解酒护肝的鲨肝肽复配产品及其应用的制作方法

1.本发明涉及解酒护肝产品开发技术领域，具体涉及解酒护肝的鲨肝肽复配产品及其应用。


背景技术：

2.中国是全球人均酒精消费量最高的国家之一，酒精对于肝的伤害明显，中国超过五分之一的人群受到肝脏疾病的困扰，护肝养生产品成为大多数慢性肝损伤患者的选择；其次，现代化的生活习惯催生了大量熬夜人群，包括工作、学习或玩乐，研究表明，长期熬夜对肝脏有直接的伤害，甚至会诱发一些肝部疾病，危害人体健康。近年来，随着人们健康意识的不断提高，护肝、养肝的需求随之增加。目前，全球十大护肝养生品牌产品中，主要是以朝鲜蓟提取物、水飞蓟提取物等植提浓缩物为主成分，而关于蛋白肽类的解酒护肝产品相对较少。
3.鲨鱼，一种生活在深海中古老的鱼类，也是海洋中最精力充沛的动物之一，其肝脏占鲨鱼体重的15％～25％左右。研究表明鲨鱼肝脏中含有丰富的营养活性物质，可用于健脾补气、养肝明目、解毒敛疮，其也作为一种中药材，被记载于《中华本草》。目前，鲨鱼肝脏的研究聚焦在角鲨烯、鱼肝油等活性物质的研究利用，有关肝脏活性肽的研究相对较少，或是有关研究还处于较早期阶段。如专利cn200510037679.2即公开了一种热提法制备鲨肝肽，并对鲨肝肽预防/或治疗糖尿病及其并发症展开了动物实验验证研究。该专利方法存在提取不完全、肽生物活性不高等问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供解酒护肝的鲨肝肽复配产品及其应用。
5.本发明提供了解酒护肝的组合物，其包括牡蛎肽、纳豆提取物、枳椇子提取物和/或芦笋提取物中的至少一种和鲨肝肽。
6.进一步的，所述的组合物，包括以下组分及其质量：牡蛎肽10～17.5份、纳豆提取物3～9份、枳椇子提取物5～12.5份、芦笋提取物4～6份和鲨肝肽12.5～20份。
7.更进一步的，所述的组合物还包括木糖醇和麦芽糊精；所述木糖醇为17份，所述麦芽糊精为33～58份。
8.在本发明的有些具体实施例中，所述的组合物包括：牡蛎肽10份、纳豆提取物9份、枳椇子提取物5份、芦笋提取物6份、鲨肝肽20份、木糖醇17份和麦芽糊精33份。
9.本发明所述的组合物中，
10.所述鲨肝肽通过获得鲨鱼肝脏匀浆后经稀释、温育、取上清、第一超滤、酶解和第二超滤获得。
11.进一步的，
12.所述稀释的溶液为蒸馏水，所述蒸馏水与鲨鱼肝脏匀浆的质量比为1：1；
13.所述温育的条件为85℃～95℃，保温5min～10min；
14.所述酶解的条件为50℃～60℃反应4h～6h后90℃～95℃保温10min～20min；
15.所述酶解使用的酶为木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与所述第一超滤的滤液的质量比为1000：(2～4)；
16.所述第二超滤的条件为20kda/10kda/5kda的超滤膜串联超滤；
17.所述鲨鱼肝脏匀浆的获取包括以下步骤：2℃～8℃经第一次匀浆获得第一匀浆，将第一匀浆-20℃冷冻8～12h后40℃温育后进行第二次匀浆，获得所述鲨鱼肝脏匀浆。
18.更进一步的，在本发明的一些具体实施例中，
19.所述温育的条件为90℃，保温7.5min；酶解的条件为55℃反应5h后90℃保温20min；所述木瓜蛋白酶与所述第一超滤的滤液的质量比为1000：3时获得的鲨肝肽活性最佳。
20.本发明基于鲨肝肽的研究现状，采用生物酶解结合超滤等现代化技术，自鲨鱼肝脏中制得小分子活性肽，所述小分子活性肽主要功效物质包括分子量小于5000da的肽类，较市面上常见以水飞蓟、朝鲜蓟等植提物为主成分的解酒护肝产品，具有分子量更小、更易被机体吸收的特点。且本发明制备鲨肝肽先通过加热变性以过滤去除杂蛋白，再通过特定生物酶酶解大分子蛋白，较单一热水提取法或单一酶解法，具有蛋白肽收得率高、生物活性好及产品纯度高等特点，且工艺简单易操作。
21.本发明所述的组合物中，
22.所述牡蛎肽通过获得牡蛎肉匀浆后经稀释、酶解和超滤获得。
23.进一步的，
24.所述酶解的条件为48℃～52℃反应2h～3h后90℃～95℃保温10min～20min；
25.所述酶解使用的酶为木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与牡蛎肉匀浆的质量比为1000：(1～3)；
26.所述第二超滤的条件为20k/10k/5kda的超滤膜串联超滤；
27.所述牡蛎肉匀浆的获取包括以下步骤：2℃～8℃经第一次匀浆获得第一匀浆，将第一匀浆-20℃冷冻8～12h后40℃温育后进行第二次匀浆，获得所述鲨鱼肝脏匀浆。
28.更进一步的，在本发明的具体实施例中，酶解的条件为50℃反应2.5h后90℃保温20min；所述木瓜蛋白酶与所述第一超滤的滤液的质量比为1000：2时获得的牡蛎肽活性最佳。
