一种新型重组乙肝疫苗V_C4HBL

一种新型重组乙肝疫苗v_c4hbl
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种新型重组乙肝疫苗v_c4hbl。


背景技术：

2.慢性乙型肝炎(chronic hepatitis b,chb)是指由乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)持续感染引起的肝脏慢性炎症性疾病。hbv是目前己知的感染人的最小dna病毒之一，由hbv所引起的乙型肝炎是一种流行久远、传播广泛、危害严重的传染性疾病。hbv包膜包含3种表面包膜蛋白，分别为大包膜蛋白(l蛋白)、中包膜蛋白(m蛋白)和小包膜蛋白(s蛋白)。当病毒接近肝细胞表面时，其包膜上的l蛋白和s蛋白分别与肝细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(hspg)和牛磺胆酸钠协同转运多肽(ntcp)结合，并通过网格蛋白或细胞膜穴样内陷依赖的内吞作用介导病毒颗粒进入肝细胞。
3.由于肝脏具有独特的免疫调节功能，患者对hbv会存在免疫耐受(免疫耐受在免疫学上定义为：机体免疫系统接受特定抗原作用后产生的特异性无应答状态)，现有的乙肝疫苗预防治疗效果不理想，所以亟需一种能够打破免疫耐受的新型乙肝疫苗。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种新型重组乙肝疫苗v_c4hbl，以解决上述技术问题。
5.本发明目的之一在于提供一种新型重组乙肝疫苗v_c4hbl，由igv_ctla-4、不含信号肽的l蛋白和linker-ggggsggggsggggs组成。
6.优选的，氨基酸序列为seq id no:33。
7.本发明的有益效果在于：
8.(1)本发明基于igv_ctla-4的精准靶向作用，设计一款以l蛋白为靶抗原的新型重组乙肝疫苗v_c4hbl，被命名为v_c4hbl(seq id no:33)，v_c4hbl由igv_ctla-4、l蛋白和linker-ggggsggggsggggs组成。
9.l蛋白是hbv的重要组成部分，对病毒的感染起到决定性作用。本发明将目的蛋白l蛋白与igv_ctla-4使用linker-ggggsggggsggggs进行连接，将igv_ctla-4嵌合在l蛋白的n端，igv_ctla-4通过与抗原提呈细胞apc(antigen presenting cells,apcs)上的b7分子结合靶向apc细胞，增强apc细胞对l蛋白的特异性识别和抗原呈递，增强v_c4hbl的免疫原性，从而打破chb患者的免疫耐受，最终设计出新型重组乙肝疫苗v_c4hblv_c4hbl。
10.(2)本发明预测了l蛋白重组前后的理化性质，三级结构等，确认v_c4hbl不会影响l蛋白的生理化性质。
11.(3)本发明验证了v_c4hbl中含有效的l蛋白cd4
+
t细胞和b细胞表位，v_c4hbl可以激活cd4
+
t细胞和b细胞免疫应答。
12.(4)本发明利用分子对接技术，将设计的v_c4hbl与b7分子进行对接，以用来验证v_c4hbl与b7分子具有高度结合能力，从而证明机体免疫细胞可对v_c4hbl进行高效摄取及抗原呈递。
13.(5)本发明通过对chb患者pbmc进行分离培养，建立体外实验模型。在加入v_c4hbl进行刺激后，利用elisa检测pbmc培养基上清液的ifn-γ和il-4的含量，以及elispot技术检测特异性抗体分泌细胞(ascs)，验证了v_c4hbl可以特异性激活免疫细胞；同时采用fcm和if技术检测细胞对v_c4hbl的吞噬能力，从而证明疫苗增强了apc对抗原的摄取；利用免疫印迹(wb)检测chb患者血清里抗v_c4hbl的特异性抗体，证明v_c4hbl可以激活免疫细胞产生特异性的抗体。
14.(6)本发明通过对小鼠进行v_c4hbl的注射接种，建立了动物体内实验模型。完成三次接种后，运用流式细胞仪微球阵列(cab)技术检测小鼠脾细胞培养上清液中的ifn-γ和il-4，从而证实了v_c4hbl可以激活小鼠的特异性细胞免疫；采用elisa技术检测上清液中特异性抗体产生情况，从而验证疫苗的抗原性。因此，本发明通过体内外实验，证明了v_c4hbl具有良好的免疫原性，有望逆转chb患者对hbv的耐受，实现功能性治愈。
