一种抗呼吸道病毒的药物、食品及其应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种抗呼吸道病毒的药物、食品及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(简称“新冠病毒”，covid-19)的病原体为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(简称“新冠病毒”，sars-cov-2)，传播力强，对全球公共卫生安全造成极大威胁。新冠病毒和多种呼吸道病毒一样首先侵染鼻咽部位，通过与呼吸道上皮细胞的血管紧张素转换2(angiotensin-converting enzyme 2，ace2)受体结合进入机体，进而扩散全身，造成肺部、心脏及多脏器的功能异常。目前新冠病毒的防治手段主要是疫苗、中和抗体和病毒复制相关酶抑制剂。但是新冠病毒的易变异性，导致了疫苗、中和抗体等现有药物的困难。
3.人体先天免疫反应具有普适性的抗病毒作用。锌指抗病毒蛋白(zinc-finger antiviral protein,zap)是降解侵入细胞的病毒rna的一种主要限制因子。zap可与富含cg片段的异体rna结合，招募相关酶将外源性核酸降解，从而抑制甲型流感病毒等多种呼吸道病毒的复制。因此，设计小分子药物组合物以增强zap途径，通过先天免疫反应发挥抗病毒作用成为重要研究方向。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种抗呼吸道病毒的药物、食品及其应用，促进锌指抗病毒蛋白表达，促进外来核酸的切割和降解。
5.本发明公开了一种抗呼吸道病毒的药物或食品，包括以下任一成分或它们的组合物：锌剂、维生素a或其衍生物、以及天然化合物，所述天然化合物选自：冬凌草甲素、松柏醛、绿原酸、水飞雄黄和连翘苷。
6.在新冠防治中，中医药发挥了重要的作用。已经从2000多种中草药中筛选出许多具有一定抗病毒作用的活性成分/天然化合物，例如可以抑制病毒复制的黄芩苷、查耳酮、金丝桃素等；能阻断病毒与受体结合的大黄素、大黄酸等；直接杀灭病毒的黄芩素、苦瓜素、茶多酚等；具有免疫增强功能的猪苓多糖、黄芪多糖、肉桂醛等；抑制细胞因子/趋化因子等肺部炎症反应的二氢杨梅素、双氢青蒿素、鱼腥草多糖等。但目前这些天然化合物如何调节先天免疫反应发挥抗病毒作用的研究不多，具有潜在的研究和开发价值。例如：
7.绿原酸(chlorogenic acid，简称cha)是中药金银花(lonicera japonica flos)的活性成分之一。金银花，味甘，性寒，归经为肺、心、胃，其功效清热解毒、疏散风热，用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症，是一味有着悠久历史的知名中药材。其粗提物、有效成分及中药组分被证实可对抗包括流感病毒在内的多种病毒感染，其中发挥主要作用的是cha。
8.雄黄(as4s4)历来被中医药典籍定性为杀虫药，具有解毒杀虫、燥湿祛痰、截疟，用于痈肿疔疮、蛇虫咬伤、虫积腹痛、惊痫、疟疾。尽管现代对雄黄临床药效的研究多集中于白血病及癌症，但其在古代疫病防治中应用广泛。含有水飞雄黄的六神丸在体外不仅能显著
抑制病毒的复制和增殖，而且对体内肺炎的损伤也有明显的改善作用。
9.连翘苷(forsythin，简称fst)为中药连翘的活性成分。连翘为常用中药，具有清热解毒、散结消肿、疏散风热的功效。在抗病毒方面，一项研究认为连翘苷可能通过抑制甲型流感病毒核蛋白(np)转染后表达发挥作用。最新的研究表明，fst在体外能显著抑制sars-cov-2和hcov-229e的复制，通过抑制人肝癌细胞系(huh-7)nf-κb信号显著减少促炎细胞因子的产生。此外，连翘苷可能通过调节下丘脑中的pge2和il-1β水平明显降低发热大鼠体温，并对多种侵犯肺部的病毒均有一定的抑制作用。
10.冬凌草甲素(oridonin，简称od)为冬凌草的活性成分。在中医诊疗中，冬凌草被用于咽喉肿痛、蛇虫咬伤及食道癌、肺癌、肝癌等病症，具有清热解毒、活血止痛、消炎抑菌和抑制肿瘤的功效。冬凌草甲素具有广谱抗肿瘤活性，可抑制多种肿瘤细胞的增殖、调控肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞自噬、抑制肿瘤细胞迁移、侵袭和转移等。在增强免疫力的研究方面，冬凌草甲素的作用主要体现在疾病后的免疫保护，如通过调节炎症因子表达水平，改善糖尿病肾病幼龄大鼠免疫紊乱，针对正常机体研究鲜有报道。
