将5mg的头孢噻呋钠直接加入基础液中混匀，得到高效抗氧化驴精子稀释液。
32.实施例2
33.一种高效能抗氧化驴精子稀释液的制备方法，包括以下步骤：
34.将60g的葡萄糖、6g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠、20g的脱脂奶粉、1.1g的柠檬酸钾加纯水定容至1000ml制备得到基础液；将基础液在131.3℃、106.4kpa下灭菌30min。
35.将10mg的萝卜硫素粉末溶于1ml的二甲基亚砜(dmso)、将0.2mg的豆甾醇粉末溶于100μl的二甲基亚砜(dmso)后加入基础液中；将15mg恩诺沙星粉末溶于1.5ml二甲基亚砜(dmso)中，得到恩诺沙星浓液，取80μg加入基础液中，将4mg的头孢噻呋钠直接加入基础液中混匀，得到高效抗氧化驴精子稀释液。
36.实施例3
37.一种高效能抗氧化驴精子稀释液的制备方法，包括以下步骤：
38.将30g的葡萄糖、4g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠、12g的脱脂奶粉、0.5g的柠檬酸钾加纯水定容至1000ml制备得到基础液；将基础液在111.3℃、100.4kpa下灭菌15min。
39.将5mg的萝卜硫素粉末溶于1ml的二甲基亚砜(dmso)、将0.15mg的豆甾醇粉末溶于100μl的二甲基亚砜(dmso)后加入基础液中；将5mg恩诺沙星粉末溶于0.5ml二甲基亚砜(dmso)中，得到恩诺沙星浓液，取40μg加入基础液中，将3mg的头孢噻呋钠直接加入基础液中混匀，得到高效抗氧化驴精子稀释液。
40.实验例1
41.1、对实施例1得到的高效抗氧化驴精子稀释液可提高精子的活力进行验证，具体检测方法如下：
42.对10头公驴采集精液，并将采集好的精液混匀后平均分为两组，分别作为实验组1和对照组1。
43.将实验组1的精液按照1：1(原精：稀释液)的体积比加入高效抗氧化驴精子稀释液进行稀释，将对照组1的精液按照1：1(原精：稀释液)的体积比例加入inra82稀释液(由法国卡苏公司出品inra96稀释液ref.022110-022330)进行稀释；之后，将实验组1和对照组1均置于25℃避光条件下，分别在0h、3h、6h、12h、24h用精子活力检测仪检测实验组1和对照组1中精子的活力，检测结果如图1所示，由图1可得知，随着时间的延长，实验组1的精子活力为
43.0
±
3.6％，明显高于对照组1的29.1
±
5.2％，可见，本发明提供的高效抗氧化驴精子稀释液可有效提高精子的活力。
44.2、对实施例1得到的高效抗氧化驴精子稀释液具有良好的抗氧化效果进行验证，具体检测方法如下：
45.对公驴精液采集、稀释的过程同第1部分，根据1中的结果，对处理24h的实验组1和对照组1进行活性氧(ros)检测。使用dcfda/h2dcfda-cellular ros assay试剂盒(ab113851,abcam，英国)，按照说明书检测实验组和对照组精子atp浓度。结果如图2所示，对照组1和实验组1中精子roc检测荧光强度分别为1.51
±
0.04和0.47
±
0.03，对照组1精子中ros含量显著高于实验组1，表明实施例1得到的高效抗氧化驴精子稀释液具有良好的抗氧化效果。
46.3、对实施例1得到的高效抗氧化驴精子稀释液具有良好的抑菌效果进行验证，具体检测方法如下：
47.对10头公驴采集精液，并将采集好的10头公驴精液混匀后，取5ml混匀精液两份，分别与高效抗氧化驴精子稀释液和inra82稀释液(其中inra82稀释液包含抗生素：青霉素100000iu/l，链霉素双氢150mg/l)等体积混合后，分别作为实验组2和对照组2。将实验组2和对照组2分别用pbs以1：10、1：100、1：1000的体积比进行稀释。并将5ml高效抗氧化驴精子稀释液作为空白实验组，将5ml inra82稀释液作为空白对照组；之后，将实验组2、对照组2、空白实验组、空白对照组均置于37℃避光水浴条件下，按照菌落总数测定(gb4789.2-2016)测定方法，测定实验组2、对照组2、空白实验组以及空白对照组中在不同时间对应的菌落生长情况，经过5个平行实验(空白实验组和空白对照组分别对同一样品进行了5组平行实验)，检测结果如表1所示，通过实验组2和对照组2进行比较可以看出，在相同时间，实验组2的菌落数均明显少于对照组2的菌落数；同时，空白实验组和空白对照组中的菌落数极少，可见，通过实施例1制备的高效抗氧化驴精子稀释液和inra82稀释液本身无菌，所以，实验组2和对照组2中的细菌并不是由两种稀释液带入的。可见，实验组2所采用的实施例1制备的高效抗氧化驴精子稀释液较对照组2所采用的inra82稀释液而言，抑菌效果显著。