附图说明
15.图1为l蛋白的信号肽和跨膜区；(a)曲线代表l蛋白n端的70个氨基酸残基，其序数代表每个残基可能属于信号肽的概率；(b)纵轴代表ctla-4蛋白的氨基酸残基，横轴代表这些残基在不同细胞膜区域的概率；
16.图2为l蛋白三级结构的模型和质量验证；(a)该模型以二级结构的形式显示，红色代表α螺旋，绿色代表β转角，灰色代表任意卷曲；(b)深绿色是受青睐的区域，绿色是额外的允许区域，浅绿色是允许区域，白色是不允许的区域；
17.图3为v_c4hbl的三级结构图；(a)是不含信号肽的l蛋白与igv_ctla-4蛋白重组示意图；(b)是v_c4hbl三级结构示意图，图中红色代表a螺旋，绿色代表β转角，灰色代表任意卷曲；(c)深绿色是受青睐的区域，绿色是额外的允许区域，浅绿色是允许区域，白色是不允许的区域；
18.图4为不含信号肽的l蛋白与v_c4hbl对比图，(a)(b)(c)代表l蛋白；(d)(e)(f)代表v_c4hbl；
19.图5为b7-1和b7-2的单体结构模型。(a)是b7-1分子的分离过程示意图，最后得到b7-1的单体结构；(b)是b7-2分子的分离过程示意图，最后得到了b7-2的单体结构；
20.图6为分子对接示意图；(a)是不含信号肽的l蛋白与b7-1对接模式图；(b)是v_c4hbl与b7-1对接模式图；(c)l蛋白与b7-2对接模式图；(d)是v_c4hbl与b7-2对接模式图；
21.图7为对接复合物图；(a)是不含信号肽的l蛋白与b7-1对接的复合物；(b)是v_c4hbl与b7-1对接复合物；(c)不含信号肽的l蛋白、v_c4hbl与b7-1对接复合物得分；(d)是l蛋白与b7-2对接的复合物；(e)是v_c4hbl与b7-2对接的复合物；(f)l蛋白、v_c4hbl与b7-2对接复合物得分；
22.图8，图9，图10为l蛋白与v_c4hbl与b7分子对接的md分析图与主成分分析图；(8a)l蛋白与b7-1对接复合物的rmsd波动值为0～1.1nm；(8b)l蛋白与b7-1对接复合物的rmsf波动值为0.1～0.9nm；(8c)是v_c4hbl与b7-1复合物的rmsd波动值为0～0.8nm；(8d)v_c4hbl与b7-1复合物的rmsf波动值为0.1～1.3nm；(9a)l蛋白与b7-2对接复合物的rmsd波动值为0～0.9nm；(9b)l蛋白与b7-2对接复合物的rmsf波动值为0.2～1.3nm；(9c)v_c4hbl与b7-2对接复合物rmsd波动值为0～0.7nm；(9d)v_c4hbl与b7-2对接复合物的rmsf波动值为为0.1～
0.9nm；(10a)l蛋白与b7-1复合物中pc 1在-10～13之间，pc 2在-8～8之间；(10b)v_c4hbl与b7-1的复合物中，pcl在-10-5内，pc 2在-6-4内；(10c)与b7-2的复合物中，pc 1 465在-13～15之间，pc 2在-10～10之间；(10d)b7-2的复合物中，pc 1在-13～10内，pc 2在-11～6内。
23.图11为v_c4hbl的免疫模拟结果图；(a)是细胞因子水平；(b)是抗体水平；
24.图12为抗原蛋白的表达质粒图；(a)是l蛋白的质粒图；(b)是v_c4hbl的质粒图；
25.图13为流式细胞术检测结果图与免疫荧光检测结果图；(13a)与l蛋白结合的细胞平均比例为1.55％，与v_c4hbl蛋白结合的细胞平均比例为2.66％；展示了与两种蛋白结合的流式图；(13b)采用两独立样本t检验检测l组与v组之间的比例差异，与v_c4hbl蛋白结合的比例显著高于与l蛋白结合的比例,差异有统计学意义(t＝3.523，p《0.05)；(13c)使用image j软件对目标荧光斑点和细胞核进行计数。以靶点数与细胞核数比值作为吞噬抗原蛋白的相对水平，展示了l组v组的免疫荧光图；(13d)采用两个独立样本t检验检测l组与v组之间的相对水平差异，v_c4hbl蛋白相对水平显著高于l蛋白相对水平，差异有统计学意义(t＝2.209，p503《0.05)；