11.松柏醛(coniferylaldehyde，简称cfa)又名阿魏醛，为肉桂醛衍生物。cfa是多种中药的有效成分，是早先用于葡萄酒的主要香料之一，近年来才有医学用途研究。研究表明，cfa可促进神经元存活，并通过激活nrf2通路维持线粒体动态结构、改善线粒体功能能量代谢，对线粒体结构和功能具有明显的神经保护作用。此外，在对热休克因子1(hsf1)研究中发现，cfa的共轭双键结构是一种激活hsf1的活性药效团，它可能有助于开发小分子药物，以防止紫杉醇和顺铂等毒性药物给正常细胞带来的辐射损伤。肉桂醛可以直接杀伤病毒或通过免疫调节等机制发挥抗病毒作用，由此可以推测，作为肉桂醛类似物，cfa有可能具有抗病毒活性，在病毒造成的细胞损伤方面发挥保护作用。
12.这些天然化合物的抗病毒效应不仅是抑制病毒复制和直接杀灭病毒，更在于可以平衡过度的免疫激活造成的炎症反应，实现综合平衡的抗病毒结果。而中药成分与维生素a衍生物和锌剂合理联用可产生更理想的抗病毒效应。
13.其中，所述锌剂选自：氧化锌、氯化锌、硫酸锌、碳酸锌、苹果酸锌、葡萄糖酸锌、富含锌的食物、以及食药物质；维生素a衍生物选自：全反式维甲酸、视黄醇、视黄醛、维a酸棕榈酸酯和羟基频那酮视黄酸酯。
14.所述锌剂的浓度范围为：1μm-100μm；维生素a或其衍生物的浓度范围为：0.1μm-100μm；冬凌草甲素的浓度范围0.1μm-20μm；松柏醛的浓度范围0.1μm-100μm；绿原酸的浓度范围0.1μm-200μm；水飞雄黄的浓度范围0.001μg/ml-0.025μg/ml；连翘苷的浓度范围0.1μm-100μm。
15.葡萄糖酸锌(简称zn)在测试范围为50μm对鼻黏膜上皮细胞(简称hnepc)的锌指抗病毒蛋白(简称zap)的促表达效果最优。
16.维生素a及其衍生物在所述浓度1μm、2.5μm、5μm、10μm、20μm与50μm葡糖糖酸锌联用，对鼻黏膜上皮细胞的锌指抗病毒蛋白具有不同程度的促表达作用。全反式维甲酸(atra)对锌指抗病毒蛋白(简称zap)表达的作用效果最优。
17.冬凌草甲素(od)在2.5-10μm单药给药对锌指抗病毒蛋白表达有较好地促进作用；松柏醛(cfa)在浓度范围2.5-50μm单独给药提升了zap表达；绿原酸(cha)在浓度为20μm左右表现出较好地促进zap表达的作用。
18.锌剂和天然化合物冬凌草甲素(od)及其联合制剂能够有效诱导锌指抗病毒蛋白(简称zap)切割降解外来核酸，从而抑制gfp报告基因表达的作用。
19.葡萄糖酸锌和1-5μm全反式维甲酸联用可以促进zap表达。
20.优选的，冬凌草甲素和葡萄糖酸锌联用，以及冬凌草甲素、葡萄糖酸锌和全反式维甲酸联用，可以促进zap表达。
21.上述药物或食品可用于促进锌指抗病毒蛋白表达；用于促进呼吸道病毒核酸降解；用于提高细胞活力；和用于修复线粒体损伤。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果为：可促进锌指抗病毒蛋白表达、促进呼吸道病毒核酸降解、提高细胞活力，起到抗呼吸道病毒的作用；松柏醛还可修复线粒体损伤。
附图说明
23.图1是葡萄糖酸锌、维生素a及其衍生物对人鼻粘膜上皮细胞(hnepc)细胞活力影响的检测图。
24.图2是冬凌草甲素(od)、松柏醛(cfa)、绿原酸(cha)、连翘苷(fst)和水飞雄黄(as4s4)对人鼻粘膜上皮细胞(hnepc)的细胞活力影响的检测图。
25.图3是全反式维甲酸(atra)、视黄醇(retinol)、视黄醛(retinal)、羟基频那酮维甲酸酯(retinoate)以及维生素a棕榈酸酯(palmitate)与葡萄糖酸锌(zn)联用对鼻黏膜上皮细胞表达锌指抗病毒蛋白影响的检测图。
26.图4是天然化合物单药、二联和三联给药对鼻黏膜上皮细胞(hnepc)表达锌指抗病毒蛋白zap影响的检测图。
27.图5是gfp+nt2751-2733质粒构造及测序结果图。
28.图6是葡萄糖酸锌(zn)、冬凌草甲素(od)、全反式维甲酸(atra)、以及部分联用对gfp+nt2751-2733质粒转染后表达的检测图。
29.图7是松柏醛(cfa)对sars-cov-2的s蛋白刺激神经细胞sh-sy5y线粒体修复的检测图。
具体实施方式
30.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：