29.本发明所述的组合物，经过鲨肝肽和牡蛎肽的制备工艺优化，获得具有最佳活性的鲨肝肽和牡蛎肽，将它们与纳豆提取物、枳椇子提取物、芦笋提取物进行复配，获得了所述具有解酒护肝功能的组合物，试验结果表明，本发明中所述鲨肝肽为主要功能物质，其中含有大量分子量≤5kd的肽类，将其与其他组分复配后经比例的优化，最终获得解酒护肝效果最优的样品3，所述样品3的组分及其分量为：牡蛎肽10份、纳豆提取物9份、枳椇子提取物5份、芦笋提取物6份、鲨肝肽20份、木糖醇17份和麦芽糊精33份。
30.本发明提供了所述的组合物在制备解酒护肝产品中的应用。
31.本发明提供了解酒护肝产品，其包括本发明所述的组合物和药学上可接受的辅料。
32.进一步的，本发明所述辅料包括载体、赋形剂、溶剂等，所述产品包括片剂、液剂、
粉剂或胶囊剂等，本发明对此不作限定。
33.本发明提供了解酒护肝的鲨肝肽复配产品及其应用，在进一步优化鲨肝肽、牡蛎肽的制备工艺的同时将它们与纳豆提取物、枳椇子提取物、芦笋提取物以及辅料木糖醇和麦芽糊精复配，获得了可解酒护肝的鲨肝肽复配产品，所述鲨肝肽复配产品能够加快急性醉酒小鼠的酒精代谢，保护肝脏细胞，具有可观的解酒护肝功效。
具体实施方式
34.本发明提供了解酒护肝的鲨肝肽复配产品及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
35.本发明主要提供了一种鲨肝肽复配产品及其制备方法。
36.本发明中所用的鲨肝肽、牡蛎肽为本公司自制产品，纳豆提取物、枳椇子提取物、芦笋提取物、木糖醇、麦芽糊精为市售品，其中鲨肝肽、牡蛎肽的制备工艺如下：
37.一、鲨肝肽的制备：
38.(1)原料预处理：低温细胞冷冻破碎技术
39.取健康幼年条纹斑竹鲨(体重600g～800g)肝脏，去除肝膜、韧带，纯化水浸洗多次；用搅碎机剪碎，在2℃～8℃下置于匀质机中匀浆处理，匀浆后的溶液置-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，然后加入等量蒸馏水搅拌稀释，使细胞破碎更完全，得匀浆稀释液。
40.(2)提取纯化：加热变性去杂蛋白、生物酶解及超滤技术
41.将上述匀浆稀释液水浴加热至85℃～95℃，保温5min～10min，离心，收集上清液，再通过30kda滤膜超滤，取滤液。将滤液水浴加热至50℃～60℃，加滤液重量0.2％～0.4％木瓜蛋白酶，搅拌反应4h～6h后，90℃～95℃保温10min～20min。保温结束后，经20k/10k/5kda的超滤膜串联超滤浓缩，取滤液，并置于-20℃冰箱保存，得鲨肝肽溶液。
42.(3)干燥：真空冷冻干燥
43.将-20℃保存的鲨肝肽样品，放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h，再放置真空冷冻干燥器中干燥至少30h，待含水量低于4.0％后取出，即得鲨肝肽。
44.二、牡蛎肽的制备：
45.(1)原料预处理：低温细胞冷冻破碎技术
46.取经检验合格的冻牡蛎肉，纯化水浸泡解冻并洗净沥干，在2℃～8℃下于胶体磨中进行匀浆破碎，匀浆后溶液放入-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，加3倍匀浆液重的纯化水，使细胞破碎更完全，得匀浆稀释液。
47.(2)提取纯化：生物酶解及超滤技术
48.取上述匀浆稀释液，加热至48℃～52℃，加入浆重0.1％～0.3％木瓜蛋白酶，搅拌反应2h～3h后，90℃～95℃保温10min～20min。保温结束后，将酶解液经20k/10k/5kda的滤膜串联超滤浓缩，取滤液，并置于-20℃冰箱保存，得牡蛎肽溶液。
49.(3)干燥：真空冷冻干燥
50.将-20℃保存的牡蛎肽样品，转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h，再放置真空冷冻干燥器中干燥至少30h，待含水量低于7.0％后取出，即得牡蛎肽。
51.三、鲨肝肽复配粉的制备：
52.将上述鲨肝肽、牡蛎肽与纳豆提取物、枳椇子提取物、芦笋提取物、木糖醇、麦芽糊精进行复配。配制方法：按配方量分别称取纳豆提取物、枳椇子提取物、芦笋提取物、木糖醇，待完全混合后，依次加入鲨肝肽、牡蛎肽及余量的麦芽糊精，继续搅拌20min～30min，于45℃烘干3h～5h，过100目筛，封装成袋，即得鲨肝肽复配粉。
53.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
54.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
55.实施例1鲨肝肽及牡蛎肽的制备
