ZmSAUR21基因、蛋白及其在调控苗期玉米根系发育中的应用

zmsaur21基因、蛋白及其在调控苗期玉米根系发育中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种zmsaur21基因、蛋白及其在调控苗期玉米根系发育的应用。


背景技术：

2.玉米作为三大粮食作物之一，具有生产潜力大、经济效益高的优点，玉米可以作为粮食、饲料和多种工业原料，在保障粮食安全方面具有重要战略地位。植物根系具有潜在改善植物生长和作物生产力的功能，尤其是侧根作为植物吸收水分、养分和应对胁迫的重要器官，在适应各种环境条件中起着至关重要的作用。内源生长素生物合成、生长素极性运输、降解、结合会改变生长素积累和生长素依赖的信号转导，从而会影响侧根的形成，而参与这些过程的基因突变显著影响侧根的发育。生长素(iaa)作为最早被发现的一类的植物激素，它对植物的生长发育有着至关重要的作用。生长素通常能在不同发育阶段与其他激素相结合参与不同组织的生长，因此生长素介导的植物生长发育涉及着复杂的信号传导作用。
3.small auxin-up rnas(saurs)基因家族不仅是植物特有的基因家族，同时也是最大的生长素响应因子家族。近年来，saurs基因家族的功能在拟南芥、水稻中被研究得越来越多。根据不同的发育阶段，陆生植物会不断地改变其生长模式来适应环境的变化。为了实现这一点，它们进化出了动态生长因子，这些因子可以通过响应广泛的植物内部和环境刺激来快速诱导生长。这些生长因子(即saurs蛋白)，通常在抑制pp2c.d磷酸酶方面具有共同的功能，但它们的基因表现出丰富的调控区域多样性，从而允许组织特异性和刺激特异性的表达模式。但玉米zmsaur21基因在玉米根系发育方面的调控作用还没有相关报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供玉米基因zmsaur21的用途，特别是zmsaur21基因在调控苗期玉米根系中的应用。在玉米中定点突变所述zmsaur21基因，主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等性状均显著降低；在玉米中过表达所述zmsaur21基因，主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等性状均显著升高。因此，本发明为调控玉米苗期根系发育提供了宝贵的基因资源。
5.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
6.一种玉米zmsaur21蛋白，为如下a)或b)的蛋白：
7.a)由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
8.b)将seq id no.2所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或添加和/或缺失且与玉米的根系发育相关的由seq id no.2衍生的蛋白。
9.本发明还提供一种玉米zmsaur21基因，所述基因编码上述的蛋白。
10.进一步的，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述的玉米zmsaur21基
因。
12.本发明还提供上述的玉米zmsaur21蛋白或上述的玉米zmsaur21基因在调控玉米的根系发育中的应用。
13.进一步的，调控玉米的根系发育包括：调控玉米的主胚根轴根长、种子根轴根平均长度、种子根数目、主胚根总根长、种子根总根长、总根长、侧根长和根长。
14.本发明还提供一种调控玉米根系发育的方法，包括以下步骤：将zmsaur21基因的cds序列构建到植物表达载体上，转化到野生型玉米自交系b104中，获得阳性zmsaur21过表达植株；所述阳性zmsaur21过表达植株与所述野生型玉米自交系根系相比根系发育更好。
15.进一步的，过表达zmsaur21基因使用的植物表达载体为玉米ubiquitin启动子驱动的pcombia3300载体。
16.进一步的，载体构建的上游引物序列为oe-f，下游引物序列为oe-r，序列如下：
17.oe-f：5
’‑
gatgtgggttttactgatgc-3’；
18.oe-r：5
’‑
ggctgaggtagctggtgc-3’。
19.进一步的，通过荧光定量分析阳性zmsaur21过表达植株中zmsaur21在根系中的表达水平；其进行荧光定量分析的上游引物序列为rt-qpcr-f，下游引物序列为rt-qpcr-r；用actin作为内参基因，其上游引物序列为actin-f，下游引物序列为actin-r；序列如下：
20.rt-qpcr-f：5
’‑