32.药物的制备
33.称取45.57mg(0.1mmol)葡萄糖酸锌(zn)，取10ml pbs溶解，配置成浓度为10mm的葡萄糖酸锌母液；取100μl的葡萄糖酸锌母液(10mm)稀释于0.9ml的dmem(含10％血清)中制得1mm的葡萄糖酸锌溶液；然后分别将1mm的葡萄糖酸锌溶液稀释至100μm、50μm、10μm、5μm、1μm制得不同浓度的葡萄糖酸锌溶液。
34.称取28.65mg(0.1mmol)维生素a(va)，取10ml dmso溶解，配置成浓度为10mm的维生素a母液；取100μl的维生素a母液(10mm)稀释于0.9ml的dmem(含10％血清)中制得1mm的
维生素a溶液；然后分别将1mm的维生素a溶液稀释至100μm、50μm、10μm、5μm、1μm制得不同浓度的维生素a溶液。
35.称取30.04mg(0.1mmol)全反式维甲酸(atra)，取10ml dmso溶解，配置成浓度为10mm的全反式维甲酸母液；取100μl的全反式维甲酸母液(10mm)稀释于0.9ml的dmem(含10％血清)中制得1mm的全反式维甲酸溶液；然后分别将1mm的全反式维甲酸溶液稀释至100μm、50μm、10μm、5μm、1μm制得不同浓度的全反式维甲酸溶液。
36.称取28.44mg(0.1mmol)视黄醛(retinal)，取10ml dmso溶解，配置成浓度为10mm的视黄醛母液；取100μl的视黄醛母液(10mm)稀释于0.9ml的dmem(含10％血清)中制得1mm的视黄醛溶液；然后分别将1mm的视黄醛溶液稀释至100μm、50μm、10μm、5μm、1μm制得不同浓度的视黄醛溶液。
37.称取39.86mg(0.1mmol)羟基频那酮视黄酸酯(retinoate)，取10ml dmso溶解，配置成浓度为10mm的羟基频那酮视黄酸酯母液；取100μl的羟基频那酮视黄酸酯母液(10mm)稀释于0.9ml的dmem(含10％血清)中制得1mm的羟基频那酮视黄酸酯溶液；然后分别将1mm的羟基频那酮视黄酸酯溶液稀释至100μm、50μm、10μm、5μm、1μm制得不同浓度的羟基频那酮视黄酸酯溶液。
38.称取52.49mg(0.1mmol)视黄酸棕榈酸酯(palmitate)，取10ml dmso溶解，配置成浓度为10mm的视黄酸棕榈酸酯母液；取100μl的视黄酸棕榈酸酯母液(10mm)稀释于0.9ml的dmem(含10％血清)中制得1mm的视黄酸棕榈酸酯溶液；然后分别将1mm的视黄酸棕榈酸酯溶液稀释至100μm、50μm、10μm、5μm、1μm制得不同浓度的视黄酸棕榈酸酯溶液。
39.称取36.44mg(0.1mmol)冬凌草甲素(od)，取10ml dmso溶解，配置成浓度为10mm的冬凌草甲素母液；取100μl的冬凌草甲素(10mm)稀释于0.9ml的dmem(含10％血清)中制得1mm的冬凌草甲素溶液；然后分别将1mm的冬凌草甲素溶液稀释至100μm、50μm、25μm 10μm、5μm、2.5μm、2μm、1μm制得不同浓度的冬凌草甲素溶液。
40.称取17.82mg(0.1mmol)松柏醛(cfa)，取10ml dmso溶解，配置成浓度为10mm的松柏醛母液；取100μl的松柏醛母液(10mm)稀释于0.9ml的dmem(含10％血清)中制得1mm的松柏醛溶液；然后分别将1mm的松柏醛溶液稀释至200μm、100μm、50μm、20μm、10μm、5μm、2.5μm、1μm制得不同浓度的松柏醛溶液。
41.称取35.43mg(0.1mmol)绿原酸(cha)，取10ml dmso溶解，配置成浓度为10mm的绿原酸母液；取100μl的绿原酸稀释于0.9ml的dmem(含10％血清)中制得1mm的绿原酸溶液；然后分别将1mm的绿原酸溶液稀释至200μm、150μm、100μm、50μm、25μm、20μm、10μm、5μm、1μm制得不同浓度的绿原酸溶液。
42.水飞雄黄是固体混悬液，其中实际含有的物质组分较为复杂，因此这里以主成分as4s4的质量浓度计量。文献中氧化砷治疗白血病的安全用量约为100～500nm，本实验最大可测试as4s4混悬物浓度为0.025μg/ml(折合as浓度为240nm)。本实验将as4s4混悬液配制至0.025μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml、0.025μg/ml、0.0025μg/ml、0.001μg/ml等不同浓度的as4s4溶液。