56.鲨肝肽的制备：取健康幼年条纹斑竹鲨(体重600～800g)肝脏2.5kg，去除肝膜、韧带，纯化水浸洗多次；用搅碎机剪碎，在2～8℃下置于匀质机中匀浆处理，匀浆后的溶液置-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，然后加入等量蒸馏水搅拌稀释，使细胞破碎更完全。将上述匀浆稀释液水浴加热至85℃，保温5min，离心，收集上清液，再通过30kda滤膜超滤，滤液水浴加热至50℃，搅拌加入滤液重量0.2％木瓜蛋白酶，反应4h后，90℃保温10min。保温结束后，酶解液经20k/10k/5kda的超滤膜串联超滤浓缩，滤液置于-20℃冰箱冷冻保存12h，再转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h后，放置于真空冷冻干燥器中干燥30h，得鲨肝肽冻干粉228.8g，肽含量为45.9％，生物活性5.5，提取率为4.2％。
57.牡蛎肽的制备：取经检验合格的冻牡蛎肉2.5kg，纯化水浸泡解冻并洗净沥干，在2～8℃下于胶体磨中进行匀浆破碎，匀浆后溶液放入-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，加3倍匀浆液重的纯化水，使细胞破碎更完全。将上述匀浆稀释液，加热至48℃，加入浆重0.1％木瓜蛋白酶，搅拌反应2h后，90℃保温10min。保温结束后，将酶解液经20k/10k/5kda的滤膜串联超滤浓缩，滤液置于-20℃冰箱冷冻保存12h后，转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h，再放置于真空冷冻干燥器中干燥30h，得牡蛎肽冻干粉269.5g，肽含量56.8％，生物活性4.9，提取率为6.1％。
58.实施例2鲨肝肽及牡蛎肽的制备
59.鲨肝肽的制备：取健康幼年条纹斑竹鲨(体重600～800g)肝脏2.5kg，去除肝膜、韧带，纯化水浸洗多次；用搅碎机剪碎，在2～8℃下置于匀质机中匀浆处理，匀浆后的溶液置-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，然后加入等量蒸馏水搅拌稀释，使细胞破碎更完全。将上述匀浆稀释液水浴加热至90℃，保温7.5min，离心，收集上清液，再通过30kda滤膜超滤，滤液水浴加热至55℃，搅拌加入滤液重量0.3％木瓜蛋白酶，反应5h后，95℃保温15min。保温结束后，酶解液经20k/10k/5kda的超滤膜串联超滤浓缩，滤液置于-20℃冰箱冷冻保存12h，再转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h后，放置于真空冷冻干燥器中干燥30h，得鲨肝肽冻干粉232.6g，肽含量为47.3％，生物活性5.7，提取率为4.4％。
60.牡蛎肽的制备：取经检验合格的冻牡蛎肉2.5kg，纯化水浸泡解冻并洗净沥干，在2～8℃下于胶体磨中进行匀浆破碎，匀浆后溶液放入-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，加3倍匀浆液重的纯化水，使细胞破碎更完
全。将上述匀浆稀释液，加热至50℃，加入浆重0.2％木瓜蛋白酶，搅拌反应2.5h后，95℃保温15min。保温结束后，将酶解液经20k/10k/5kda的滤膜串联超滤浓缩，滤液置于-20℃冰箱冷冻保存12h后，转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h，再放置于真空冷冻干燥器中干燥30h，得牡蛎肽冻干粉272.6g，肽含量57.7％，生物活性5.1，提取率为6.3％。
61.实施例3鲨肝肽及牡蛎肽的制备
62.鲨肝肽的制备：取健康幼年条纹斑竹鲨(体重600～800g)肝脏2.5kg，去除肝膜、韧带，纯化水浸洗多次；用搅碎机剪碎，在2～8℃下置于匀质机中匀浆处理，匀浆后的溶液置-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，然后加入等量蒸馏水搅拌稀释，使细胞破碎更完全。将上述匀浆稀释液水浴加热至95℃，保温10min，离心，收集上清液，再通过30kda滤膜超滤，滤液水浴加热至60℃，搅拌加入滤液重量0.4％木瓜蛋白酶，反应6h后，95℃保温20min。保温结束后，酶解液经20k/10k/5kda的超滤膜串联超滤浓缩，滤液置于-20℃冰箱冷冻保存12h，再转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h后，放置于真空冷冻干燥器中干燥30h，得鲨肝肽冻干粉234.1g，肽含量为48.5％，生物活性5.3，提取率为4.5％。
63.牡蛎肽的制备：取经检验合格的冻牡蛎肉2.5kg，纯化水浸泡解冻并洗净沥干，在2～8℃下于胶体磨中进行匀浆破碎，匀浆后溶液放入-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，加3倍匀浆液重的纯化水，使细胞破碎更完全。将上述匀浆稀释液，加热至50℃，加入浆重0.3％木瓜蛋白酶，搅拌反应3h后，95℃保温20min。保温结束后，将酶解液经20k/10k/5kda的滤膜串联超滤浓缩，滤液置于-20℃冰箱冷冻保存12h后，转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h，再放置于真空冷冻干燥器中干燥30h，得牡蛎肽冻干粉273.5g，肽含量58.8％，生物活性4.8，提取率为6.4％。
