一种蚕蛹分级组分提高蛹虫草液体发酵产虫草素产量的方法

1.本发明涉及真菌发酵技术领域，具体地说是一种分步补料发酵提高虫草素产量的方法。


背景技术：

2.蛹虫草(cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草，具有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂等多种药理活性(fitoterapia,2010,81(8):961-968)。虫草素又称3
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脱氧腺苷(3'-deoxyadenosine，3
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da)，是一种核苷类似物，1951年首次在人工培育的蛹虫草中发现，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素(antimicrobial agents and chemotherapy,1998,42(6))，是药用真菌蛹虫草的主要活性成分，具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、免疫调节等多种生理活性。此外，虫草素具有抑制病毒进入和复制到宿主体内的潜力而被认为能有效控制新型冠状病毒复制(journal of biomolecular structure and dynamics,2020:p.1-8)。但现阶段虫草素生产成本高，且产量和生产效率低下，目前的商品化生产方式会产生大量的有机废弃物，处理不当易造成严重的环境污染，同时增加了污染物的边际处理成本，无法满足工业化生产与工业绿色生产的要求。因此，高效生产高纯度虫草素制备工艺成为研究热点。
3.虫草素制备方法主要有提取法、生物发酵法和化学合成法。提取法是最早使用且目前仍被最广泛应用的虫草素获得方法，其以蛹虫草子实体为提取原料，提取后通过分离纯化得到虫草素，该方法生产成本高，周期长，且原料依赖性强，难以制取高纯度的虫草素，且应用于大规模生产虫草素时生产效益低。化学合成法主要以腺苷为虫草素合成前体，经过合成3
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脱氧核糖环卤代物，最后加氢脱卤制取虫草素。合成过程复杂反应苛刻、成本高、产率低且反应过程中产生大量有机废液对环境造成不良影响，因此难以工业化生产(chinese journal of organic chemistry,2013(6):1340-1344)。发酵法是由蛹虫草液体或者固态培养，并经过膜分离及树脂纯化获得。固态培养生产周期长(50-60d)、不易控制，产量低，劳动量大，不能满足工业原料需求，且后续处理方式繁琐。液体发酵生产周期短(15-25d)，易于控制，产量高，且液体发酵培养所产生的虫草素98％被分泌到培养基当中(enzyme and microbial technology,2007,39(5):641-646)，应用潜力巨大(international journal of biological macromolecules,2013,59:178-183)，成为目前虫草素生产的主要途径。
4.专利cn201410335858.3公开了一种以腺苷为起始原料的虫草素合成方法，工艺简单，反应步骤短，反应过程无需纯化处理，但该方法相较生物发酵法成本更高，需要处理较多反应中产生的有机废液。专利cn202110338246.x公开了一种提高蛹虫草中虫草素含量的液体发酵培养基，缩短了生产周期，提高了生产效率，但该方法采用摇瓶发酵，未根据菌株生长情况进行填料补料，无法实现连续生产。专利cn201710972495.8公开了一种提高蛹虫草发酵液虫草素产量得到方法，其工艺简单、无污染，通过向发酵液中添加腺嘌呤补料溶液，使虫草菌发酵液虫草素产量达到956.020μg/ml，但该方法虫草素产量较低，无法实现工
业化生产。专利cn202110321329.8公开了一种蛹虫草连续发展生产虫草素的方法，通过在发酵过程中添加腺嘌呤、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胡萝卜汁和麸皮浸出汁等物质，提高虫草素产量，实现连续生产。但该方法补料成本高，提高了生产成本且工艺较为复杂，难以应用于大规模生产。


