普拉梭菌的应用

1.本发明属于生物医药技术领域；具体涉及普拉梭菌的应用。


背景技术：

2.普拉梭菌(faecalibacteriumprausnitzii，f.prausnitzii)是一种革兰氏阳性菌，粪杆菌属，无芽孢、无鞭毛、专性厌氧。它是人类肠道中发现最丰富的肠道微生物之一，占健康人类粪便微生物总数5％。起初f.prausnitzii被归为梭杆菌属，后经研究发现其结构与柔嫩梭菌类群成员更接近，2002年duncan等建议建立新的菌属faecalibacterium，并将f.prausnitzii归入该菌属。f.prausnitzii具有维持肠道屏障功能、抗炎等重要作用，有望成为新一代益生菌。
3.f.prausnitzii是一种高度活跃的功能性肠道细菌，可为结肠细胞提供能量，协同抗炎作用维持肠道健康。f.prausnitzii可发酵葡萄糖，产生丁酸盐、d-乳酸盐和甲酸盐，还可有效利用果糖、淀粉和菊粉等。f.prausnitzii是胃肠道最主要产丁酸的细菌之一，丁酸盐作为结肠细胞主要能量来源，还参与调节免疫反应、抑制癌症进展、保护机体免受病原体侵袭等作用。大量研究证实，f.prausnitzii在炎症性肠病、肠易激综合症、结肠癌、肥胖和糖尿病等多种疾病中具有重要作用。f.prausnitzii相对丰度可作为成人肠道健康的标志物，其丰度减少是ibd的重要特征。
4.f.prausnitzii在多种疾病中得到越来越广泛的应用。调节肠道菌群已成为治疗和预防肠炎、结直肠癌和神经系统疾病等多种疾病的有效方法。目前，exeliom公司已开展关于f.prausnitzii治疗克罗恩病患者中安全性和有效性的相关1期试验，克服了f.prausnitzii操作难度的问题，使f.prausnitzii单菌补充成为治疗疾病的潜在手段。f.prausnitzii主要用于治疗炎症性肠病、代谢性疾病的治疗，是否可用于心血管疾病治疗尚无证据。