26.图14为elisa，elispot，wb实验结果图；(14a)是ifn-γ在对照组，l组，v组中的水平分析图；(14b)是il-4在对照组，l组，v组中的水平分析图；(14c)是ascs在l组和v组中的分泌情况图；(14d)是ascs在l组和v组分泌的含量统计学分析图；(14e)是慢性乙型肝炎患者体内存在的特异性抗hbv l蛋白抗体igg与v_c4hbl蛋白结合的条带图。
27.图15为体内实验中的疫苗接种流程图与cba检测脾细胞悬液中细胞因子的结果图；(15a)是v_c4hbl疫苗蛋白接种示意图；(15b)对照组，l组，v组中的ifn-γ和il-4的cba流式图；(15c)是ifn-γ在对照组，l组，v组中水平统计学分析图；(15d)是il-4在对照组，l组，v组中的水平统计学分析图；(15e)是elisa检测特异性抗体igg在对照组，l组，v组中水平的统计学分析图；
具体实施方式
28.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
29.获取新型重组乙肝疫苗v_c4hbl
30.s1、疫苗设计候选抗原
31.从美国国家生物信息中心(national center for biotechnology information,ncbi)获取了l蛋白以及ctla-4氨基酸序列。
32.通过在线预测服务器signalp5.0(https：services.healthtech.dtu.dk/service.php？signalp-5.0)预测l蛋白的信号肽，并将其去除，得到不含信号肽的l蛋白氨基酸序列(seq id no:1)：mggwsskp rqgmgtnlsvpnplgffpdhqldpafkansenpdwdlnphkdtwrdankvgvgafgpgftpphggllgwspqaqgilttvpatpppastnrqsgrqptpfspplrdthpqamqwnsttfhqtlqdprvralyfpaggsssgtvspaqntasaisstfsktgdpvpnmeniasgllgpllvlqagfflltkiltipqsldswwtslnflgetpvclgqnsqsqisshsptccppicpgyrwmclrrfiiflcilllclifllvlldyqgmlpvcplipgssttstgpcrtcttpaqgtsmfpscccskptdgnctcipipsswafakylwewasvrfywlsllvpfvqwfvglsptvwlsviwmmwywgpslyntlspfmpllpiffclwvyi。通过预测该序列不含信号肽，故此序列
用于疫苗设计。
33.ctla-4氨基酸序列为：hvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkatevrvtvlrqadsqvtevca atymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyviggggsggggsggggsmggwsskprqgmgtnlsvpnplgffpdhqldpafkansenpdwdlnphkdtwrdankvgvgafgpgftpphggllgwspqaqgilttvpatpppastnrqsgrqptpfspplrdthpqamqwnsttfhqtlqdprvralyfpaggsssgtvspaqntasaisstfsktgdpvpnmeniasgllgpllvlqagfflltkiltipqsldswwtslnflgetpvclgqnsqsqisshsptccppicpgyrwmclrrfiiflcilllclifllvlldyqgmlpvcplipgssttstgpcrtcttpaqgtsmfpscccskptdgnctcipipsswafakylwewasvrfywlsllvpfvqwfvglsptvwlsviwmmwywgpslyntlspfmpllpiffclwvyi。选取ctla-4氨基酸序列中的igv_ctla-4序列用于疫苗设计。利用在线软件tmh mm-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？tmhmm-2.0)预测ctla-4的跨膜区序列来验证igv_ctla-4序列的合理性，即检查igv_ctla-4序列是否是ctla-4蛋白的胞外区。经预测其属于ctla-4蛋白的胞外区结构。igv_ctla-4蛋白氨基酸序列为(seq id no:2)：
