一种富硒葛仙米的培养方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种富硒葛仙米的培养方法。


背景技术：

2.葛仙米，学名为拟球状念珠藻(nostoc sphaeroides)，是一种具有较高营养价值的可食用稻田固氮蓝藻。葛仙米含有丰富的蛋白质、脂肪酸、矿物质和维生素。同时，葛仙米中的多糖、藻胆蛋白和一些脂类物质具有抗氧化、抗炎症、调节免疫力和降低胆固醇含量的功能。除了食用价值外，葛仙米在农田氮素输入方面也发挥着巨大的作用。qin等人(2013)研究发现，稻田养殖葛仙米能显著增加土壤表层(0-5cm)和亚表层(5-10cm)中的氮素含量(j.appl.phycol.2013,25:1737-1745)。上世纪90年代，我国刘永定等研究人员对葛仙米的人工养殖进行了科研攻关，并获得成功。由于野生葛仙米资源日益减少，目前市场上流通的葛仙米主要为人工养殖的葛仙米。
3.硒(selenium，se)是人体必需的微量元素之一，有降血压、调节免疫、防癌抗癌等重要的生理作用。然而硒在我国分布十分不均衡，加之人体自身不能合成硒，必须从食物中获取，因此在我国约2/3的地区、近7亿人口缺硒，共有22个省、72％的县处于缺硒状态。硒摄入量长期缺乏时会引起克山病和大骨节病等一系列生理疾病。而且硒还可以与其他的一些重金属元素有拮抗作用，食用富硒食品既可以增强体质，达到预防疾病的目的，还可以预防人体重金属元素中毒。而硒在自然界主要有两种存在形式：无机硒和有机硒，无机硒一般指亚硒酸钠和硒酸钠，从金属矿藏的副产品中获得，无机硒有较大的毒性，且不易被吸收，不适合人和动物使用；在人体中具有生物活性的是有机硒，硒在生物体内大多数以硒代氨基酸的形式存在。因此，富硒有机产品对于我国硒摄入不足人群的健康状况改善具有重要意义。
4.近年来，富硒葛仙米的开发已成为葛仙米产业的重要发展方向，因为葛仙米中的蛋白质含量高，组成蛋白质的氨基酸种类丰富，为富硒培养提供了物质基础。中国专利文献cn109392693a公开了一种人工养殖富硒葛仙米的方法，通过向葛仙米培养基中添加亚硒酸钠来获得富硒葛仙米，硒含量在350ppm-2000ppm，葛仙米直径达到0.8-1.4cm，其中蛋白质含量达到52％以上，营养价值丰富；虽然该方法获得葛仙米中的硒含量较高，但是所采用的硒源是亚硒酸钠，是一种剧毒试剂，消费者可能很难接受；中国专利文献cn109355230a公开了一种葛仙米的富硒培养技术，通过在葛仙米富硒生产藻种的改良bg-110液体培养基中加入亚硒酸钠，使硒的最终浓度达到1-30mg/l，该富硒的培养方法仍然是以添加剧毒的亚硒酸钠来获得富硒葛仙米，也存在消费者难以接受的问题；中国专利文献cn110257308a公开了一种富有机硒葛仙米的培养方法，该方法利用富硒固体培养基将蛹虫草菌种培养成富硒蛹虫草子实体，然后采用酶解的方法获得富含硒代氨基酸的富硒原液，再利用富硒液体培养葛仙米，获得富硒葛仙米，该方法从有机硒的角度入手，获得富硒葛仙米，尽管该方法安全性较好，但是操作起来麻烦，而且涉及到酶解的程序，生产成本较高。
50mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cuso
4 0.02mg/l。
22.本发明通过设置低硫培养基配方，减少培养基中的硫元素养分，在不影响葛仙米生长和形态发育的条件下长效增加葛仙米对硒的吸收能力。
23.进一步的，所述步骤s5中收获的葛仙米直径大小为5-8mm。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
25.1、本发明提供的富硒葛仙米的培养方法在富硒葛仙米培育过程中，利用富硒温泉水配制全营养培养基，充分利用富硒温泉水中的硒源，摒弃外源添加硒酸钠或亚硒酸钠的方法，避免了添加硒酸钠或亚硒酸钠存在的健康风险，操作简单，安全性好和成本低。
26.2、本发明提供的富硒葛仙米的培养方法在葛仙米的培养基中加入了甘油磷酸二钠，既给葛仙米提供了更容易吸收的磷素养分，还利用葛仙米生物合成的化学计量特性，以甘油磷酸促进葛仙米的固氮活性，刺激了葛仙米对其它养分元素的吸收，提高了葛仙米的生长和代谢活性，使葛仙米能够以出芽的方式快速产生种子，促进葛仙米培养。
27.3、本发明提供的富硒葛仙米的培养方法在硫与硒共代谢的基础上，构建了无硫诱导培养基配方和低硫培养基配方来提高葛仙米吸收硒能力，实现了通过短时间3天的硫饥饿，提高葛仙米对硫和硒的摄取能力，也在不影响葛仙米生长和形态发育的条件下长效增加葛仙米对硒的吸收能力。
具体实施方式
28.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
29.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