技术实现要素：

5.解决的技术问题：本发明提供一种分步添加蚕蛹分级组分提高蛹虫草液体发酵产虫草素产量的方法，旨在通过发酵工艺参数考察，结合虫草素产量和菌体生长周期，建立分批补料-控制ph值的多重发酵策略。降低虫草素生产成本，提高虫草素产率，为虫草素的工业化应用提供理论支持和技术支撑。
6.技术方案：一种蚕蛹分级组分提高蛹虫草液体发酵产虫草素产量的方法，按照以下步骤进行：(1)将蛹虫草转接于无菌pda平板培养基上进行培养、活化，制得平板母种；(2)将平板母种接种至由0-100g/l蔗糖、0-100g/l蛋白胨、0-100g/l k2hpo4、0-100g/l mgso4配得种子培养基，在10-40℃，0-300rpm的条件下摇床培养1-50d，制得种子液；(3)将种子液接种至由0-100g/l蔗糖、0-100g/l蛋白胨、0-100g/l k2hpo4、0-100g/l mgso4配得培养基的无菌发酵罐中，在10-40℃，0-300rpm，初始ph为1-14的条件下发酵培养1-50d；(4)将浓度为0-100g/l蚕蛹水提物分级组分和浓度为0-1000g/l蔗糖溶液在1-50d的发酵周期内添加至发酵罐中进行补料发酵，每天取样0.1-100ml。
7.优选的，步骤(2)所述的种子培养基，由20g/l蔗糖、20g/l蛋白胨、1g/l k2hpo4、0.5g/l mgso4与100ml蒸馏水混匀制得，ph自然，并于25℃、黑暗、130rpm摇床培养5d制得种子液。
8.优选的，步骤(3)所述的发酵培养基，由20g/l蔗糖、20g/l蛋白胨、1g/l k2hpo4、0.5g/l mgso4与1.5l蒸馏水水混匀，初始ph为9。
9.优选的，步骤(4)所述的蚕蛹水提物分级组分为蚕蛹球蛋白，其添加浓度为3.31g/l；蚕蛹球蛋白制取方法为：向脱脂蚕蛹粉中添加10倍体积纯水，于40℃的条件下超声3h后，在4℃、3000rpm的条件下离心20min，保留沉淀；添加10倍体积2％ nacl溶液，于40℃的条件下超声3h后，在4℃、3000rpm的条件下离心20min，保留上清液，调节上清液的ph为2.8，在4℃、8000rpm的条件下离心10min，收集沉淀后冷冻干燥48h，所得产物即为蚕蛹球蛋白。
10.优选的，步骤(4)所述的发酵罐发酵条件为温度25℃、转速100rpm，体系ph为9的条件下发酵培养16d。
11.优选的，步骤(4)中发酵补料策略为：第8d开始每2d通过补料口补料20ml浓度为3.31g/l的蚕蛹球蛋白悬液，第3d开始通过补料口每天补料20ml浓度为100g/l的蔗糖溶液，每天取样5ml。
12.有益效果：本发明通过分批补料-控制ph值的多重发酵策略，强化蛹虫草对虫草素的合成能力，提高虫草素产量，目前报道的添加前体物质、控制发酵条件、优化发酵培养基及发酵过程补料等发酵策略相比，采用多重发酵策略进行液体发酵蛹虫草合成虫草素的周期短，效率高，成本低，16d的发酵周期产量提高2.1倍。为工业化生产虫草素提供技术支持。
具体实施方式
13.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
14.本发明使用检测桑椹色素的测定方法为高效液相色谱法，色谱条件为kromasil c18(250
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4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为260nm，柱温40℃，流速1.0ml/min，每次进样20μl。流动相为94％纯水-6％乙腈(v/v)。本检测法可检测到虫草素，并采用面积归一法计算吸收峰对应物质的相对纯度。
15.实施例1
16.步骤(1)将蛹虫草转接于无菌pda平板培养基上进行培养、活化，制得平板母种；
17.步骤(2)种子培养基配制方法为：种子培养基由20g/l蔗糖、20g/l胰蛋白胨、1g/lk2hpo4、0.5g/l mgso4与100ml蒸馏水混匀制得，ph自然，将平板母种接种至种子培养基，并于25℃、黑暗、100r/min摇床培养5d制得种子液；
18.步骤(3)将种子液以3％接种量接种至由20g/l蔗糖、20g/l蚕蛹水提物、1g/l k2hpo4、0.5g/l mgso4与100ml蒸馏水混匀，ph自然的培养基中，并于25℃，130r/min得到转速下发酵罐培养8d，并于第16d取样；
19.步骤(4)将取得样品离心，去除菌丝体，收集上清，制得虫草素发酵滤液；
20.检测结果显示：以上述条件进行发酵8d，虫草素产量为270.10μg/ml。
21.实施例2
22.步骤(1)同实施例1；
23.步骤(2)同实施例1；
24.步骤(3)将种子液以3％接种量接种至由20g/l蔗糖、3.31g/l蚕蛹球蛋白、1g/l k2hpo4、0.5g/l mgso4与100ml蒸馏水混匀，ph自然的培养基中，并于25℃，130r/min得到转速下发酵罐培养16d，并于第16d取样；
25.步骤(4)同实施例1
26.检测结果显示：以上述条件进行发酵16d，虫草素产量为410.00μg/ml。
27.实施例3
28.步骤(1)同实施例1；
29.步骤(2)同实施例1；
30.步骤(3)将种子液以3％接种量接种至由20g/l蔗糖、3.31g/l蚕蛹球蛋白、1g/l k2hpo4、0.5g/l mgso4与100ml蒸馏水混匀，ph自然的培养基中，并于25℃，130r/min得到转速下发酵罐培养16d；
31.步骤(4)在3-16d每天补充20ml浓度为100g/l的蔗糖溶液，在8-16d每2d补充20ml浓度为16.55g/l的蚕蛹球蛋白，同时控制体系ph为9，发酵16d，并于第16d取样；
32.步骤(5)将取得样品离心，去除菌丝体，收集上清，制得虫草素发酵滤液；
33.检测结果显示：以上述条件进行发酵16d，虫草素产量为560.00μg/ml。
34.本发明基于蛹虫草生长及代谢规律，通过流加碳、氮源和蚕蛹分级组分、控制ph等发酵策略，采用5l发酵罐进行分批补料发酵，建立蛹虫草高产虫草素的分批补料-控制ph值
多重发酵策略。该发酵策略实现了利用低成本原料生产高附加值产品的要求，采用蚕蛹水提物分级组分—蚕蛹球蛋白进行补料发酵，生产成本低、虫草素产量高，可显著提高蛹虫草合成虫草素的能力，为虫草素的工业化生产提供了新的思路。