技术实现要素：

5.本发明目的是研究f.prausnitzii对老年心衰的影响，提出普拉梭菌的应用。
6.本发明通过以下技术方案实现：
7.普拉梭菌或包含普拉梭菌的食品、药物用于预防和/或治疗老年心衰的应用。
8.进一步的，所述普拉梭菌f.prausnitzii生产厂家为宁波明舟生物科技有限公司，菌种编号为dsm 17677，将f.prausnitzii应用梭菌培养基在严格厌氧环境中培养获得改良的f.prausnitzii。
9.进一步的，所述梭菌培养基的配方成分为胰酪蛋白胨10.0g/l、牛肉浸粉10.0g/l、酵母浸粉3.0g/l、葡萄糖5.0g/l、氯化钠5.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、l-半胱氨酸盐盐酸0.5g/l、乙酸钠3.0g/l、刃天青0.001g/l，所述梭菌培养基的ph为6.8
±
0.2。
10.进一步的，所述食品为膳食补充剂、益生元、固体饮料、乳制品中的任意一种。
11.进一步的，所述食品的剂型为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、液体剂中的一种。
12.进一步的，所述药物的剂型为液体剂或固体剂。
13.进一步的，所述液体剂的活菌浓度为108～10
10
cfu/ml。
14.进一步的，所述固体剂的活菌浓度为108～109cfu/g。
15.本发明的有益效果为：
16.本发明所述的普拉梭菌的应用，动物f.prausnitzii在老年心衰人群中丰度降低，补充f.prausnitzii可改善老年大鼠心脏功能，提示可作为老年心衰的防治靶点。本发明研究发现了动物f.prausnitzii治疗潜力，具有重大转化意义。
17.附图说明(图3-图9，最好替换为清晰的图，截图有点模糊)
18.图1为本发明中f.prausnitzii对老年心衰的影响的技术路线图。
19.图2为本发明中老年心衰患者粪便f.prausnitzii丰度对比图；
20.图3为本发明f.prausnitzii对老年心衰的影响的大鼠超声对比图；
21.图4为本发明f.prausnitzii对老年心衰的影响的射血分数统计对比图；
22.图5为本发明f.prausnitzii对老年心衰的影响的短轴收缩率统计对比图；
23.图6为本发明f.prausnitzii对老年心衰的影响的nt-probnp统计对比图；
24.图7为本发明f.prausnitzii对老年心衰的影响的心脏大体及he、masson染色对比图；
25.图8为本发明f.prausnitzii对老年心衰的影响的心脏体重比统计对比图；
26.图9为本发明f.prausnitzii对老年心衰的影响的心室纤维化统计对比图。
具体实施方式
27.具体实施方式一：
28.普拉梭菌或包含普拉梭菌的食品、药物用于预防和/或治疗老年心衰的应用。
29.进一步的，所述普拉梭菌f.prausnitzii生产厂家为宁波明舟生物科技有限公司，菌种编号为dsm 17677，将f.prausnitzii应用梭菌培养基在严格厌氧环境中培养获得改良的f.prausnitzii。
30.进一步的，所述梭菌培养基的配方成分为胰酪蛋白胨10.0g/l、牛肉浸粉10.0g/l、酵母浸粉3.0g/l、葡萄糖5.0g/l、氯化钠5.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、l-半胱氨酸盐盐酸0.5g/l、乙酸钠3.0g/l、刃天青0.001g/l，所述梭菌培养基的ph为6.8
±
0.2。
31.为研究f.prausnitzii对老年心衰的影响，首先，收集老年健康人群及老年心衰人群粪便样本，检测粪便样本中f.prausnitzii丰度。同时，构建老年大鼠粪便粪菌移植模型，模拟老年时肠道菌群改变。随机将成年大鼠分为两组，一组给予对照溶剂，一组给予老年大鼠粪便粪菌移植，一组同时给予老年大鼠粪菌移植和f.prausnitzii灌胃，f.prausnitzii每周3次灌胃。12周后应用小动物超声观察心功能变化；心室病理染色观察心室纤维化；elisa检测循环nt-probnp水平，如图1所示。
32.老年大鼠粪菌移植具体方法为收集老年大鼠粪便样本置于1.5ml ep管。合并的粪便样品在冷冻磷酸盐缓冲液(pbs，120mg粪便/1ml缓冲液)中稀释，并均化5分钟直至达到糊状稠度。将悬浮液涡旋1分钟并以800
×
g离心3分钟。收集上清液，等分后放置-80℃冰箱中备用。粪菌移植采用灌胃方式，每日一次灌胃，每次约1ml。大鼠第一次粪菌移植需肠道准备，在粪菌移植前3天给予奥美拉唑(50mg/kg/d)处理，为促进肠道排空在移植前24h和前
12h分别给予1ml和2ml的肠道清洁剂(匹可硫酸钠0.16mg/ml和氧化镁51.2mg/ml)，完成第一次菌群移植后，每周灌胃一次(无需肠道准备)。
33.研究应用f.prausnitzii购于宁波明舟生物科技有限公司，菌种编号为dsm 17677，研究中f.prausnitzii应用改良强化梭菌培养基在严格厌氧环境中培养获得。
34.培养基配制方法如下：改良型强化梭菌肉汤培养基(cmc，mb029b)成分如表1所示，分装至15ml离心管进行高温高压灭菌(高压灭菌参数为：0.1mpa，121℃，15分钟)。开启厌氧工作站，接通氮气、二氧化碳和混合气体(氮气80％、氢气10％、二氧化碳10％)，对厌氧工作站进行充分地换气15次，充分排出厌氧工作站中残留的氧气，再放入钯催化剂促进厌氧工作站中的氢气与残留氧气反应，以充分耗竭厌氧工资站中的氧气，保持工作站中严格的厌氧环境。将灭菌处理后的培养基放进厌氧工作站中除24小时，使培养基处于完全无养的状态。
35.取购买自上海宁波明舟科技有限公司的f.prausnitzii(msd 17677)甘油菌进行复苏。先取出甘油菌，解冻后将甘油菌全部取出置于10ml培养基中，培养24-72小时。
36.灌胃菌制备：取6ml处于对数生长期的f.prausnitzii菌液置于50ml离心管中，培养48小时至f.prausnitzii充分生长并且处于生长对数期。提前将甘油高温高压灭菌，高压灭菌参数为：0.1mpa，121℃，15分钟，将灭菌后的甘油置于厌氧工作站除氧24小时，用ph值为7.3的磷酸盐缓冲液(pbs)将甘油配置成10％。取处于生长对数期的f.prausnitzii进行离心，离心转速为3500rpm，离心时间为10min，弃去上清液，收集菌体，用10ml 10％甘油重悬，使用比浊法对普拉梭菌进行计数，使用10％甘油将普拉梭菌进行稀释，使其终浓度为109cfu/ml，置于-80℃冰箱冻存备用。每周三次灌胃，每次1ml。
37.表1改良强化梭菌培养基成分
38.胰酪蛋白胨(tryptose)10.0g/l牛肉浸粉(beefextract)10.0g/l酵母浸粉(yeastextract)3.0g/l葡萄糖(dextrose)5.0g/l氯化钠(nacl)5.0g/l可溶性淀粉(solublestarch)1.0g/ll-半胱氨酸盐盐酸(l-cysteinehcl)0.5g/l乙酸钠(sodiumacetate)3.0g/l刃天青(resazurin)0.001g/lph6.8
±
0.2(25℃)
39.研究结果：
40.1.老年心衰患者粪便f.prausnitzii丰度降低
41.收集住院患者粪便样本，连续入选30例老年健康和30例老年心衰患者，提取患者粪便样本中dna。qrt-pcr结果如图2所示，与老年健康组相比，老年心衰患者粪便f.prausnitzii丰度明显降低(p《0.01)。qrt-pcr检测各组f.prausnitzii丰度；n＝30。
42.2.补充f.prausnitzii减轻老年菌群失调相关心力衰竭
43.如图3、图4和图5所示，超声检查发现，与老年粪菌移植组(aged fmt)相比，老年粪菌移植+f.prausnitzii组(aged fmt+f.p)大鼠射血分数和短轴收缩率增加(p《0.05)。
44.如图6所示，elisa试剂盒检测发现，与老年粪菌移植组大鼠相比，老年粪菌移植+f.prausnitzii组大鼠血清nt-probnp水平明显降低(p《0.05)。
45.如图7、图8和图9所示，与老年粪菌移植组相比，老年粪菌移植+f.prausnitzii组大鼠心脏体重比有降低趋势。he染色结果显示，老年粪菌移植组大鼠心肌细胞排列紊乱、心肌断裂而老年粪菌移植+f.prausnitzii组大鼠心肌细胞排列较为规整。masson染色结果显示，与老年粪菌移植组大鼠相比，老年粪菌移植+f.prausnitzii组大鼠心室胶原沉积明显减少，纤维化程度减轻(p《0.05)。这些结果表明，补充f.prausnitzii减轻老年菌群失调相关心力衰竭。
46.具体实施方式二：
47.根据具体实施方式一所述的普拉梭菌的应用，所述食品为膳食补充剂、益生元、固体饮料、乳制品中的任意一种。
48.具体实施方式三：
49.根据具体实施方式一所述的普拉梭菌的应用，所述食品的剂型为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、液体剂中的一种。
50.具体实施方式四：
51.根据具体实施方式一所述的普拉梭菌的应用，所述药物的剂型为液体剂或固体剂。
52.具体实施方式五：
53.根据具体实施方式一所述的普拉梭菌的应用，所述液体剂的活菌浓度为108～10
10
cfu/ml。
54.具体实施方式六：
55.根据具体实施方式一所述的普拉梭菌的应用，所述固体剂的活菌浓度为108～109cfu/g。