aagggctacttcgccgtgta-3’21.rt-qpcr-r：5
’‑
tggcctggaagtcctcctc-3’22.actin-f：5
’‑
gtgtcctgtccacccactctct-3’23.actin-r：5
’‑
ggaactcgttcacatcaacgttc-3’。
24.本发明的目的在于提供玉米基因zmsaur21的用途，特别是zmsaur21基因在调控苗期玉米根系发育的应用。
25.所述zmsaur21基因是编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
26.(a)由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
27.(b)将seq id no.2所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或添加和/或缺失且与玉米根系相关的由seq id no.2衍生的蛋白质。
28.所述调控是指在玉米中过表达所述zmsaur21基因，增加主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等性状；在玉米中定点突变zmsaur21基因，降低主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等性状。
29.本发明还提供一种培育玉米主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等增加的转基因玉米的方法，包括如下步骤：将zmsaur21基因的cds序列构建到植物表达载体上，转化目的玉米中，获得阳性转基因植株；所述转基因玉米与所述目的玉米相比主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等增加。
30.所述zmsaur21基因的cds序列如seq id no.1所示。
31.本发明中，过表达zmsaur21基因使用的植物表达载体优选为玉米ubiquitin启动子驱动的pcombia3300载体。
32.本发明还提供了一种降低主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等的方法，利用crispr/cas9基因编辑技术定点突变zmsaur21基因，从而使玉米主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等降低。
33.所述crispr/cas9基因编辑技术定点编辑的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示的玉米zmsaur21基因的靶位点。
34.本发明是采用以下技术方案来实现的：构建crispr/cas9重组质粒，其表达cas9蛋白的基因和表达sgrna的基因，sgrna的靶序列如seq id no.3和seq id no.4所示。将构建的重组质粒转化到野生型玉米自交系(kn5585)中，筛选获得阳性转基因玉米植株。通过定点突变zmsaur21降低了主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等。
35.本发明揭示了玉米zmsaur21的生物学功能，该基因正调控玉米根系，过表达该基因使玉米根系变长，敲除该基因使玉米根系变短。本发明为调控玉米苗期根系发育提供了宝贵的基因资源。
36.有益效果
37.对玉米zmsaur21基因组织表达模式进行了分析，gus染色分析结果表明zmsaur21基因只在根系中表达，在茎和叶中并不表达。zmsaur21在主胚根根尖和侧根根尖均有不同程度的表达。在玉米中定点突变zmsaur21基因，主胚根轴根长(prl)、种子根轴根平均长度(asrl)等根系性状显著降低；在玉米中过表达zmsaur21基因，主胚根轴根长(prl)、种子根轴根平均长度(asrl)等根系性状显著增加。因此有望作为玉米根系构型改良的目标靶基因。
附图说明
38.图1为本发明的zmsaur21在根、茎、叶中的gus染色分析图。其中，图1a为苗期根尖gus染色，图1b为苗期茎gus染色，图1c为苗期叶gus染色。
39.图2为本发明的zmsaur21在根系不同部位的gus染色分析图。其中，a：苗期根尖gus染色；b-c：苗期侧根根尖gus染色；d：苗期侧根原基起始点gus染色；e：苗期侧根原基形成时gus染色；f：苗期侧根发育过程中gus染色。
40.图3为本发明的zmsaur21敲除变体材料的鉴定与分析图。其中，a：zmsaur21敲除突变体结构示意图及突变类型；b：zmsaur21敲除突变体测序峰图；c：zmsaur21敲除突变体蛋白结构域和氨基酸序列比较。