30.本发明实施例及对比例所用的含硒温泉水取于江西省地质局山水温泉疗养院，水质特征如下：硒7.8μg/l，na
+
15mg/l,k
+
1.1mg/l，mg
2+
0.8mg/l，ca
2+
7.3mg/l，h2sio
3 56mg/l，cl-5.7mg/l，so
42-1.2mg/l，co
32-46mg/l，f-8.0mg/l，ph 7.3。
31.实施例1、本发明富硒葛仙米的培养
32.本实施例的富硒葛仙米的培养方法包括如下步骤：
33.s1、用硒含量为5-8μg/l的温泉水(取于江西省地质局山水温泉疗养院)配置葛仙米全营养培养基；其中葛仙米全营养培养基配方为：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po
4 30mg/l，mgso
4 60mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co
3 50mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cuso
4 0.02mg/l和琼脂2％，将培养基配方物质在121摄氏度高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完毕后，在培养基凝固前倾倒到培养皿中，静止凝固，得到全营养固体培养基，备用；
34.s2、将葛仙米球形群体用水洗净，用体积浓度为75％乙醇表面消毒，然后用无菌水清洗3次，再将葛仙米匀浆获得丝状藻浆，然后将葛仙米藻浆涂布在步骤s1所得的全营养固体培养基表面，于温度25℃，光照强度为30μmol
·
m-2
·
s-1
的条件下培养，获得葛仙米一级种子；
35.s3、将葛仙米一级种子转移到全营养液体培养基中，在5l玻璃罐中进行光照通气
培养，直至葛仙米直径大小为3-4mm左右，获得葛仙米二级种子；
36.s4、用8目的不锈钢筛盘收集大于或等于3mm的葛仙米二级种子球体，将其转入到用富硒温泉水配置的无硫培养基中，进行硫饥饿培养3天，获得硫饥饿培养物；其中无硫培养基的配方为：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po
4 30mg/l，mgcl
2 40mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta 5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co
3 50mg/l，cocl
2 1mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cucl
2 0.02mg/l；
37.s5、步骤s4获得的硫饥饿培养物转移到低硫培养基中，光照通气培养，直到葛仙米直径大小5
ꢀ‑
8mm左右，即获得本实施例的富硒葛仙米；其中低硫培养基的配方为：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po
4 30mg/l，mgso
4 5mg/l，mgcl240mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta 5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co
3 50mg/l，mncl22mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cuso
4 0.02mg/l。
38.实施例2、本发明富硒葛仙米的培养
39.本实施例的富硒葛仙米的培养方法包括如下步骤：
40.s1、用硒含量为5-8μg/l的温泉水(取于江西省地质局山水温泉疗养院)配置全营养培养基；其中全营养培养基配方为：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po430mg/l，mgso
4 60mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta 5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co350mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cuso40.02mg/l和琼脂2％，将培养基配方物质在121摄氏度高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完毕后，在培养基凝固前倾倒到培养皿中，静止凝固，得到全营养固体培养基，备用；