43.称取53.45mg(0.1mmol)连翘苷(fst)，取10ml dmso溶解，配置成浓度为10mm的连翘苷母液；取100μl的连翘苷母液(10mm)稀释于0.9ml的dmem(含10％血清)中制得1mm的连翘苷溶液；然后分别将1mm的连翘苷溶液稀释至100μm、50μm、40μm、25μm、15μm、10μm、5μm、
2.5μm、1μm制得不同浓度的连翘苷溶液。
44.将100μm的葡萄糖酸锌(zn)溶液与40/20/10/5/2μm的全反式维甲酸(atra)、视黄醇(retinol)、视黄醛(retinal)、羟基频那酮维甲酸酯(retinoate)和维生素a棕榈酸酯(paomitate)以1:1的比例混合制得葡萄糖酸锌(zn)和全反式维甲酸、视黄醇、视黄醛、羟基频那酮维甲酸酯和维生素a棕榈酸酯的终浓度分别为50μm和20/10/5/2.5/1μm的葡萄糖酸锌(zn)联合全反式维甲酸、视黄醇、视黄醛、羟基频那酮维甲酸酯和维生素a棕榈酸酯(zn+atra、zn+retinol、zn+retinal、zn+retinoate、zn+paomitate)组合物制剂。
45.将100μm的葡萄糖酸锌(zn)溶液与2μm的维生素a及衍生物溶液分别与200/100/50/20/10/5/2/1μm的冬凌草甲素(od)、400/200/100μm/40/20/10/5/2μm的松柏醛(cfa)、400/300/200/100/50/40/20/10/2μm的绿原酸(cha)、0.05/0.04/0.02/0.01/0.005/0.002μg/ml的水飞雄黄(as4s4)、以及200/100/80/50/30/20/10/5/2μm的连翘苷(fst)以1:1:1的比例混合制得终浓度分别为50μm葡萄糖酸锌(zn)、1μm维生素a及衍生物和100/50/25/10/5/2.5/2/1μm冬凌草甲素(od)、200/100/50μm/20/10/5/2.5/1μm的松柏醛(cfa)、200/150/100/50/25/20/10/5/1μm的绿原酸(cha)、0.025/0.02/0.01/0.005/0.0025/0.001μg/ml的水飞雄黄(as4s4)、以及100/50/40/25/15/10/5/2.5/1μm的连翘苷(fst)的二联或三联组合物制剂。
46.检测药物对上皮细胞活力的影响
47.通过mts实验检测鼻黏膜上皮细胞(hnepc)细胞活力。sars-cov-2(新型冠状病毒)是通过细胞受体血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ace2)进入靶细胞，而ace2可在鼻黏膜上皮细胞中高表达，因此选用鼻黏膜上皮细胞为细胞模型。
48.细胞预培养和传代：上皮细胞置于37℃，5％ co2的条件下培养，培养基为dmem(含10％胎牛血清)，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素。传达包括以下步骤：(1)培养基、胰酶和pbs于37℃水浴锅中预热；(2)弃掉培养瓶中的旧培养基，取2ml pbs加入25cm的细胞培养瓶中，清洗细胞表面3次，并弃去pbs；(3)加入1ml 0.05％胰酶消化细胞，镜下观察待细胞形态略有变化，则在超净台中把胰酶倒掉留取约100μl，将细胞置于37℃细胞培养箱内孵育3min至消化完全；(4)用2ml细胞培养基中止消化，并吹打培养瓶瓶壁，将细胞移入离心管中，1000rpm离心3min；(5)离心后弃上清，加1ml新鲜dmem(含10％胎牛血清)于培养瓶中吹打混匀细胞，按合适比例进行细胞传代，在瓶身标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。
49.mts法检测细胞活力：
50.(1)接种细胞：用dmem(含10％胎牛血清)培养基配成细胞悬液后，以每孔3000-4000个细胞接种到96孔板中，每孔体积100μl。(2)细胞约60％融合后，加入使用完全培养基稀释的不同浓度的待测药物处理细胞：50μm葡萄糖酸锌、50μm全反式维甲酸、10μm全反式维甲酸、5μm全反式维甲酸、50μm视黄醇、10μm视黄醇、5μm视黄醇、50μm视黄醇、10μm视黄醛、5μm视黄醛、50μm羟基频那酮视黄酸酯、10μm羟基频那酮视黄酸酯、5μm羟基频那酮视黄酸酯、50μm维生素a棕榈酸酯、10μm维生素a棕榈酸酯和5μm维生素a棕榈酸酯，并设置未加入药物的阴性对照(con)。其中每个药物的浓度设置均是参考文献中使用的最低有效浓度设置合适梯度得到，每个浓度设置6个左右的复孔。去除原培养基加入含药物的培养基100μl，将处理后的96孔板放回培养箱中继续培养36h。(3)取出96孔板，弃去原培养孔中的溶液，每孔加入100μl用dmem(含10％胎牛血清)培养基配置的10％ mts溶液l，继续孵育2h；(3)2h后用酶