34.hvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkatevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsi ctgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyvi。
35.来自ncbi的igv_ctla-4序列与预测结果一致，实验结果见图1。图1为l蛋白的信号肽和跨膜区；(a)曲线代表l蛋白n端的70个氨基酸残基，其序数代表每个残基可能属于信号肽的概率；(b)纵轴代表ctla-4蛋白的氨基酸残基，横轴代表这些残基在不同细胞膜区域的概率，当概率》1时，代表阳性结果。
36.s2、利用服务器robetta对不含信号肽的l蛋白三级结构进行建模。
37.在模型质量验证中，swiss模型的ramachandran图显示不含信号肽的l蛋白模型具有93.97％的ramachandran有利区域(见图2)。图2为不含信号肽的l蛋白三级结构的模型和质量验证；(a)该模型以二级结构的形式显示，红色代表α螺旋，绿色代表β转角，灰色代表任意卷曲；(b)深绿色是受青睐的区域，绿色是额外的允许区域，浅绿色是允许区域，白色是不允许的区域。当赞成的区域大于90％时，模型的质量是好的。当赞成的区域大于90％时，认为模型的质量是好的。本发明选择了建模方法中置信度排序最好的模型1(见图2a)作为不含信号肽的l蛋白的三级结构。
38.接头linker-ggggsggggsggggs是一种刚性的接头肽，可以充分保证接头两端蛋白质结构的完整性，所以本发明选用接头linker-ggggsggggsggggs将igv_ctla-4连接到不含信号肽的l蛋白的n端(见图3a)。连接后组成疫苗v_c4hbl，其氨基酸序列为(seq id no:33)：hvaqpavvl assrgiasfvceyaspgkatevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyviggggsggggsggggsmggwsskprqgmgtnlsvpnplgffpdhqldpafkansenpdwdlnphkdtwrdankvgvgafgpgftpphggllgwspqaqgilttvpatpppastnrqsgrqptpfspplrdthpqamqwnsttfhqtlqdprvralyfpaggsssgtvspaqntasaisstfsktgdpvpnmeniasgllgpllvlqagfflltkiltipqsldswwtslnflgetpvclgqnsqsqisshsptccppicpgyrwmclrrfiiflcilllclifllvlldyqgmlpvcplipgssttstgpcrtcttpaqgtsmfpscccskptdgnctcipipsswafakylwewasvrfywlsllvpfvqwfvglsptvwlsviwmmwywgpslyntlspfmpllpiffclwvyi。
39.s3、对v_c4hbl三级结构进行建模。
40.利用在线服务器robetta对v_c4hbl三级结构进行建模，并利用swiss-model的structure assessment工具对蛋白空间结构进行评估。
41.选择来自robetta的排名最好的模型作为v_c4hbl的三级结构。在swiss-model的模型质量验证中，ramachandran图显示v_c4hbl模型具有91.46％的ramachand-ran有利区域。实验结果见图3b和图3c。图3为v_c4hbl的三级结构图；(a)是不含信号肽的l蛋白与igv_ctla-4蛋白重组示意图；(b)是v_c4hbl三级结构示意图，图中红色代表α螺旋，绿色代表β转角，灰色代表任意卷曲；(c)深绿色是受青睐的区域，绿色是额外的允许区域，浅绿色是允许区域，白色是不允许的区域。
42.s4、预测抗原表位
43.使用在线服务器iedb(http：//tools.iedb.org/mhcii/)来预测不含信号肽的l蛋白和v_c4hbl的辅助t淋巴细胞表位(htle)，并且选择hla-drb 1*09:01作为预测对象。