41.s2、将葛仙米球形群体用水洗净，用75％乙醇表面消毒，然后用无菌水清洗3次，再将葛仙米匀浆获得丝状藻浆，然后将葛仙米藻浆涂布在步骤s1所得的全营养固体培养基表面，于温度27.5℃，光照强度为45μmol
·
m-2
·
s-1
的条件下培养，获得葛仙米一级种子；
42.s3、将葛仙米一级种子转移到全营养液体培养基中，在5l玻璃罐中进行光照通气培养，直至葛仙米直径大小为3-4mm左右，获得葛仙米二级种子；
43.s4、用8目的不锈钢筛盘收集大于或等于3mm的葛仙米二级种子球体，将其转入到用富硒温泉水配置的无硫培养基中，进行硫饥饿培养3天，获得硫饥饿培养物；其中无硫培养基的配方为：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po
4 30mg/l，mgcl
2 40mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta 5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co
3 50mg/l，cocl
2 1mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cucl
2 0.02mg/l；
44.s5、步骤s4获得的硫饥饿培养物转移到用富硒温泉水配置的低硫培养基中，光照通气培养，直到葛仙米直径大小5-8mm左右，即获得本实施例的富硒葛仙米；其中低硫培养基的配方为：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po
4 30mg/l，mgso45mg/l，mgcl
2 40mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta 5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co350mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cuso40.02mg/l。
45.实施例3、本发明富硒葛仙米的培养
46.本实施例的富硒葛仙米的培养方法包括如下步骤：
47.s1、用硒含量为5-8μg/l的温泉水(取于江西省地质局山水温泉疗养院)配置全营养培养基；其中全营养培养基配方为：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po430mg/l，mgso
4 60mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta 5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co350mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，
namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cuso40.02mg/l和琼脂2％，将培养基配方物质在121摄氏度高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完毕后，在培养基凝固前倾倒到培养皿中，静止凝固，得到全营养固体培养基，备用；
48.s2、将葛仙米球形群体用水洗净，用75％乙醇表面消毒，然后用无菌水清洗3次，再将葛仙米匀浆获得丝状藻浆，然后将葛仙米藻浆涂布在步骤s1所得的全营养固体培养基表面，于温度30℃，光照强度为60μmol
·
m-2
·
s-1
的条件下培养，获得葛仙米一级种子；
49.s3、将葛仙米一级种子转移到全营养液体培养基中，在5l玻璃罐中进行光照通气培养，直至葛仙米直径大小为3-4mm左右，获得葛仙米二级种子；
50.s4、用8目的不锈钢筛盘收集大于或等于3mm的葛仙米二级种子球体，将其转入到用富硒温泉水配置的无硫培养基中，进行硫饥饿培养3天，获得硫饥饿培养物；其中无硫培养基的配方如下：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po
4 30mg/l，mgcl
2 40mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co
3 50mg/l，cocl
2 1mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cucl
2 0.02mg/l；
51.s5、步骤s4获得的硫饥饿培养物转移到用富硒温泉水配置的低硫培养基中，光照通气培养，直到葛仙米直径大小5-8mm左右，即获得本实施例的富硒葛仙米；其中低硫培养基的配方如下：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po