标仪测定各孔光吸收值(激发波长为490nm)，以药物浓度为横坐标，各组吸光值与阴性对照的比为纵坐标(％)绘制药物作用曲线。
51.图1结果所示，在50μm以下的葡萄糖酸锌(zn)和维生素a及其衍生物等大部分药物对细胞活力具有显著的促进作用。其中，全反式维甲酸(atra)对细胞活力的促进作用最为明显。
52.几种天然化合物对hnepc活力影响的结果如图2所示。其中，冬凌草甲素(od)、松柏醛(cfa)、绿原酸(cha)和连翘苷(fst)在测试范围内对细胞活力无明显抑制作用，部分化合物在一定浓度范围具有促进细胞活力的作用。虽然通常认为雄黄是毒性较强的化合物，但结果显示，在最大可测试混悬物浓度0.025μg/ml(折合as浓度为240nm)以下时，对细胞活力无影响。这与氧化砷治疗白血病的安全用量(100～500nm)结果一致。另外图1和图2整体说明各组药物不会抑制细胞的活性。
53.检测各药物对锌指抗病毒蛋白(zap)表达的影响
54.用dmem(含10％胎牛血清)培养基配成细胞悬液后，以每孔4
×
10
4-5
×
104个细胞接种到6孔板中，每孔体积2ml。(2)细胞约60％融合后，使用完全培养基将药物稀释至指定浓度后，给与细胞作用36h。(3)药物作用36h后弃去原培养孔中的溶液，pbs洗三次，用加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的提取液提取蛋白。(4)用bca法进行蛋白浓度测定，将上样缓冲液与各蛋白样品充分混匀，100℃水浴锅中煮样5-10min。
55.western blot实验检测锌指抗病毒蛋白(zap)表达：(1)配胶：配置15％分离胶和5％浓缩胶；(2)电泳：每孔上样15μg蛋白，低电压50v，30min，以溴酚蓝为指示，待前沿跑过浓缩胶后调整电压为120v，继续电泳约90min待溴酚蓝前沿跑出分离胶，即可停止电泳；(3)转膜：200v，100min，转膜期间及时降温，电流不可超过400ma；(4)封闭：5％脱脂奶粉摇床封闭1.5h-2h；(5)孵育抗体：稀释一抗(兔抗zap抗体)至说明书比例，摇床4℃过夜；取出膜，用tbst洗膜，每次10min，洗三次；按照说明书比例稀释相应二抗(hrp标记的羊抗兔igg)，室温下摇床孵育60min；tbst洗膜三次，每次20min；(6)曝光。
56.gapdh蛋白的检测：将曝光后的pvdf膜用蛋白印记再生液洗涤，然后用tbst洗膜10min，然后按上述同样方法孵育一抗(兔抗gapdh抗体)和二抗(hrp标记的羊抗兔igg)，曝光。
57.以葡糖糖酸锌作为锌剂的代表，且最佳作用浓度为50μm。图3a示出50μm葡糖糖酸锌与1-20μm全反式维甲酸的组合物对zap表达的影响；图3b示出了葡糖糖酸锌与1-20μm视黄醇的组合物对zap表达的影响；图3c示出了葡糖糖酸锌与1-20μm视黄醛的组合物对zap表达的影响；图3d示出了葡糖糖酸锌与1-20μm羟基频那酮视黄酸酯的组合物对zap表达的影响；图3e示出了葡糖糖酸锌与1-20μm视黄酸棕榈酸酯的组合物对zap表达的影响。结果显示，与对照相比，虽然各药物对zap蛋白表达效果各异，但其中仍可以观察到一定的作用趋势。其中1-5μm全反式维甲酸(atra)与锌剂联用时，可以促进zap表达(约1.2-1.5倍)。基于上述结果，选定atra与葡萄糖酸锌联用进行下一步的联合给药实验。
58.如图4示出了冬凌草甲素、松柏醛、绿原酸、水飞雄黄、连翘苷的促zap表达效果，并将这些化合物与葡萄糖酸锌(50μm)和/或atra(1μm)联用，以期筛选出最佳的药物联用组合。4a和4b中，各条带的药物组合参见表1，冬凌草甲素(od)在0-10μm单药给药对zap表达有较好地促进作用，od与锌-atra合用对zap的作用与od单独作用持平。
59.表1
[0060][0061]
4c和4d中，各条带的药物组合参见表2，松柏醛(cfa)在0-50μm单独给药稍稍增加了zap表达，但效果不及冬凌草甲素。
[0062]
表2
[0063][0064]