技术特征：
1.一种蚕蛹分级组分提高蛹虫草液体发酵产虫草素产量的方法，其特征在于：按照以下步骤进行：（1）将蛹虫草转接于无菌pda平板培养基上进行培养、活化，制得平板母种；（2）将平板母种接种至由0-100 g/l蔗糖、0-100 g/l蛋白胨、0-100 g/l k2hpo4、0-100 g/l mgso4配得种子培养基，在10-40 ℃，0-300 rpm的条件下摇床培养1-50 d，制得种子液；（3）将种子液接种至由0-100 g/l蔗糖、0-100 g/l蛋白胨、0-100 g/l k2hpo4、0-100 g/l mgso4配得培养基的无菌发酵罐中，在10-40 ℃，0-300 rpm，初始ph为1-14的条件下发酵培养1-50 d；（4）将浓度为0-100 g/l蚕蛹水提物分级组分和浓度为0-1000 g/l蔗糖溶液在1-50 d的发酵周期内添加至发酵罐中进行补料发酵，每天取样0.1-100 ml。2.根据权利要求1所述的一种蚕蛹分级组分提高蛹虫草液体发酵产虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（2）所述的种子培养基，由20 g/l蔗糖、20 g/l蛋白胨、1 g/l k2hpo4、0.5 g/l mgso4与100 ml蒸馏水混匀制得，ph自然，并于25 ℃、黑暗、130 rpm摇床培养5 d制得种子液。3.根据权利要求1所述的一种蚕蛹分级组分提高蛹虫草液体发酵产虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（3）所述的发酵培养基，由20 g/l蔗糖、20 g/l蛋白胨、1 g/l k2hpo4、0.5 g/l mgso4与1.5 l蒸馏水水混匀，初始ph为9。4.根据权利要求1所述的一种蚕蛹分级组分提高蛹虫草液体发酵产虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（4）所述的蚕蛹水提物分级组分为蚕蛹球蛋白，其添加浓度为3.31 g/l；蚕蛹球蛋白制取方法为：向脱脂蚕蛹粉中添加10倍体积纯水，于40 ℃的条件下超声3 h后，在4 ℃、3000 rpm的条件下离心20 min，保留沉淀；添加10倍体积2% nacl溶液，于40 ℃的条件下超声3 h后，在4 ℃、3000 rpm的条件下离心20 min，保留上清液，调节上清液的ph为2.8，在4 ℃、8000 rpm的条件下离心10 min，收集沉淀后冷冻干燥48 h，所得产物即为蚕蛹球蛋白。5.根据权利要求1所述的一种蚕蛹分级组分提高蛹虫草液体发酵产虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（4）所述的发酵罐发酵条件为温度25 ℃、转速100 rpm，体系ph为9的条件下发酵培养16 d。6.根据权利要求1所述的一种蚕蛹分级组分提高蛹虫草液体发酵产虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（4）中发酵补料策略为：第8 d开始每2 d通过补料口补料20 ml浓度为3.31 g/l的蚕蛹球蛋白悬液，第3 d开始通过补料口每天补料20 ml浓度为100 g/l的蔗糖溶液，每天取样5 ml。

技术总结
一种蚕蛹分级组分提高蛹虫草液体发酵产虫草素产量的方法，根据极性和溶解性制备蚕蛹分级组分，在蛹虫草液体发酵过程中添加蚕蛹水提物分级组分，构建蔗糖、蚕蛹球蛋白液体发酵补料-控制pH的多重发酵体系，克服了发酵工艺产量低，无法连续发酵，补料原料昂贵等问题，显著提高虫草素产量。对于虫草素工业化连续化生产提供理论依据和应用意义。产提供理论依据和应用意义。


技术研发人员：王俊 李奕彤 黄泽来 姚昊天 宫璐婵
受保护的技术使用者：江苏科技大学
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/9/13