64.实施例4鲨肝肽及牡蛎肽的制备
65.鲨肝肽的制备：取健康幼年条纹斑竹鲨(体重600～800g)肝脏2.5kg，去除肝膜、韧带，纯化水浸洗多次；用搅碎机剪碎，在2～8℃下置于匀质机中匀浆处理，匀浆后的溶液置-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，然后加入等量蒸馏水搅拌稀释，使细胞破碎更完全。将上述匀浆稀释液水浴加热至90℃，保温7.5min，离心，收集上清液，再通过30kda滤膜超滤，滤液水浴加热至55℃，搅拌加入滤液重量0.3％木瓜蛋白酶，反应5h后，90℃保温20min。保温结束后，酶解液经20k/10k/5kda的超滤膜串联超滤浓缩，滤液置于-20℃冰箱冷冻保存12h，再转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h后，放置于真空冷冻干燥器中干燥30h，得鲨肝肽冻干粉233.1g，肽含量为47.5％，生物活性5.9，提取率为4.4％。
66.牡蛎肽的制备：取经检验合格的冻牡蛎肉2.5kg，纯化水浸泡解冻并洗净沥干，在2～8℃下于胶体磨中进行匀浆破碎，匀浆后溶液放入-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，加3倍匀浆液重的纯化水，使细胞破碎更完全。将上述匀浆稀释液，加热至50℃，加入浆重0.2％木瓜蛋白酶，搅拌反应2.5h后，90℃保温20min。保温结束后，将酶解液经20k/10k/5kda的滤膜串联超滤浓缩，滤液置于-20℃冰箱冷冻保存12h后，转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h，再放置于真空冷冻干燥器中干燥30h，得牡蛎肽冻干粉273.1g，肽含量57.5％，生物活性5.2，提取率为6.3％。
67.其中鲨肝肽、牡蛎肽的提取率计算公式如下：
[0068][0069]
式中：w1：鲨肝肽/牡蛎肽冻干粉的称重量，g；
[0070]
p：鲨肝肽/牡蛎肽冻干粉的肽含量，％；
[0071]
w：实验用鲨鱼肝脏/牡蛎肉的称重量，g。
[0072]
将上述各实施案例制得的鲨肝肽、牡蛎肽的样品情况汇总如下表：
[0073]
表1.各实施案例中鲨肝肽技术指标情况
[0074]
实施例肽含量/％生物活性提取率/％实施例145.95.54.2实施例247.35.74.4实施例348.55.34.5实施例447.55.94.4
[0075]
表2.各实施案例中牡蛎技术指标情况
[0076]
实施例肽含量生物活性提取率/％实施例156.84.96.1实施例257.75.16.3实施例358.84.86.4实施例457.55.26.3
[0077]
通过对上述实施案例制得的鲨肝肽、牡蛎肽冻干粉的肽含量、提取率、生物活性及试验周期、能耗等综合对比、评估，初步将实施例4作为最优实施案例。
[0078]
实施例5不同分子量鲨肝肽及牡蛎肽的筛选研究
[0079]
1.不同分子量的鲨肝肽的制备：取健康幼年条纹斑竹鲨(体重600～800g)肝脏2.5kg，去除肝膜、韧带，纯化水浸洗多次；用搅碎机剪碎，在2～8℃下置于匀质机中匀浆处理，匀浆后的溶液置-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，然后加入等量蒸馏水搅拌稀释，使细胞破碎更完全。将上述匀浆稀释液水浴加热至90℃，保温7.5min，离心，收集上清液，再通过30kda滤膜超滤，滤液水浴加热至55℃，搅拌加入滤液重量0.3％木瓜蛋白酶，反应5h后，90℃保温20min。将保温结束后的酶解液依次通过截留分子量20kda、10kda、5kda的滤膜超滤浓缩，分别收集各滤出液，并将其置于-20℃冰箱冷冻保存12h后，转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h，再放置于真空冷冻干燥器中干燥30h，即获得不同分子量的鲨肝肽样品1(》10kda)、鲨肝肽样品2(5～10kda)、鲨肝肽样品3(≤5kda)。
[0080]
2.不同分子量的牡蛎肽的制备：取经检验合格的冻牡蛎肉2.5kg，纯化水浸泡解冻并洗净沥干，在2～8℃下于胶体磨中进行匀浆破碎，匀浆后溶液放入-20℃的冰箱中冷冻过夜，次日取出在40℃左右的水浴锅中融化后，再次匀浆并称重，加3倍匀浆液重的纯化水，使细胞破碎更完全。将上述匀浆稀释液，加热至50℃，加入浆重0.2％木瓜蛋白酶，搅拌反应2.5h后，90℃保温20min。将保温结束后的酶解液依次通过截留分子量20kda、10kda、5kda的滤膜超滤浓缩，分别收集各滤出液，并将其置于-20℃冰箱冷冻保存12h后，转放入-80℃的低温冰箱中冷冻5h，再放置于真空冷冻干燥器中干燥30h，即获得不同分子量的牡蛎肽样品1(》10kda)、牡蛎肽样品2(5～10kda)、牡蛎肽样品3(≤5kda)。