图4e和4f中，各条带的药物组合参见表3，绿原酸(cha)在20μm左右表现出较好地促进zap表达作用。
[0065]
表3
[0066]
[0067][0068]
图4g和4h中对连翘苷(fst)进行了检测，各条带的药物组合参见表4。
[0069]
表4
[0070]
[0071][0072]
图4i和4j对水飞雄黄as4s4检测，各条带的药物组合参见表5。
[0073]
表5
[0074]
[0075][0076]
基于上述结果，选定冬凌草甲素(od)与葡萄糖酸锌或与atra-葡萄糖酸锌联用为优选组合。
[0077]
检测药物对锌指抗病毒蛋白(zap)的外来核酸降解能力
[0078]
(1)gfp+nt 2751-2733质粒构建：
[0079]
摇菌培养：将克隆菌液涂在lb固体平板；置于37℃恒温培养12-17h，培养长出菌落；灭菌15ml离心管内加入5ml含amp抗生素的l液体培养基，编号标记；挑取单克隆菌落放置在液体培养基中，每个培养基放置1个菌落；37℃，180rpm，恒温摇床振荡培养过夜。
[0080]
质粒提取：取4ml过夜培养的菌液，加入离心管中，13,000rpm离心1分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清；向留有菌体沉淀的离心管中加入200μl预先加入rnase a的buffer p1，使用涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀；向离心管中加入200μl buffer p2，轻轻上下颠倒混匀10次，使菌体充分裂解，得到清亮粘稠的溶液；向离心管中加入200μl buffer e3，立即上下颠倒混匀8-10次，出现白色絮状沉淀，13,000rpm离心5分钟；向已装入收集管的吸附柱(spin columns dm)中加入260μl异丙醇后，立即加入先前收集到的上清液，上下颠倒混匀；13,000rpm离心分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱中加入400μl预先加入无水乙醇的buffer pw，13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液；将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入50-100μl buffer eb，13,000rpm离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存质粒。
[0081]
gfp+nt 2751-2733质粒构建：zap锌指结构域是特异性识别cg二核苷酸以及额外的鸟嘌呤和胞嘧啶的结构，直接和选择性地与外来病毒含有cg二核苷酸的序列结合发挥降解外来核酸效应，且cg序列的积累增加了外来核酸对zap的响应性。在sars-cov-2中，存在编码其刺突蛋白681氨基酸上的弗林蛋白酶切位点(fcs)的一种含19个核苷酸rna序列这是在sars-cov-2与蝙ratg13冠状病毒的众多点突变差异中，较为少见的多核酸突变位点。该病毒反向匹配序列恰好为序列库中nt 2751-2733序列，该序列的cg含量高，十分适合用来作为zap的切割靶点，从而筛选和验证化合物是否可以通过zap增强细胞对外来核酸的降解能力。
[0082]
对依据上述方法进行构建的gfp+nt 2751-2733质粒进行测序，结果如图5所示。基于pcdna3.1-egfp载体插入nt 2751-2733序列，参见图5b，得到含有feature18特定标记的质粒524-pcdna3.1-egfp，参见图5a。参见图5c，测序结果显示目标序列成功插入到质粒的多克隆位点，且测序结果干净无杂质峰，表明质粒构建成功，可用于进一步实验。
[0083]
(2)gfp+nt2751-2733质粒转染：
[0084]
药物处理：将293t细胞以1
×
105个/孔接种在24孔板里，培养细胞至70％-80％融合后，使用完全培养基将单药或二联药物稀释至指定浓度后，给予细胞并作用24h。
[0085]
质粒转染：细胞密度至90％以上时，将24孔板每孔换成1ml新鲜培养液(含有10％血清，不含抗生素)；取一个洁净无菌离心管，对于待转染的2孔板中每一个孔的细胞，加入25μl opti-mem无血清培养基，加入500ng质粒dna，并用枪轻轻吹打混匀，再加入0.4μl lipo8000