48.表1实验组2和对照组2的抑菌效果检测结果
[0049][0050]
4、对实施例1得到的高效抗氧化驴精子稀释液具有促进精子体外存活的分子基础进行验证，即蛋白磷酸化检测，具体检测方法如下：
[0051]
对公驴精液采集的过程同第1部分，根据1中的结果，对24h的实验组1和对照组1进行蛋白磷酸化检测。分别取20ml实验组1和对照组1离心收集精子，进行蛋白提取，并开展lc-ms/ms分析，进行蛋白质的鉴定和定量。
[0052]
使用proteome discoverer套件(2.4版本，赛默飞世尔科学公司)分析raw文件。在包含swiss-prot和trembl equus asus参考蛋白序列的uniprotkb equus asus蛋白质组数
据库中搜索ms2谱。使用sequest ht搜索引擎，并指定如下参数：充分的tryptic特异性，最大3个缺失的裂解，最小的肽长度为6，半胱氨酸残基的固定卡脒甲基化(+57.02146da)，甲硫氨酸残基氧化的可变修饰(+15.99492da)和丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化(79.966da)，前体质量耐量为15ppm，在orbitrap中收集的ms2光谱的片段质量耐量为0.02da。使用percolator过滤肽谱匹配和肽的错误发现率(fdr)小于1％。在光谱分配后，将多肽组装成蛋白质，并根据其组成多肽的组合概率进一步过滤，最终fdr为1％。默认情况下，顶部匹配的蛋白质或“主蛋白”是具有最多独特肽段且肽覆盖百分比值最小的蛋白质(即最长的蛋白质)。只有独特的和锋利的肽被考虑用于定量。对原始数据进行中值归一化，消除实验带来的误差。过滤掉样本中超过50％空值的数据。差异表达蛋白位点满足以下条件：平均比值变化＞1.5，以及p值＜0.05.利用cog(clusters oforthologous groups)数据库对蛋白家族进行分析。蛋白质组的go注释来自go数据(https://www.ebi.ac.uk/quickgo/)。go注释将蛋白质按照分子功能、生物过程和细胞成分三大类进行分类。
[0053]
通过分析对照组1和实验组1发现精子蛋白磷酸化差异显著的有16个：akap3、akap4、atp7b、atp2a3、cct8l2、psmc2、vcp、atp2b4、hsp90aa1、dnah6、crybg3、slc26a8、prkaca、ccdc40、fsip2和spa17。如akap3的降解受其酪氨酸磷酸化调控继而影响精子获能；atp2b4或称为质膜钙atp酶4(pmca4)协同钙离子和一氧化氮信号通路共同调节小鼠精子活力；spa17作为camp/pka信号通路中的关键蛋白通过调控下游氧化还原信号传递来调控ros含量；psmd4亚基被发现在获能过程中发生翻译后修饰，导致表观分子质量的变化，其中一些是依赖于蛋白酶体抑制；hsp90aa1蛋白在精子中的含量可以作为野猪冻精质量的预测指标；efcab蛋白通过对生理ph和钙的双重感知调节来调控精子活力；蛋白激酶a(prka)活性在人精子获能开始时受蛋白酶体调节；fsip2的突变会导致精子鞭毛(mmaf)形态异常等等。
[0054]
这些蛋白和其他表现出差异的磷酸化或去磷酸化的蛋白，参与精子获能、精子发生、精子鞭毛运动、atp水解活性、atp结合等生理生化过程，这些蛋白遍布于精子纤维鞘、精子主段、精子中段、精子末段及精子鞭毛等区域，如图3所示。这些证据也直接的说明实施例1得到的高效抗氧化驴精子稀释液通过影响以上蛋白的磷酸化或去磷酸化，继而提高驴精子体外存活的能力。
[0055]