[0081]
3.不同分子量的鲨肝肽、牡蛎肽的功能特性研究：
[0082]
3.1不同分子量鲨肝肽溶解性测定
[0083]
据文献资料可知，氮溶解指数(nsi)可以被用来确定蛋白质水解产物的溶解性。取鲨肝肽样品样品1(》10kda)、鲨肝肽样品2(5～10kda)、鲨肝肽样品3(≤5kda)各1g，加纯化水制成0.01g/ml的肽溶液，离心取上清液。采用全自动凯氏定氮仪分别测定上清液和鲨肝肽样品1～3的氮含量，根据公式计算不同分子量鲨肝肽的溶解性。
[0084][0085]
3.2不同分子量鲨肝肽的生物活性测定
[0086]
采用mtt比色法进行鲨肝肽刺激物质活性的测定，具体如下：
[0087]
试剂准备：根据检测要求分别配制试验用的无钙镁磷酸缓冲液pbs(ph7.3)、rpmi-1640培养液、rpmi-1640-10％nbs、细胞消化液及mtt溶液。
[0088]
供试品溶液的制备：取样品适量，用rpmi-1640培养液制成每1ml含100μg蛋白质的供试品溶液。
[0089]
测定：96孔培养板，每孔加入200μl以rpmi 1640-10％ fcs培养液稀释的细胞悬液5
×
104cells/ml，培养6h后弃去上清，加入样品溶液，以未加样品的细胞悬液作为对照，以rpmi-1640培养液作为空白调零，继续在37℃，5％co2条件下培养36h后，弃去上清，加入0.5mg/ml mtt溶液100μl，孵育6h后弃去上清，再加入dmso溶解反应产物formazan 100μl，37℃摇床15min使沉淀充分溶解，酶联免疫检测仪测定570nm处吸光值，以复孔求得a570nm均值，并计算刺激指数(index stimulator，is)。
[0090]
刺激指数is＝a
570nm
(供试)/a
570nm
(对照)
[0091]a570nm(供试)
：供试品组各复孔吸光值的均值；
[0092]a570nm(对照)
：对照组各复孔吸光值的均值。
[0093]
3.3鲨肝肽分子量分布测定
[0094]
根据体积排阻色谱理论，被测样品中组分将按照分子量由大到小的顺序被洗脱下来，以5kda肽、10kda肽作为对照品，以经20kda过滤的鲨肝肽为供试品，根据高分子物质的保留时间差异大小区别不同分子量范围的肽。照高效液相色谱法测定，记录色谱图，按面积归一化法计算高分子物质的量。
[0095]
表3.各分子量鲨肝肽功能性指标情况
[0096][0097][0098]
根据上述研究可知，通过酶解制得的鲨肝肽的分子量主要集中在《5kda的范围，且不同分子量鲨肝肽的功能性指标差异较明显，其中分子量《5kda的鲨肝肽在溶解性、生物活性指标上均最优。
[0099]
3.4不同分子量牡蛎肽的溶解度测定
[0100]
按照3.1项下的操作测定。
[0101]
3.5不同分子量牡蛎肽的含量测定
[0102]
按照3.3项下的操作测定。
[0103]
表4.各分子量牡蛎肽功能性指标情况
[0104]
分子量范围溶解性/％分面积百分比/％》10kda47.70.305～10kda78.93.61《5kda93.696.09
[0105]
根据上述研究可知，通过酶解制得的牡蛎肽的分子量主要集中在《5kda的范围，且该范围内的牡蛎肽溶解性最佳。
[0106]
实施案例6：鲨肝肽复配粉样品的制备
[0107]
1.根据表5中的配料表准备所需的原辅料；
[0108]
表5.鲨肝肽复配粉配料表
[0109][0110]
2.鲨肝肽复配粉样品1的制备：
①
将试验需用的原辅料：鲨肝肽、牡蛎肽与纳豆提取物、枳椇子提取物、芦笋提取物、木糖醇、麦芽糊精置于紫外灭菌箱中灭菌2min，再传送至经净化的配制室中；
②
在10万级净化的环境下，按照表5中的配方量分别称取纳豆提取物30g、枳椇子提取物125g、芦笋提取物45g、木糖醇170g，置于混合机(syh-5)中均匀混合后，再称取鲨肝肽125g、牡蛎肽175g，依次加入上述混合机中混合完全，最后加入330g麦芽糊精，继续搅拌20min，使物料完全混合；
③
将上述复配物置于45℃下烘干3h后，100目过筛，再分装至经紫外灭菌的复合膜袋中，10g/袋，共得鲨肝肽复配粉93袋。
[0111]
3.根据项2.0的操作步骤，按照表1中各原辅料的用量，分别制得鲨肝肽复配粉样品2共91袋，样品3共92袋，样品4共90袋，样品5共93袋，样品6共93袋。
[0112]
实施案例7鲨肝肽复配粉质量检测
[0113]
对上述样品1～7的物化指标检测分析，结果如下：
[0114]
表6.鲨肝肽复配粉各样品质量检测结果
[0115][0116]
实施案例8鲨肝肽复配粉解酒护肝的功效实验研究
[0117]
1.小鼠急性醉酒模型的建立
[0118]