tm
转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，配制完成后，按照每孔25μllipo8000
tm
转染试剂-dn混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。
[0086]
荧光观察：继续培养约24-48小时后，使用倒置荧光显微镜检测绿色荧光蛋白强度，检测结果参见图6a。同时将未转染质粒的293t细胞作为阴性对照。
[0087]
荧光定量：使用imagej软件进行区域荧光强度总和定量分析，提取图片单一通道，调整阈值，选择适当的区域，选择合适阈值算法，设定需要测量的参数，检测统计荧光强度总和,参见图6b。
[0088]
通过上述体外新冠病毒相关核酸切割能力实验，初步对药物的抗病毒潜力进行验证。锌剂等药物处理后对gfp+nt2751-2733质粒转染后的293t细胞gfp表达影响的结果如图6所示。参见图6a和6b，与对照组相比，锌剂与冬凌草甲素(2.5μm)分别可显著抑制gfp的表达，冬凌草甲素的作用比锌剂更强。图6c和6d示出了全反式维甲酸的联用情况。药物联用时，无论是锌剂+全反式维甲酸(1μm)、锌剂+冬凌草甲素(2.5μm)、以及锌剂+全反式维甲酸(1μm)+冬凌草甲素(2.5μm)同样能显著抑制gfp的表达。药物联用的作用强度与单独使用相比基本持平。上述结果确认了锌剂和冬凌草甲素及其联用在细胞内均可通过增加zap表达促进细胞降解新冠病毒相关外来核酸的能力，具有潜在的抗病毒应用价值。图中的结果均以平均值
±
sd表示，各组均与对照组比较，显著性为*p《0505，**p《0.01,***p《0.001。
[0089]
药物对线粒体损伤影响的检测
[0090]
使用免疫荧光方法，在激光共聚焦显微镜下观察sars-cov-2s蛋白，以及药物对sh-sy5y神经细胞的线粒体形态的影响。检测方法包括以下步骤：
[0091]
(1)细胞给药：在35mm玻底皿的凹槽中，滴加稀释浓度为1
×
106个/ml的sh-sy5y细胞，培养24h，使用无血清dmem将sars-cov-2s1(his tag)、人免疫球蛋白(igg)稀释成4μg/ml，松柏醛(cfa)稀释成50μm。多个玻底皿分别加入1ml稀释后的s蛋白溶液(s蛋白组)、igg溶液(免疫球蛋白组,igg组)、s蛋白与松柏醛混合溶液(混合组)，设置只有dmem的空白对照，作用24h。(2)固定：用4℃预冷的pbs清洗细胞3次，每次10min，再用4℃预冷的4％细胞组织固定液在室温下固定细胞10min。(3)透化：pbs轻柔冲洗3次，每次5min，使用pbs配制0.2％triton x-100，室温孵育细胞5min。(4)封闭：pbs轻柔冲洗3次，每次3min，加入含5％bsa的pbs，在室温下封闭1h。(5)一抗孵育：弃去封闭液，每张盖玻片上加入含1％bsa的pbs稀释的一抗(tom20抗体)50μl，用parafilm封口膜覆盖皿，4℃孵育过夜。pbs洗三次，每次10min。(6)二抗孵育：每皿加入含1％ bsa的pbs稀释的二抗50μl，覆盖封口膜后37℃避光孵2h。pbs洗三次，每次10min。(7)激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态。(8)使用imagej进行免疫荧光线粒体结构定量。
[0092]
参见图7a、7b和7c，对照组与igg组线粒体正常而完整，而s蛋白组的线粒体蛋白则结构不连续，出现较多零碎片段。参见图7d,经50μm cfa和s蛋白共同处理后，线粒体形态完全恢复。参见图7e和7f，对线粒体长度进行定量统计发现，不论是线粒体结构蛋白的平均分
支长度还是分支长度的中位值方面，都表现出与镜下观察一致的结果，即：空白对照组和igg组无明显差异，s蛋白组显著下降，混合组的线粒体长度显著恢复，显示松柏醛能够有效修复被病毒破坏的线粒体形态。
[0093]
在新冠病毒损伤中，s蛋白造成的细胞(如心肌细胞)线粒体损伤是一个具有代表性的结果。因此，在抵御病毒感染的同时，如能让药物具有修复病毒入侵机体造成的损伤是更为有意义的。如图7所示，与文献报道sars-cov-2的s蛋白损伤心肌细胞类似，在神经细胞中，也观察到了s蛋白对线粒体形态的显著破坏作用。通过对线粒体定位蛋白tom20的免疫荧光染色，可以清晰地观察到线粒体形态。
[0094]