41.图4为本发明的zmsaur21过表达材料的鉴定与分析图。其中，a：过表达载体zmsaur21-pcombia330结构示意图；b：过表达株系鉴定电泳胶图；c：zmsaur21在过表达株系oe1和wt的相对表达水平，误差线表示平均值
±
标准差，t检验判断显著水平(p《0.01)
42.图5为本发明的zmsaur21敲除突变体表型及其根系表型分析图。
43.图6为本发明的zmsaur21过表达根系表型及其根系表型分析图。
44.图7为遗传材料根系切片分析图。
具体实施方式
45.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但并不限定于本发明。下述实施例中的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的各种实验材料、试剂和载体等，均可通过商业途径获得。
46.实施例1
47.zmsaur21基因的组织表达模式
48.1、gus染色分析
49.在phytozome网站(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)上下载zmsaur21启动子序列，取起始密码子atg上游2000bp长度的序列(seq id no.5)，设计扩增引物(包含酶切位点)。利用高保真酶进行pcr反应获得zmsaur21启动子序列产物，将产物纯化后连接至pcm3300m载体上，以驱动gus基因的表达。将构建成功的zmsaur21:gus载体转化至玉米品种kn5585中，通过筛选后将阳性株系进行gus染色，并对苗期7d的gus植株进行染色观察，以此用于检测zmsaur21基因在不同组织器官中的表达模式。
50.zmsaur21:gus载体构建的上游引物序列为gus-f，下游引物序列为gus-r。
51.gus-f：5
’‑
accctgttgtttggtgtt-3’；(seq id no.6)
52.gus-r：5
’‑
ctttgccgtaatgagtga-3’；(seq id no.7)
53.本研究使用coolaber的gus染色试剂盒进行gus染色，步骤如下：(1)gus染色液配制：将x-gluc溶剂室温或40℃水浴融化，1ml溶剂加入到1管x-gluc干粉中，得50
×
gus染色浓缩液。随后将gus染色浓缩液/gus染色缓冲液按照1：50比例稀释使用。(2)取样：将准备好的材料根据不同部位不同目的切成0.5cm长短放入gus染色液中，避光保温1小时至过夜，不同材料的染色时间视情况而定。(3)将染色的材料依次放入浓度为70％、80％、90％的乙醇中进行各脱色一次，直至对照阴性材料呈白色。难脱色的材料可以用更高浓度的乙醇或无水乙醇进行脱色。(4)使用宏观变倍荧光显微镜(dm1000,leica)观察脱色完成的材料。
54.结果如图1，zmsaur21基因只在根系中表达，在茎和叶中不表达。如图2所示，zmsaur21在主胚根根尖和侧根根尖均有不同程度的表达。此外，zmsaur21在侧根起始、侧根原基形成和侧根伸长的过程中均有明显的表达。
55.实施例2
56.zmsaur21基因的敲除突变体的构建和鉴定
57.在zmsaur21基因的外显子结构域中设计了两个靶位点，利用crispr/cas9基因编辑技术构建zmsaur21敲除突变体。将构建成功的crispr/cas9载体转化至玉米kn5585材料，并通过pcr扩增的方式鉴定出阳性事件用于实验。
58.crispr-f：5
’‑
tgccgggtacaagaagacac-3’(seq id no.8)
59.crispr-r：5
’‑
aagaacgcacacgacgatct-3’(seq id no.9)
60.结果如图3，在敲除突变体材料中筛选获得两种纯合的突变类型，分别是ko1和ko2。其中，ko1在靶位点1上有五个碱基agcca的缺失，在靶位点2上有一个碱基c的插入。而ko2在靶位点1上有四个碱基gcca的缺失，在靶位点2上有一个碱基g的缺失。ko1和ko2由于碱基的缺失导致氨基酸序列变化，影响了生长素诱导蛋白15a的合成。
61.实施例3
62.zmsaur21基因的过表达株系的构建和鉴定
63.以野生型玉米自交系根系cdna为模板，扩增zmsaur21的cds序列。将其连接在玉米ubiquitin启动子驱动的pcombia3300载体上，将重组质粒pcombia3300-zmsaur21转入农杆菌eha105中，得到重组农杆菌，然后侵染野生型玉米自交系b104的胚性愈伤组织，然后将其培育获得转基因植株。并通过pcr扩增的方式鉴定出阳性zmsaur21过表达株系oe1。
64.pcombia3300-zmsaur21载体构建的上游引物序列为oe-f，下游引物序列为oe-r。