技术特征：
1.普拉梭菌或包含普拉梭菌的食品、药物用于预防和/或治疗老年心衰的应用。2.根据权利要求1所述的普拉梭菌的应用，其特征在于，将f.prausnitzii应用梭菌培养基在严格厌氧环境中培养获得改良的f.prausnitzii。3.根据权利要求1或2所述的普拉梭菌的应用，其特征在于，所述梭菌培养基的配方成分为胰酪蛋白胨10.0g/l、牛肉浸粉10.0g/l、酵母浸粉3.0g/l、葡萄糖5.0g/l、氯化钠5.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、l-半胱氨酸盐盐酸0.5g/l、乙酸钠3.0g/l、刃天青0.001g/l，所述梭菌培养基的ph为6.8
±
0.2。4.根据权利要求3所述的普拉梭菌的应用，其特征在于，所述食品为膳食补充剂、益生元、固体饮料、乳制品中的任意一种。5.根据权利要求4所述的普拉梭菌的应用，其特征在于，所述食品的剂型为丸剂、胶囊剂、片剂、粉剂、液体剂中的一种。6.根据权利要求5所述的普拉梭菌的应用，其特征在于，所述药物的剂型为液体剂或固体剂。7.根据权利要求6所述的普拉梭菌的应用，其特征在于，所述液体剂的活菌浓度为108～10
10
cfu/ml。8.根据权利要求7所述的普拉梭菌的应用，其特征在于，所述固体剂的活菌浓度为108～109cfu/g。

技术总结
普拉梭菌的应用，它属于生物医药技术领域。本发明目的是研究F.prausnitzii对老年心衰的影响。本发明普拉梭菌或包含普拉梭菌的食品、药物用于预防和/或治疗老年心衰的应用。将F.prausnitzii应用梭菌培养基在严格厌氧环境中培养获得改良的F.prausnitzii。所述梭菌培养基的配方成分为胰酪蛋白胨10.0g/L、牛肉浸粉10.0g/L、酵母浸粉3.0g/L、葡萄糖5.0g/L、氯化钠5.0g/L、可溶性淀粉1.0g/L、L-半胱氨酸盐盐酸0.5g/L、乙酸钠3.0g/L、刃天青0.001g/L，所述梭菌培养基的PH为6.8


技术研发人员：李悦 韩雪杰 张云 魏荧 石玲 徐铭璐
受保护的技术使用者：哈尔滨医科大学
技术研发日：2023.07.10
技术公布日：2023/9/19