44.使用iedb的bepipred-2.0工具(http：//tools.iedb.org/bcell/)预测不含信号肽的l蛋白和v_c4hbl的线性b淋巴细胞表位(bles)(见表1)。
45.表1l蛋白和v_c4hbl的htles和bles对比
46.[0047][0048]
图4为不含信号肽的l蛋白与v_c4hbl对比图，(a)(b)(c)代表l蛋白；(d)(e)(f)代表v_c4hbl。实验结果如图4所示，不含信号肽的l蛋白的htles再次出现在v_c4hbl中，并且序列未改变，不含信号肽的l蛋白与v_c4hbl的htles匹配率达100％，这表明v_c4hbl中含有效的l蛋白cd4
+
t细胞表位，理论上可以激活cd4
+
t细胞免疫应答。
[0049]
不含信号肽的l蛋白的ble再次出现在v_c4hbl中，并且序列未改变，不含信号肽的l蛋白与v_c4hbl的htles匹配率达100％，这表明v_c4hbl中含有效的l蛋白b细胞表位，理论上可以激活b细胞免疫应答。
[0050]
s4、l蛋白与v_c4hbl的理化性质预测
[0051]
利用protparam工具来预测不含信号肽的l蛋白和v_c4hbl的物理化学性质，并且这些物理和化学性质将作为体内外实验以及疫苗表达的基础，同时利用标准疫苗应具有满意的抗原性和低变应原性。因此，本发明评价了v_c4hbl的有效性和安全性。使用在线软件vaxijen 2.0154(http：//www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/vaxijen/vaxijen.html)预测v_c4hbl的抗原性。此外，使用在线软件allertop 2.0(http：//www.ddg158pharmfac.net/allertop/)预测v_c4hbl的变应原性。
[0052]
l蛋白不稳定性指数(ii)＝53.53，此蛋白质为不稳定(当不稳定性指数大于40时，蛋白质不稳定)，脂肪族指数为78.25。疏水性的总平均值(gravy)为0.082，因此蛋白质为疏水蛋白(gravy在-2～2的范围内，负值表示亲水性，正值表示疏水性)。v_c4hbl与不含信号肽的l蛋白理化性质相似，其不稳定性指数为(ii)50.75，疏水性的总平均值为0.100，为不稳定的疏水蛋白。在变应原性分析中，v_c4hbl为非变应原。在抗原性分析中，选择的预测模型是病毒，并且该模型的阈值是0.4。总的保护性抗原预测值为0.4975，提示v_c4hbl可作为抗原实现免疫激活。
[0053]
s5、分子对接
[0054]
b7是一类参与先天免疫的重要蛋白分子，也是非特异性免疫和特异性免疫之间的桥梁。b7分子广泛存在于组织的apc上，主要存在于细胞上。其可以激活机体apc识别dna病毒感染的特异性反应。为了证明v_c4hbl可以与b7分子具有高度结合力，本发明利用lzerd web server 2021.6(https://lzerd.kiharalab.org/upload/upload/)来进行分子对接，验证了v_c4hbl与b7的相互作用，以不含信号肽的l蛋白与b7的相互作用为对照。
[0055]
在pdb数据库中，人b7-1/ctla-4共刺激复合物的id为1i8l，b7-2/ctla-4共刺激复合物的id为1i85。下载的这两个共刺激复合物均为二聚体状态，经ds软件编辑后得到b7
ꢀ‑
1和b7-2的单体结构模型(见图5)。
[0056]
输出每个复合体的对接模式图，并且本发明挑选具有最高结合得分的最高排名对接模式图作为最终结果。图6为分子对接示意图；不含信号肽的l蛋白与b7-1的最佳对接模式图(见图6a)，v_c4hbl与b7-1的最佳对接模式图(见图6b)，l蛋白与b7-2的最佳对接模式图(见图6c)，并且v_c4hbl与b7-2的最佳对接模式图(见图6d)。
[0057]
(1)对接质量评价指标的差异性分析
[0058]
方法：利用广义方向相关全原子势(goap)统计残基(原子)平均状态。利用itscore统计原子相互作用势。采用spss26.0软件对数据进行统计学处理，用graphpad prism 9软件绘制统计图表。在lzerd web server 2021.6执行的对接项目中，利用goap得分、dfire得分、和itscore得分评估对接质量评价指标。