65.oe-f：5
’‑
gatgtgggttttactgatgc-3’(seq id no.10)
66.oe-r：5
’‑
ggctgaggtagc tggtgc-3’(seq id no.11)
67.通过荧光定量分析了过表达植株oe1和野生型b104中zmsaur21在根系中的表达水平。其进行荧光定量分析的上游引物序列为rt-qpcr-f，下游引物序列为rt-qpcr-r。用actin作为内参基因，其上游引物序列为actin-f，下游引物序列为actin-r。
68.rt-qpcr-f：5
’‑
aagggctacttcgccgtgta-3’(seq id no.12)
69.rt-qpcr-r：5
’‑
tggcctggaagtcctcctc-3’(seq id no.13)
70.actin-f：5
’‑
gtgtcctgtccacccactctct-3’(seq id no.14)
71.actin-r：5
’‑
ggaactcgttcacatcaacgttc-3’(seq id no.15)
72.结果如图4，zmsaur21在oe1中表达水平显著高于野生型。
73.实施例4
74.zmsaur21转基因植株的表型分析
75.所有材料种植方式均采用水培方式。步骤如下：(1)消毒：每份材料都选取色泽饱满、大小一致的种子，去除多余杂质，用清水反复清洗后再用蒸馏水清洗。随后在10％的h2o2中浸泡半小时。(2)催芽：用蒸馏水清洗后放入饱和的无水硫酸钙中浸泡六小时。(3)摆种：冲洗后的种子整齐摆放在湿润的发芽纸上，期间用蒸馏水浇灌。(4)卷苗：48小时种子萌发后，进行卷苗。将长势一致的种子每卷八株，每桶六卷放入水培桶中，桶中放一升蒸馏水，两天后换四分之一营养液，四天后换二分之一营养液，随后每两天换一次全营养液。气候室设置的昼/夜温度为28/26℃，相对湿度为60％，光照时间为14h。
76.在获得稳定的敲除突变体ko1、ko2前提下，对两个突变体进行表型鉴定。在植株生长到两叶期时，选取长势一致的植株，测定地上部和根系性状。结果如图5，与野生型相比，突变体的主胚根轴根长(prl)、种子根轴根平均长度(asrl)、种子根数目(srn)、主胚根总根长(tprl)、种子根总根长(tsrl)、总根长(trl)、侧根长(rll)和轴根总长(rl)均显著降低。与野生型相比，突变体的主胚根轴根长减少了16％，主胚根总根长减少了7％。此外，突变体的种子根轴根平均长度减少了24％、种子根总根长减少了40％，种子根数目也减少了37％。以上性状的显著差异使得突变体的总根长降低34％、侧根长降低26％、总轴根总长降低38％。这说明，zmsaur21对玉米根系发育有正向调控的作用。
77.为了进一步确认zmsaur21对根系发育的正向调控作用，对过表达株系进行表型鉴定。在其两叶期对地上部和根系性状进行测量，并进行数据分析。结果如图6，与野生型相比，过表达材料的主胚根轴根长(prl)、种子根轴根平均长度(asrl)、种子根数目(srn)、种子根总根长(tsrl)、总根长(trl)和轴根总长(rl)均显著升高。与野生型相比，过表达的主胚根轴根长增加了7％，种子根轴根平均长度增加了7％，种子根总根长增加了35％，种子根数目也增加27％。以上性状的显著差异使得突变体的总根长升高15％，轴根总长升高29％。进一步说明zmsaur21对玉米根系的正向调控作用。
78.实施例5
79.遗传材料的根系切片分析
80.对过表达材料oe1及其野生型b104和敲除突变体ko1及其野生型kn5585的根系进行切片观察。将根系分为三个区段：分生区r1、伸长区r2和成熟区r3分别进行切片。结果如图7，与野生型相比，敲除突变体根系分生区、伸长区和成熟区的细胞体积变小，细胞长度显著变短；过表达的根系分生区、伸长区和成熟区的细胞体积变大，细胞长度显著变长。推测
zmsaur21是通过改变根系细胞的大小来影响根系的伸长。
81.序列表
82.zmsaur21的核苷酸序列(seq id no.1)
83.atgatggccatggggtacttccgggcgccgaggcggctgtacgggaggaagccggcggagagggagcaccgggccctgctggtggacgaggacgaccaaggcgaggcggcggcggcggcgggcgcggtgcccaagggctacttcgccgtgtacgtgggcgcggagtcccggcggttcgtggtccgcaccagctacctcagccacccggcgttccgggagctcatggagcgcgccgcggaggagttcggcttcgcgcaggccggcggcctccgcatcccctgccgcgaggaggacttccaggccaccgtcgccgcgctcgagcagtccaggcgtcgcggcggcagggctcgggggtcgccggcggccggaccgacgcggtgggcgcgtgccagctag