选取健康spf级昆明种小鼠，雌雄各半，18～22g，40只，随机分为4组，每组10只，禁食不禁水12h后，分别以10.0ml/kg、12.5ml/kg、15.0ml/kg及17.5ml/kg的剂量灌胃红星二锅头(56
°
，北京红星股份有限公司)，观察其步态和活动情况，以小鼠翻正反射消失与存在为判定指标，记录小鼠的醉酒只数、死亡只数、耐受时间、醉酒维持时间。
[0119]
表7.不同灌酒剂量小鼠急性醉酒试验结果
[0120][0121]
注：耐受时间为从灌胃白酒到翻正反射完全消失的时间；醉酒维持时间为从翻正反射消失到恢复的时间。
[0122]
从表7可知，随着灌酒剂量的增加，小鼠醉酒率、死亡率及醉酒维持时间逐渐上升，当灌酒剂量为15.0ml/kg时，醉酒率达100％，死亡率为0；当灌酒剂量为17.5ml/kg时，醉酒率达100％，但出现小鼠死亡。由此可知，15.0ml/kg的灌酒剂量能使小鼠达到最高醉酒率且最低死亡率，因此小鼠急性醉酒模型最佳灌酒剂量为15.0ml/kg。
[0123]
2.鲨肝肽复配粉解酒功效实验
[0124]
选取135只健康小鼠，随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组及试验组(样品1～6)，每组15只，共9组。阳性对照组、试验组(样品1～6)分别灌胃10.0ml/kg的海王金樽片、复配粉样品1～6，空白对照组、模型对照组灌胃10ml/kg的生理盐水，连续灌胃7d，于末次灌胃30min后，正常组给予15.0ml/kg生理盐水，其余各组均灌胃15.0ml/kg的56
°
二锅头，观察各组小鼠的醉酒及死亡情况。
[0125]
灌胃白酒1h后，小鼠眼球取血，在4℃下离心5min(转速3500r/min)，取上清液，使用血乙醇试剂盒测定血清中的乙醇浓度。取血后立即断颈处死小鼠，解剖取出肝脏，再取少量肝脏用0.9％生理盐水匀浆制成0.1g/ml的肝组织匀浆液，在4℃下离心5min(转速3500r/
min)，取上清液，用adh elisa检测试剂盒测定小鼠肝组织匀浆液adh、aldh活力。
[0126]
表8.各组试验小鼠血清中乙醇浓度测定结果
[0127][0128][0129]
饮酒后乙醇被胃、小肠吸收，经血液循环进入全身脏器，并绝大部分乙醇通过肝脏进行代谢。因此，酒精的摄入会使血液中乙醇浓度升高。从表8可知，与空白对照组比较，模型对照组小鼠的血液乙醇浓度显著升高，表明灌胃白酒后，小鼠血液中乙醇含量快速上升，进而提示急性醉酒模型建立成功；与模型对照组比较，阳性对照组、试验组1～6的小鼠血液乙醇浓度均降低，表明鲨肝肽复配粉能显著降低急性醉酒小鼠的血液乙醇浓度，且样品3功效作用最佳。
[0130]
另外，与试验组5比较，试验组6的小鼠血液乙醇浓度略低于试验组5，说明随着活性物质的增加产品的功效作用也随之增强，而与试验组5比较，试验组4的小鼠血液乙醇浓度低于试验组5，说明活性以鲨肝肽为主成分的产品功效更优，进一步地，试验组6与试验组4比较，试验组6的小鼠血液乙醇浓度高于试验组4，说明虽然试验组6活性物质总量大，但样品配方中没有鲨肝肽，其效果低于试验组4，进而表明鲨肝肽在本产品中具有较主要的作用。
[0131]
表9.各组试验小鼠肝组织匀浆液的adh、aldh活力测定结果
[0132]
组别adh/(u/ml)aldh/(u/ml)空白对照组11.62
±
2.6773.01
±
5.33模型对照组27.98
±
2.12120.32
±
5.67阳性对照组44.29
±
3.01188.07
±
10.23试验组1(样品1)39.16
±
1.79162.36
±
7.66试验组2(样品2)41.57
±
2.56172.92
±
8.36试验组3(样品3)45.36
±
1.57188.68
±
6.21试验组4(样品4)38.01
±
2.93157.29
±
6.83试验组5(样品5)34.89
±
3.03145.29
±
7.51试验组6(样品6)35.75
±
3.11150.33
±
8.47
[0133]
乙醇在体内可通过氧化和非氧化方式进行代谢，其中氧化代谢主要由肝脏进行。肝脏中含有乙醇脱氢酶(adh)和乙醛脱氢酶(aldh)，乙醇进入肝脏后先由adh氧化为带毒性
的乙醛，再通过aldh氧化为无毒的乙酸，最终转化为co2和水排出体外。作为酒精代谢的关键用酶，adh和aldh的活力能影响血液中乙醇含量，因此其活力大小可提示解酒效果。
[0134]
从表9可知，与空白对照组比较，模型对照组小鼠的肝组织匀浆液中adh和aldh活性显著增加，表明作为机体应激反应，急性醉酒会致使肝脏中adh和aldh活性升高；与模型对照组比较，阳性对照组、试验组1～6的小鼠的肝组织匀浆液中adh和aldh活性均有增加，表明鲨肝肽复配粉能更加有效增强adh活性以促进乙醇快速转化为乙醛，同时提高aldh活性以提升乙醛转化为乙酸的速度，降低乙醛对机体的毒害作用，从而加快乙醇代谢，有助于机体的快速解酒。