结果显示，松柏醛是一种良好的线粒体保护剂，锌剂可以有效保护上皮细胞的紧密连接结构完整性和屏障功能。而锌剂和松柏醛的联用对新冠s蛋白损伤具有修复作用，在增强先天免疫的基础上找到联用药物，可达到增强免疫、修复损伤的双重功效。
[0095]
本发明的药物可用于预防和治疗呼吸道病毒传播，可制备为口腔/鼻腔局部给的药制剂。呼吸道病毒包括但不限于流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、人偏肺病毒、披膜病毒科的缝针病毒、小rna病毒科的鼻病毒、冠状病毒科的sars冠状病毒、以及sars-cov-2(新型冠状病毒)。
[0096]
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细实验流程及所应用的鼻黏膜上皮细胞(hnepc)细胞等模型和gfp+nt2751-2733质粒转染模型，但本发明并不局限于上述详细实验流程和细胞模型，即不意味着本发明必须依赖上述详细实验流程和细胞模型才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品的任何结构的改变及葡萄糖酸锌(zn)、维生素a及衍生物(维甲酸、维生素a、视黄醛和维甲酸酯等)和天然化合物(冬凌草甲素、松柏醛、绿原酸、水飞雄黄、连翘苷等)的等效替换等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种抗呼吸道病毒的药物，其特征在于，包括以下任一成分或它们的组合物：锌剂、维生素a或其衍生物、以及天然化合物，所述天然化合物选自：冬凌草甲素、松柏醛、绿原酸、水飞雄黄和连翘苷。2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述锌剂选自：氧化锌、氯化锌、硫酸锌、碳酸锌、苹果酸锌、葡萄糖酸锌、富含锌的食物、以及食药物质；维生素a衍生物选自：全反式维甲酸、视黄醇、视黄醛、维a酸棕榈酸酯和羟基频那酮视黄酸酯。3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述锌剂的浓度范围为：1μm-100μm；维生素a或其衍生物的浓度范围为：0.1μm-100μm；冬凌草甲素的浓度范围0.1μm-20μm；松柏醛的浓度范围0.1μm-100μm；绿原酸的浓度范围0.1μm-200μm；水飞雄黄的浓度范围0.001μg/ml-0.025μg/ml；连翘苷的浓度范围0.1μm-100μm。4.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，葡萄糖酸锌的浓度为50μm；维生素a或其衍生物的浓度范围为：1μm-20μm。5.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，包括：2.5-10μm冬凌草甲素；或者2.5-50μm松柏醛；或者20μm绿原酸。6.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，包括：葡萄糖酸锌和1-5μm全反式维甲酸。7.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，包括冬凌草甲素和葡萄糖酸锌；或者包括冬凌草甲素、葡萄糖酸锌和全反式维甲酸。8.一种如权利要求1-5任一项所述药物的应用，其特征在于，包括以下任一应用或它们的组合：用于促进锌指抗病毒蛋白表达；用于促进呼吸道病毒核酸降解；用于提高细胞活力；以及用于修复线粒体损伤。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用于预防和治疗呼吸道病毒传播。10.一种抗呼吸道病毒的食品，其特征在于，包括以下任一成分或它们的组合物：锌剂、维生素a或其衍生物、以及天然化合物，所述天然化合物选自：冬凌草甲素、松柏醛、绿原酸、水飞雄黄或连翘苷。

技术总结
本发明公开了一种抗呼吸道病毒的药物、食品及其应用，属于医药技术领域，所述药物或食品包括以下任一成分或它们的组合物：锌剂、维生素A或其衍生物、以及天然化合物，所述天然化合物选自：冬凌草甲素、松柏醛、绿原酸、水飞雄黄和连翘苷。可促进锌指抗病毒蛋白表达，促进外来核酸的切割和降解，起到抗呼吸道病毒的作用。用。用。


技术研发人员：董雅琼 杨晓达
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/9/19