84.zmsaur21蛋白的氨基酸序列(seq id no.2)
85.mmamgyfraprrlygrkpaerehrallvdeddqgeaaaaagavpkgy favyvgaesrrfvvrtsylshpafrelmeraaeefgfaqagglripcreedfq atvaaleqsrrrggrargspaagptrwaras*
86.sgrna靶序列
[0087]5’‑
caccagctacctcagccacccgg-3’(seq id no.3)
[0088]5’‑
ggagctcatggagcgcgccgcgg-3’(seq id no.4)
[0089]
zmsaur21基因上游2kb的核苷酸序列(seq id no.5)
[0090]
gttggaccaaatgaaatatatgggcatatagcccttggaacattttttccaaatacaagagacatctaagagactgcatgatacaaccctgagctcctagataataaatacagtcaagatataatatatagagagtcttgtagagactgactcttcgtgaagagctcgtctctttattttttcacttagccctctagatacccctcaagagaaccctcatttaattgggttggacataccctaaggttgatgcaatagagctattatttggttgtgttcgtttcgctaaccaaaacatgatgggaacacttagtattgtttttaatgttgatatcatgaatcactactaactacatcttccacgactgctgcttttggttttcaatgtatttgaacttctaaatgttattggacttatgataacatttaggccatatcttttgttcaaattttaggacctcaatgtgctttatttgccaaaaaaacaagtggttagatttttgcaccggtgttgtccgtttatcagttcactatggaccgattaatcgatgtcgatttgtttcaattcaaaaactagtttgaatttgaatttggccagtttctactgatttatcgcaattaatgggatgtcggtcctggcctacaaaatttatgttttattaggctaataaacattggttattgcatgaatcttttagtaattagtatgtgcttttagtgtattttttgtgagaattaacatacattgatgaaaattagctaattttcgtgaatcttagacggaaacgttcatgatggtgttgtatagggctggaaaaaaaactcgagctcgacgagctggctcgggctcgcagcagctctgctcggctcgacgcttagaacgagtctgagccgagtctgtttttgtggctcgtgaaaagaacgagtcagctcggctcggctcgctgcagctcgtgttgtgggtggacgatcctatattggataaactaattcctgtacagctaaccgagtcgatcctatgttggatatgccagcctagtgcacccacacgccacacatacatattgaaacctttattaattattattgttctactcctgagctagcttgcttatttgcattcagagtcgcctctgatgacctgattattaccagctccgcgtccacgcgtcgtaacagcaataatggtacatgcatgcatgcatgtgcatggatagtcgtgtgatgattccagagtgaatgaactaattaatcaagcttcttgcatcatgcatgtgacaacgctgacagttgatcgtttgagacatgatgcatgtttgtttcttgtacgtacagcaggtaa
[0091]
agtccatcacgaatcacgacgtatatgtctagcaggttagttcacacagta
[0092]
ggaaaaaaaaataactccgtacatcgtgatcatgaatgacgcactaccgta
[0093]
ccctctctgtccatttcttcgttcagattcagaccattgattctgtcctcttc
[0094]
cggccgctgcatcgtacaatggcgataaattttatgccccaaggattctatc
[0095]
tatctctcttcattcctcttgaatgtggggccggcctgttagttgatgcatt