[0135]
另外，与试验组5比较，试验组6小鼠的肝组织匀浆液中adh和aldh活性略高于试验组5，说明随着活性物质的增加产品的功效作用也随之增强，而与试验组5比较，试验组4小鼠的肝组织匀浆液中adh和aldh活性高于试验组5，表明在活性物质总量相同的情况下，以鲨肝肽为主成分的产品功效更优，进一步地，试验组6与实验组4比较，虽然试验组6活性物质总量大，但样品配方中并没有鲨肝肽，其效果低于实验组4，进而表明鲨肝肽在本产品中具有较主要的作用。
[0136]
因此，通过小鼠急性醉酒试验对鲨肝肽复配粉解酒功效研究表明，饮酒前灌胃小鼠鲨肝肽复配粉，能有效提升小鼠肝脏中乙醇脱氢酶(adh)和乙醛脱氢酶(aldh)的活力，促进小鼠体内乙醇代谢速度，降低血液中乙醇浓度，从而表明鲨肝肽复配粉具有良好的解酒功效。另外，综合上述试验结果可知，鲨肝肽复配粉解酒功效中，鲨肝肽具有主要作用，且组合配方中的各功效物质具有一定的协同作用。
[0137]
3.鲨肝肽复配粉护肝功效实验
[0138]
依据上述2.0项下的试验方法灌胃各组小鼠，禁食不禁水12h后，眼球取血，在4℃下离心5min(转速3500r/min)，取上清液，用alt试剂盒、ast试剂盒分别测定alt活力、ast活力。取血后立即断颈处死小鼠，解剖取出肝脏，再取少量肝脏用0.9％生理盐水匀浆制成0.1g/ml的肝组织匀浆液，在4℃下离心5min(转速3500r/min)，取上清液，用gsh试剂盒、sod试剂盒分别测定gsh含量及sod活力。
[0139]
表10.各组试验小鼠血清中alt、ast活力测定结果
[0140]
组别alt/(u/l)ast/(u/l)空白对照组17.22
±
3.2118.87
±
3.53模型对照组50.06
±
6.9653.69
±
6.82阳性对照组21.27
±
4.2233.77
±
5.31试验组1(样品1)31.44
±
5.5538.85
±
4.89试验组2(样品2)27.13
±
6.1936.56
±
5.88试验组3(样品3)20.52
±
4.8632.15
±
6.26试验组4(样品4)33.23
±
5.1642.69
±
5.49试验组5(样品5)38.79
±
5.6745.33
±
6.01试验组6(样品6)35.71
±
6.2744.51
±
7.22
[0141]
谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)主要存在于肝细胞和细胞线粒体中，机体正常情况下，血液中alt和ast维持在稳定且较低水平，当酒精摄入，肝细胞受到破坏导致坏死，使alt和ast释放入血，引起转氨酶快速升高，所以alt和ast活力的升高可作为机体肝细
胞发生损害的指标。从表10可知，与空白对照组比较，模型对照组小鼠的血液alt、ast活力显著升高，表明酒精致使小鼠肝细胞急速坏死，提示急性醉酒模型建立成功；与模型对照组比较，阳性对照组、试验组1～6的小鼠血液alt、ast活力均有降低，表明鲨肝肽复配粉能够有效维持急性醉酒小鼠血液中alt、ast活力趋于正常且稳定的水平，进而表明了其对肝细胞具有较好的保护作用。
[0142]
另外，与试验组5比较，试验组6小鼠血液中alt和ast活力略低于试验组5，说明随着活性物质的增加产品的功效作用也随之增强，而与试验组5比较，试验组4的小鼠血液中alt和ast活力低于试验组5，表明在活性物质总量相同的情况下，以鲨肝肽为主成分的产品功效更优，进一步地，试验组6与试验组4比较，试验组6的小鼠血液中alt和ast活力大于试验组4，说明虽然试验组6活性物质总量大，但样品配方中没有鲨肝肽，其效果低于试验组4，进而表明鲨肝肽在本产品中具有较主要的作用。
[0143]
表11.各组试验小鼠肝组织匀浆液中gsh含量、sod活力测定结果
[0144][0145][0146]
酒精代谢会产生大量自由基，自由基过量对机体有害。超氧化物歧化酶(sod)是一种自由基清除剂，谷胱甘肽(gsh)是一种抗氧化物质，均能有效清除掉机体内的自由基。当机体过量饮酒时，sod、gsh会被大量消耗，以减少因饮酒产生的自由基对肝脏的损害。
[0147]
从表11可知，与空白对照组比较，模型对照组小鼠的肝组织匀浆液中sod、gsh活力显著降低，说明急性醉酒会大量损耗sod、gsh；与模型对照组比较，阳性对照组、试验组1～6的小鼠肝组织匀浆液中sod、gsh活力明显升高，表明鲨肝肽复配粉能有效提升急性醉酒小鼠肝脏中sod、gsh活力，增加机体抗氧化能力，清除因乙醇代谢产生的自由基，减少其对肝脏的损耗，进而对肝脏具有较好的保护作用。
[0148]
另外，与试验组5比较，试验组6小鼠的肝组织匀浆液中sod、gsh活力略高于试验组5，说明随着活性物质的增加产品的功效作用也随之增强，而与试验组5比较，试验组4小鼠的肝组织匀浆液中sod、gsh活力高于试验组5，表明在活性物质总量相同的情况下，以鲨肝肽为主成分的产品功效更优，进一步地，试验组6与试验组4比较，试验组6的小鼠的肝组织匀浆液中sod、gsh活力低于试验组4，说明虽然试验组6活性物质总量大，但样品配方中没有鲨肝肽，其效果低于试验组4，进而表明鲨肝肽在本产品中具有较主要的作用。