4 30mg/l，mgso45mg/l，mgcl
2 40mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co350mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cuso40.02mg/l。
52.对比例1
53.本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的葛仙米一、二级种子用温泉水配置的bg110培养基培养，本对比例的步骤s4、s5的硫饥饿培养基培养和低硫培养基培养均用bg110培养基代替。bg110培养基配方见参考文献rippka r.et al.,1979,j.gen.microbiol.11:1
–
61(https://doi.org/10.1099/00221287-111-1-1)，其余步骤、参数与实施例1完全相同。
54.对比例2
55.本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的全营养培养基的配方中不含有甘油磷酸二钠1mg/l。
56.对比例3
57.本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的步骤s4中是非硫饥饿培养基培养代替硫饥饿培养，即继续用步骤s1所配制的全营养培养基培养，其余步骤、参数与实施例1完全相同。
58.对比例4
59.本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的步骤s4中的硫饥饿培养后，在s5步骤继续采用无硫培养基进行培养，其余步骤、参数与实施例1完全相同。
60.对比例5
61.本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的步骤s5中无低硫培养基培养，继续用步骤s1所配制的全营养培养基培养代替低硫培养基培养，其余步骤、参数与实施例1完全相同。
62.试验例1、甘油磷酸二钠对葛仙米生长和代谢的激发效应考察
63.1、试验样品：实施例1-3、对比例1-2中培养的葛仙米二级种子；
64.2、试验方法：检测葛仙米二级种子细胞内氮磷含量、氮酶活性和单位体积内生物量；
65.3、试验结果：
66.表1、葛仙米的细胞内磷、氮、以及固氮酶活性和生物量
[0067][0068]
由表1可知，本发明实施例1-3所培养的葛仙米二级种子细胞内氮磷含量、氮酶活性和单位体积内生物量均高于对比例1-2所培养的葛仙米二级种子，说明往培养基中加入甘油磷酸二钠，既给葛仙米提供了更容易吸收的磷素养分，还利用葛仙米生物合成的化学计量特性，以甘油磷酸促进葛仙米的固氮活性，刺激了葛仙米对其它养分元素的吸收，提高了葛仙米的生长和代谢活性，提高葛仙米细胞内磷、氮、以及固氮酶活性和生物量。而对比例1-2所用的培养基不含有甘油磷酸二钠，都影响了葛仙米对其它养分元素的吸收。
[0069]
试验例2、硫饥饿对葛仙米吸收硒的刺激效应
[0070]
1、试验样品：实施例1-3和对比例3经过步骤s4培养的葛仙米；
[0071]
2、试验方法：测试葛仙米对硒吸收的亲和力(以米氏方程常数km值表示)，km值越低代表对硒的亲和力越高；
[0072]
3、试验结果：
[0073]
表2、葛仙米对硒吸收的亲和力
[0074] km值(μm)实施例18.17实施例28.13实施例38.16对比例341.69
[0075]
由表2结果可知，本发明实施例1-3的葛仙米经过硫饥饿处理后的km值为8.15-8.17μm，而对比例3的km值为41.69μm，说明本发明实施例1-3通过设置无硫培养基配方，删除培养基中的硫元素养分，通过短时间3天硫饥饿培养，对葛仙米造成缺硫胁迫，激发葛仙米吸收、运转硫和硒元素的相关酶的活性，从而提高葛仙米对硫和硒的摄取能力。
[0076]
试验例3、富硒葛仙米培养方法与富硒效果考察
[0077]
1、试验样品：实施例1-3、对比例1-5所培养的葛仙米；
[0078]
2、试验方法：将葛仙米样品送到第三方广电计量(湖南)有限公司检测葛仙米中硒含量，按照食品安全国家标准《食品中硒的测定gb5009.93-2017》进行检测；
[0079]
3、试验结果：
[0080]
表3、葛仙米中的硒含量
[0081][0082][0083]
由表3可知，本发明实施例1-3所培养的富硒葛仙米的硒含量高达0.79-0.81mg/kg，而对比例1-3、5所培养的葛仙米的硒含量只有0.21-0.45mg/kg，对比例4的葛仙米在步骤s5阶段裂解，不能成功培养出5-8mm的球状葛仙米，说明本发明充分利用富硒温泉水中的硒源，并采用全新的含有甘油磷酸二钠培养基配方，并结合硫饥饿和低硫培养基培养的葛仙米，可以在不影响葛仙米生长和形态发育的条件下长效增加葛仙米对硒的吸收能力，摒弃外源添加硒酸钠或亚硒酸钠的方法，避免了添加硒酸钠或亚硒酸钠存在的健康风险，安全性更好。