[0059]
结果：图7为对接复合物图；(a)是不含信号肽的l蛋白与b7-1对接的复合物；(b)是v_c4hbl与b7-1对接复合物；(c)是不含信号肽的l蛋白、v_c4hbl与b7-1对接复合物得分；(d)是l蛋白与b7-2对接的复合物；(e)是v_c4hbl与b7-2对接的复合物；(f)是l蛋白、v_c4hbl与b7-2对接复合物得分。
[0060]
在不含信号肽的l蛋白与b7-1对接复合物的中，goap得分平均值为-57037.04，dfire得分平均值为-46090.52，goap得分平均值为-24096.74；在v_c4hbl与b7-1对接的所有复合物中，goap评分平均值为-78128.99，dfire评分平均值为-58711.45，goap评分平均值为-30677.37(见图7c)。在两独立样本t检验中，三种v_c4hbl与b7-1的对接得分显著高于l蛋白与b7-1的对接得分(t＝524.757，p《0.001；t＝703.765，p《0.001；t＝971.166，p《0.001)。
[0061]
在不含信号肽的l蛋白与b7-2对接的复合物中，goap得分平均值为-41295.19，dfire得分平均值为-39237.12，goap得分平均值为-20292.34；在v_c4hbl与b7-2对接的复合物中，goap评分平均值为-62543.91，dfire评分平均值为-51843.66，并且goap评分平均值为-26881.56(图7f)。三种v_c4hbl与b7-2对接评分均显著高于不含信号肽的l蛋白与b7-2对接评分(t＝781.821，p《0.001；t＝996.725，p《0.001；t＝1263.134，p《0.001)。
[0062]
(2)md模拟的rmsd与主成分分析
[0063]
方法：1、选择上述最高质量的对接复合物作为实施md模拟，利用200nsmd模拟四对接复合物。2、采用md模拟的主成分分析，将最关键的主成分1(pc 1)和主成分2(pc 2)的投影到二维绘图，以观察蛋白质的构象状态在pc相空间。
[0064]
结果1：图8,9,10为不含信号肽的l蛋白与v_c4hbl与b7分子对接的md分析图与主成分分析图；图8显示l蛋白与b7-1复合物的rmsd波动值为0～1.1nm(见图8a)，显示v_c4hbl与b7-1复合物的波动值为0～0.8nm(图8c)；不含信号肽的l蛋白与b7-2对接的复合物波动值为(见图9a)，v_c4hbl与b7-2对接的复合物波动值为(图10d)。rmsd轨迹的波动范围很小，不含信号肽的l蛋白与b7和v_c4hbl与b7的差异很小，这表明复合物的对接系统是稳定的；l蛋白与b7-1复合物的rmsf波动值为(图8b)，v_c4hbl与b7-1复合物的波动值为(图8d)；l蛋白与b7-2对接的复合物波动值为(图9b)，v_c4hbl与b7-2对接的复合物波动值为为(图9d)。rmsf轨迹中复合物之
间的小波动范围和低可变性表明对接复合物是稳定的。
[0065]
结果2：l蛋白与b7-1复合物中pc 1在-10～13之间，pc 2在-8～8之间(图10a)，在v_c4hbl与b7-1的复合物中，pcl在-10-5内，pc 2在-6-4内。(图10b)，因此具有b7-1复合物的l蛋白的pca波动比具有b7-1复合物的v_c4hbl的波动更剧烈。此外，在l蛋白与b7-2的复合物中，pc 1465在-13～15之间，pc 2在-10～10之间(图10c)，在v_c4hbl与b7-2的复合物中，pc 1在-13～10内，pc 2在-11～6内467(图10d)，因此具有b7-2复合物的l蛋白的pca波动比具有b7-2复合物的v_c4hbl的波动更剧烈。上述结果表明，v_c4hbl与b7分子的对接比l蛋白与b7分子的对接更稳定。
[0066]
(3)md模拟的mm/pbsa计算
[0067]
利用md模拟的mm/pbsa计算分子力学和溶剂化自由能两部分。其中，分子力学能(δggas)由waals相互作用能(δvdwaals)和静电能(δeel)组成；溶剂化能(δgsolv)为由极性溶剂化能(δegb)和非极性溶剂化能(δesurf)组成。总结合自由能(δtotal)是δggas和δgsolv的总和。