[0149]
因此，通过小鼠急性醉酒试验对鲨肝肽复配粉护肝功效研究表明，饮酒前灌胃小鼠鲨肝肽复配粉，小鼠体内的谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)活力能被维持趋于正常
且稳定的水平，同时其能提升小鼠体内超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽(gsh)的活力，增强机体自由基的代谢，减轻酒精对肝脏的损害。另外，综合上述试验结果可知，鲨肝肽复配粉护肝功效中，鲨肝肽具有主要作用，且组合配方中的各功效物质具有一定的协同作用。
[0150]
综合上述的试验研究结果可知，鲨肝肽复配粉具有解酒功效，并对酒精引起的肝损伤具有保护作用，且各功效物质具有一定的协同作用，除此之外，在鲨肝肽复配解酒护肝的功效作用中，鲨肝肽具有主要作用。
[0151]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.解酒护肝的组合物，其特征在于，包括牡蛎肽、纳豆提取物、枳椇子提取物和/或芦笋提取物中的至少一种和鲨肝肽。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，包括以下组分及其质量：牡蛎肽10～17.5份、纳豆提取物3～9份、枳椇子提取物5～12.5份、芦笋提取物4～6份和鲨肝肽12.5～20份。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，还包括木糖醇和麦芽糊精；所述木糖醇为17份，所述麦芽糊精为33～58份。4.根据权利要求1～3任一项所述的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：牡蛎肽10份、纳豆提取物9份、枳椇子提取物5份、芦笋提取物6份、鲨肝肽20份、木糖醇17份和麦芽糊精33份。5.根据权利要求1～4任一项所述的组合物，其特征在于，所述鲨肝肽通过获得鲨鱼肝脏匀浆后经稀释、温育、取上清、第一超滤、酶解和第二超滤获得。6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述稀释的溶液为蒸馏水，所述蒸馏水与鲨鱼肝脏匀浆的质量比为1：1；所述温育的条件为85℃～95℃，保温5min～10min；所述酶解的条件为50℃～60℃反应4h～6h后90℃～95℃保温10min～20min；所述酶解使用的酶为木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与所述第一超滤的滤液的质量比为1000：(2～4)；所述第二超滤的条件为20kda/10kda/5kda的超滤膜串联超滤；所述鲨鱼肝脏匀浆的获取包括以下步骤：2℃～8℃经第一次匀浆获得第一匀浆，将第一匀浆-20℃冷冻8～12h后40℃温育后进行第二次匀浆，获得所述鲨鱼肝脏匀浆。7.根据权利要求1～4任一项所述的组合物，其特征在于，所述牡蛎肽通过获得牡蛎肉匀浆后经稀释、酶解和超滤获得。8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述酶解的条件为48℃～52℃反应2h～3h后90℃～95℃保温10min～20min；所述酶解使用的酶为木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与牡蛎肉匀浆的质量比为1000：(1～3)；所述第二超滤的条件为20kda/10kda/5kda的超滤膜串联超滤；所述牡蛎肉匀浆的获取包括以下步骤：2℃～8℃经第一次匀浆获得第一匀浆，将第一匀浆-20℃冷冻8～12h后40℃温育后进行第二次匀浆，获得所述鲨鱼肝脏匀浆。9.权利要求1～3任一项所述的组合物在制备辅助酒精分解、预防或修复机体肝损伤产品中的应用。10.解酒护肝产品，其特征在于，包括权利要求1～8任一项所述的组合物和药学上可接受的辅料。

技术总结
本发明涉及解酒护肝产品开发技术领域，具体涉及解酒护肝的鲨肝肽复配产品及其应用。本发明提供了解酒护肝的鲨肝肽复配产品及其应用，在进一步优化鲨肝肽、牡蛎肽的制备工艺的同时将它们与纳豆提取物、枳椇子提取物、芦笋提取物以及辅料木糖醇和麦芽糊精复配，获得了可解酒护肝的鲨肝肽复配产品，所述鲨肝肽复配产品能够加快急性醉酒小鼠的酒精代谢，保护肝脏细胞，具有可观的解酒护肝功效。具有可观的解酒护肝功效。


技术研发人员：高浚铭 刘蒙 马丽芳 周天琼
受保护的技术使用者：杭州华津药业股份有限公司
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/9/14