5、对实施例1得到的高效抗氧化驴精子稀释液在提高母驴受胎率和降低子宫炎发病率方面具有良好的效果进行验证，具体检测方法如下：
[0056]
在示范驴场用实施例1得到的高效抗氧化驴精子稀释液对原精进行稀释后，共计输精2100头次母驴，并作为实验组3；用inra82稀释液对原精进行稀释后，共计输精3200头次母驴，并作为对照组3；且实验组3和对照组3的原精相同，稀释比例相同，输精位置相同，均是将稀释后的精液输至母驴的子宫角处。
[0057]
输精并排卵后的18天后通过孕检统计受胎情况，实验组3中，受胎母驴为1321头，受胎率为62.9％，母驴子宫炎发病率为4.4％。对照组3中，受胎母驴为1501头，受胎率为46.9％，母驴子宫炎发病率为12.1％。
[0058]
可见，实验组3相对于对照组3，受胎率大大提高，而母驴子宫炎发病率大大降低，由此可见，本发明提出的适用于驴精子供能的稀释液在提高母驴受胎率和降低子宫炎发病率方面具有突出的效果，促进养殖规模的不断扩大，也对母驴的子宫健康更有保障。
[0059]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种高效能抗氧化驴精子稀释液，其特征在于，包括基础液和添加物，其中：所述基础液是每1000ml水中包括以下重量的成分：葡萄糖30～60g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠4～6g、脱脂奶粉12～24g、柠檬酸钾0.5～1.1g；所述添加物是每1000ml基础液中包括以下重量的成分：萝卜硫素5mg～10mg、豆甾醇0.1mg～0.2mg、恩诺沙星浓液40μg～100μg、头孢噻呋钠3mg～5mg。2.一种权利要求1所述的高效能抗氧化驴精子稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将基础液的各成分进行混匀，制得基础液；(2)将所述基础液灭菌，在无菌环境下加入所述添加物，即得高效抗氧化驴精子稀释液。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述灭菌的条件为：基础液在压力100.4～106.4kpa、温度111.3～131.3℃的条件下，维持15～30分钟，进行灭菌。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述添加物中萝卜硫素、豆甾醇分别用二甲基亚砜溶解后添加到所述基础液中。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述萝卜硫素与二甲基亚砜的溶解比例为5mg～10mg：1ml，豆甾醇与二甲基亚砜的溶解比例为0.1mg～0.2mg：100μl。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述恩诺沙星添加时，是将5～15mg恩诺沙星粉末溶于0.5～1.5ml二甲基亚砜中制备得到恩诺沙星浓液，后将40μg～100μg恩诺沙星浓液加入到1000ml基础液中。7.权利要求1～6任一项所述的一种高效能抗氧化驴精子稀释液在驴精子抗氧化中的应用。

技术总结
本发明涉及牲畜类精子抗氧化技术领域，提供了一种高效抗氧化驴精子稀释液及其制备方法和应用。一种高效能抗氧化驴精子稀释液，包括基础液和添加物，其中：基础液是每1000mL水中包括以下重量的成分：葡萄糖30～60g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠4～6g、脱脂奶粉12～24g、柠檬酸钾0.5～1.1g；添加物是每1000mL基础液中包括以下重量的成分：萝卜硫素5mg～10mg、豆甾醇0.1mg～0.2mg、恩诺沙星浓液40μg～100μg、头孢噻呋钠3mg～5mg。本发明可有效提高母驴受胎率、降低子宫炎发病率，提高体外精子活力。提高体外精子活力。提高体外精子活力。


技术研发人员：吴海青 苏少锋 乔健敏 特日格勒 田婧 贾晓清 马跃军 孙培陪 白晋宇
受保护的技术使用者：内蒙古自治区农牧业科学院
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/9/14