[0068]
具有b7-1的δtotal
l蛋白
为-67.73kj/mol，具有b7-1的δtotal
v_c4hbl
为-46.58kj/mol；具有b7-2的δtotal
l蛋白
为-55.23kj/mol，具有b7-2的δtotal
v_c4hbl
为-52.18kj/mol(见表2)。结合自由能的值越小，结合力越强。因此，v_c4hbl与b7分子的结合力比l和b7分子的结合力强。
[0069]
表2|mm/pbsa计算的四种配合物平均结合自由能
[0070][0071][0072]
s6、免疫模拟
[0073]
利用c-immsim服务器进行在线免疫模拟，疫苗接种策略与体内实验一致。随机种子设定为1000，注射时间步长分别设定为1、42和84(接种间隔2周)。将“a mhc i类”设定为a0201和a2402，将“b mhc i类”设定为b1301和b1501，并且将“dr mhc ii类”设定为drb1_0701和drb1_1501。其他参数设置为默认值。
[0074]
免疫模拟结果显示，相应的细胞因子如ifn和il-4水平在疫苗接种后短时间内升高(见图11a)。同时，iggl、igg 2和igm的抗体储备也随着疫苗接种而持续增加(见图11b)。
[0075]
s7、体外实验
[0076]
本发明选择新疆医科大学第一附属医院感染科门诊确诊的慢性乙型肝炎患者48
例，年龄18～60岁。同时纳入10名健康人(18～60岁成人)。所有入选患者均符合中国chb诊断和治疗指南。采集所有受试者的外周血(4ml/人)，分离并保存chb患者的外周血单个核细胞(pbmcs)和所有受试者的血浆，用于后续的体外实验。l蛋白和v_c4hbl两种抗原蛋白的密码子优化和蛋白表达委托生工生物工程(上海)有限公司完成(见图12)。本发明用质粒pet-30a(+)表达了l和v_c4hbl，并采用多种实验技术对v_c4hbl疫苗的效果进行了验证。图12为l蛋白和v_c4hbl的质粒图谱。
[0077]
在体外实验中，用v_c4hbl对分离培养的细胞进行刺激，采用fcm和if技术检测人细胞对v_c4hbl的吞噬能力，从而证明疫苗增强了apc对抗原的摄取；pbmc培养基中加入v_c4hbl，利用elisa检测培养基上清液的fn-γ和il-4，elispot技术检测特异性抗体分泌细胞(ascs)，从而验证疫苗激活了特异性免疫细胞；免疫印迹(wb)检测疫苗与chb患者血清特异性抗体产生情况，以用来测定疫苗的抗原性。对照刺激物为l蛋白。
[0078]
(1)fcm实验
[0079]
在所有细胞中，与不含信号肽的l蛋白结合的细胞平均比例为1.55％，与v_c4hbl结合的细胞平均比例为2.66％。采用两独立样本t检验检测l组与v组之间的比例差异。经spss26.0软件分析，与v_c4hbl结合的比例显著高于与l蛋白结合的比例，差异有统计学意义(t＝3.523，p《0.05)(见图13a和图13b中)，图13为流式细胞术检测结果图与免疫荧光检测结果图。
[0080]
(2)if实验
[0081]
本发明使用image j软件对目标荧光斑点和细胞核进行计数。以靶点数与细胞核数比值作为细胞吞噬抗原蛋白的相对水平。l组中l蛋白的相对含量为4.42，v组中v_hbl蛋白的相对含量为5.58。采用两个500个独立样本t检验检测l组与v组之间的相对水平差异。经spss26.0软件分析，v_c4hbl相对水平显著高于l蛋白相对水平，差异有统计学意义(t＝2.209，p503《0.05)(见图13c和图13d)。
[0082]
(3)elisa实验
[0083]
采用elisa检测抗原蛋白刺激pbmc后ifn-γ和il-4的分泌。测定后，对照组ifn-γ分泌量平均值为31.04pg/ml，l组ifn-γ分泌量平均值为452.99pg/ml，v组ifn-γ分泌量平均值为570.63pg/ml。对照组il-4平均分泌量为20.84pg/ml，l组il-4平均分泌量为99.57pg/ml，v组il-4平均分泌量为127.15pg/ml。采用两独立样本t检验检测对照组、l组和v组之间ifn-γ和il-4分泌量的差异。l组ifn-γ的分泌量显著高于对照组(t＝-14.181，p《0.001)，v组ifn-γ的分泌量显著高于l组中的分泌量(t＝-3.100，p《0.01)(图14a)。l组中il-4的分泌量显著高于对照组中的分泌量(t＝-14.473，p《0.001)，并且v组中il-4的分泌量显著高于l组中的分泌量(t＝-3.047，p《0.01)(图14b)。