[0096]
tttttaacctgcatactatatattgcgtattctaggtaacatcgatggattga
[0097]
tcggagaaacagccctagctaggtgttatgttacagctatttgattcggag
[0098]
ttcctgaagaagaagaaaaggccatgtacattcaaggctagctacagcta
[0099]
gctgtaggaacaagagggaagcactaaacaacaatataaagaggagatcg
[0100]
aggaacccattctctcatcccattcccatctatcttttctccgttccatcttc
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[0102]
actcgaagacaaccaggaattcctctgccgggtacaagaagacacgttgt
[0103]
tattgcatcgcatcgaccgagaaagctagtgtggcggtcgtg

技术特征：
1.一种玉米zmsaur21蛋白，其特征在于，为如下a)或b)的蛋白：a)由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；b)将seq id no.2所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或添加和/或缺失且与玉米的根系发育相关的由seq id no.2衍生的蛋白。2.一种玉米zmsaur21基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的蛋白。3.根据权利要求2所述的玉米zmsaur21基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2或3所述的玉米zmsaur21基因。5.权利要求1所述的玉米zmsaur21蛋白或权利要求2所述的玉米zmsaur21基因在调控玉米的根系发育中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，调控玉米的根系发育包括：调控玉米的主胚根轴根长、种子根轴根平均长度、种子根数目、主胚根总根长、种子根总根长、总根长、侧根长和根长。7.一种调控玉米根系发育的方法，其特征在于，包括以下步骤：将zmsaur21基因的cds序列构建到植物表达载体上，转化到目的植株中，获得阳性zmsaur21过表达植株；所述阳性zmsaur21过表达植株与所述目的植株相比根系发育更好。8.根据权利要求7所述的调控玉米根系发育的方法，其特征在于，过表达zmsaur21基因使用的植物表达载体为玉米ubiquitin启动子驱动的pcombia3300载体。9.根据权利要求8所述的调控玉米根系发育的方法，其特征在于，载体构建的上游引物序列为oe-f，下游引物序列为oe-r，序列如下：oe-f：5
’‑
gatgtgggttttactgatgc-3’；oe-r：5
’‑
ggctgaggtagctggtgc-3’。10.根据权利要求8所述的调控玉米根系发育的方法，其特征在于，通过荧光定量分析阳性zmsaur21过表达植株中zmsaur21在根系中的表达水平；其进行荧光定量分析的上游引物序列为rt-qpcr-f，下游引物序列为rt-qpcr-r；用actin作为内参基因，其上游引物序列为actin-f，下游引物序列为actin-r；序列如下：rt-qpcr-f：5
’‑
aagggctacttcgccgtgta-3’rt-qpcr-r：5
’‑
tggcctggaagtcctcctc-3’actin-f：5
’‑
gtgtcctgtccacccactctct-3’actin-r：5
’‑
ggaactcgttcacatcaacgttc-3’。

技术总结
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种ZmSAUR21基因、蛋白及其在调控苗期玉米根系发育的应用。在玉米中定点突变所述ZmSAUR21基因，主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等性状均显著降低；在玉米中过表达所述ZmSAUR21基因，主胚根轴根长、种子根轴根平均长度等性状均显著升高。因此，本发明为调控玉米苗期根系发育提供了宝贵的基因资源。发育提供了宝贵的基因资源。发育提供了宝贵的基因资源。


技术研发人员：李鹏程 杨爱清 李琦 王后苗 王芸芸 杨泽峰 徐辰武
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.07.24
技术公布日：2023/9/14