[0084]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种富硒葛仙米的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、用含硒温泉水配置葛仙米全营养培养基，备用；s2、将葛仙米球形群体用水洗净，消毒，清洗，匀浆获得丝状藻浆，然后涂布在步骤s1所得的全营养固体培养基表面，控制温度和光照强度，培养，获得葛仙米一级种子；s3、将葛仙米一级种子转移到全营养液体培养基中，光照通气培养，获得葛仙米二级种子；s4、将步骤s3获得的葛仙米二级种子转移到无硫培养基中，进行硫饥饿培养，获得硫饥饿培养物；s5、步骤s4获得的硫饥饿培养物转移到低硫培养基中，光照通气培养，即可收获得到富硒葛仙米。2.根据权利要求1所述的富硒葛仙米的培养方法，其特征在于，所述步骤s1中含硒温泉水中的硒含量为5-8μg/l。3.根据权利要求1所述的富硒葛仙米的培养方法，其特征在于，所述步骤s1中的富硒温泉水的水质特征如下：硒7.8μg/l，na
+
15mg/l,k
+
1.1mg/l，mg
2+
0.8mg/l，ca
2+
7.3mg/l，h2sio
3 56mg/l，cl-5.7mg/l，so
42-1.2mg/l，co
32-46mg/l，f-8.0mg/l，ph 7.3。4.根据权利要求1所述的富硒葛仙米的培养方法，其特征在于，所述步骤s1的全营养培养基配方为：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po
4 30mg/l，mgso460mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co
3 50mg/l，mncl22mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l和cuso
4 0.02mg/l。5.根据权利要求1所述的富硒葛仙米的培养方法，其特征在于，所述步骤s1的全营养培养基经过121摄氏度高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完毕后，在培养基凝固前倾倒到培养皿中，静止凝固，即可得到全营养固体培养基。6.根据权利要求1所述的富硒葛仙米的培养方法，其特征在于，所述步骤s4中的葛仙米二级种子是经过8目的不锈钢筛盘收集大于或等于3mm的葛仙米球体，然后才转移到无硫培养基中。7.根据权利要求1所述的富硒葛仙米的培养方法，其特征在于，所述步骤s4中的无硫培养基配方为：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po
4 30mg/l，mgcl240mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co
3 50mg/l，cocl21mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cucl20.02mg/l。8.根据权利要求1所述的富硒葛仙米的培养方法，其特征在于，所述步骤s4中的硫饥饿培养时间为3-4天。9.根据权利要求1所述的富硒葛仙米的培养方法，其特征在于，所述步骤s5中的低硫培养基的配方为：甘油磷酸二钠1mg/l，nah2po
4 30mg/l，mgso45mg/l，mgcl
2 40mg/l，fecl
3 2mg/l，na2edta5mg/l，cacl
2 50mg/l，k2co350mg/l，mncl
2 2mg/l，zncl
2 0.5mg/l，namoo
4 0.7mg/l，h3bo
3 5mg/l，cuso40.02mg/l。10.根据权利要求1所述的富硒葛仙米的培养方法，其特征在于，所述步骤s5中收获的葛仙米直径大小为5-8mm。

技术总结
本发明公开了一种富硒葛仙米的培养方法，属于生物技术领域。本发明通过使用富硒温泉水配制全营养培养基，充分利用富硒温泉水中的硒源，摒弃外源添加硒酸钠或亚硒酸钠的方法，避免了添加硒酸钠或亚硒酸钠存在的健康风险；并在培养基加入甘油磷酸二钠，给葛仙米提供了更容易吸收的磷素养分，促进葛仙米的固氮活性，并刺激葛仙米对其它养分元素的吸收，提高了葛仙米的生长和代谢活性，使葛仙米能够以出芽的方式快速产生种子；同时本发明还通过无硫诱导和低硫培养，在不影响葛仙米生长和形态发育的条件下长效增加葛仙米对硒的吸收能力，且操作简单，安全性好和成本低。安全性好和成本低。


技术研发人员：邵继海 艾立平 邵奕霖
受保护的技术使用者：江西藻泉生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/9/14