[0084]
(4)elispot实验
[0085]
本发明检测了chb患者pbmc中的ascs。用抗原蛋白刺激pbmc后，发现v_c4hbl对b细胞的激活作用比l蛋白更明显。l组平均免疫斑点数为217个，v组平均免疫斑点数为402个，差异有统计学意义(t＝6.097，p《0.001)(见图14c和图14d)。图14为elisa，elispot，wb实验结果图。
[0086]
(5)wb实验
[0087]
用westernblot法检测患者血清中抗v_c4hbl的特异性抗体。慢性乙型肝炎患者体内存在特异性抗hbv l蛋白抗体，因此，当v_c4hbl与患者血清一起孵育时，可以产生约57kda的靶条带(见图14e)。
[0088]
s8、体内实验
[0089]
方法：本发明通过对小鼠进行v_c4hbl的注射接种，建立了动物体内实验模型。完成三次接种后，运用流式细胞仪微球阵列(cab)技术检测小鼠脾细胞培养上清液中的ifn-γ和il-4，从而证实了v_c4hbl可以激活小鼠的特异性细胞免疫；采用elisa技术检测上清液中特异性抗体产生情况，从而验证疫苗的抗原性。
[0090]
结果：本发明建立了体内实验对疫苗的免疫效果近行了评估，使得项目依据更为可靠。本发明通过对小鼠进行v_c4hbl注射接种，建立了动物体内实验模型(见图15a)，图15为体内实验中的疫苗接种流程图，cba检测脾细胞悬液中细胞因子水平与特异性抗体统计的结果图。完成三次接种后，运用流式细胞仪微球阵列(cab)技术检测小鼠脾细胞培养上清液中的ifn-γ和il-4，从而证实了v_c4hbl可以激活小鼠的特异性细胞免疫。采用elisa技术检测上清液中特异性抗体产生情况，从而验证疫苗的抗原性。在脾细胞培养上清液中流式图见图15b，ifn-γ的浓度在对照组中为14.91pg/ml，在l组中为95.86pg/ml，在v组中为188.12pg/ml(见图15c)。l组ifn-γ浓度水平显著高于对照组(t＝-25.517，p《0.001)，v组ifn-γ浓度水平显著高于l组(t＝-17.958，p《0.001)。il-4的浓度在对照组中为11.89pg/ml，在l组中为51.72pg/ml，在v组中为88.43pg/ml(见图15d)。l组的il-4浓度水平显著高于对照组(t＝-14.320，p《0.001)，v组的il-4浓度水平显著高于l组(t＝-10.801，p《0.001)。elisa实验中，对照组总igg浓度为39.17μg/ml，l组为82.19μg/ml，在v组中为124.05ug/ml(见图15e)。l组的总igg浓度水平显著高于对照组(t＝-6.178，p《0.001)，v组的总igg浓度水平显著高于l组(t＝-5.030，p《0.01)。
[0091]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种新型重组乙肝疫苗v_c4hbl，其特征在于，由igv_ctla-4、不含信号肽的l蛋白和linker-ggggsggggsggggs组成。2.根据权利要求1所述的新型重组乙肝疫苗v_c4hbl，其特征在于，氨基酸序列为seq id no:33。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体公开了一种新型重组乙肝疫苗V_C4HBL，由IgV_CTLA-4、不含信号肽的L蛋白和Linker-GGGGSGGGGSGGGGS组成，氨基酸序列为SEQ ID NO:33。本发明公开的重组乙肝疫苗能够增强慢性乙型肝炎患者体内的免疫反应，能够打破对乙型肝炎病毒的耐受，实现功能性治愈，可能成为未来慢性乙型肝炎临床治疗的有效疫苗。床治疗的有效疫苗。床治疗的有效疫苗。


技术研发人员：朱玥洁 何月月 于明凯 张峰波 鲁晓擘 郑荣炅 李玉娇 韩锐 丁剑冰
受保护的技术使用者：新疆医科大学第一附属医院
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/9/19