一种ASFVp30蛋白单克隆抗体及其应用

一种asfvp30蛋白单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种asfvp30蛋白单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟(africanswine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(asf virus,asfv)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，可感染不同年龄的家猪和野猪，表现为急性、亚急性、慢性和亚临床等多种形式。分子流行病学调查显示，猪场流行的asfv越来越复杂，毒株不断发生遗传演化，除了导致急性出血性死亡的高致病性毒株，也有致病性较低、临床症状温和的基因缺失或突变毒株流行。这些低致病性毒株的慢性或亚临床感染，可造成asf的长期流行与危害。asf于1921年在肯尼亚首次发现，随后在非洲流行；1957年从非洲传到了葡萄牙，并在欧洲多个国家迅速蔓延，同时期美洲如古巴、巴西、海地等国家也流行过该病；2007年，asf传到了格鲁吉亚和俄罗斯，并在东欧多个国家蔓延。长期以来asf是全球养猪业发展和相关产品贸易往来的重要威胁，世界卫生组织(world organization for animal health，oie)将其列为法定报告动物疫病。自2018年asf首次传入中国以来，该病在国内迅速蔓延流行，截止到2019年即该病流行一周年时，asf导致中国损失1.909亿头猪，其中母猪2940万头，生猪存栏量下降40.5％，根据有的学者推算asf造成的直接经济损失高达1万亿人民币。
3.多年来，人们不断努力地研究不同类型的asf疫苗，但迄今仍然没有有效、安全的疫苗用于临床。对猪群进行监测、检测和剔除感染猪是目前防控asf的主要措施。
4.因此，研发一种可以检测asfv抗体的方法对于生猪养殖具有重大意义。


技术实现要素：

5.针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种asfv p30蛋白单克隆抗体，基于该asfv p30蛋白单克隆抗体，可以使用阻断elisa方法对非洲猪瘟病毒抗体进行检测，基于该asfv p30蛋白单克隆抗体建立的方法特异性强，灵敏度高，稳定性好，准确率高。
6.为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：
7.本发明一方面提供一种asfv p30蛋白单克隆抗体，其能够识别的p30蛋白的抗原表位115aa-134aa。
8.本发明另一方面提供一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa试剂，其包括上述的asfv p30蛋白单克隆抗体。
9.本发明另一方面提供一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa试剂盒，其包括上述的asfv p30蛋白单克隆抗体或上述的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa试剂。
10.本发明再一方面提供一种检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，其包括：将上述的asfv p30蛋白单克隆抗体作为被阻断酶标记抗体使用阻断elisa方法进行检测。
11.本发明再一方面提供一种上述的asfv p30蛋白单克隆抗体在检测非洲猪瘟病毒
及其抗体中的应用。
12.本发明中的杂交瘤细胞株p30-g10的保藏信息为：保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cctcc)；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；保藏日期：2022年03月08日；保藏编号：cctcc no:c202329。
13.本发明有益效果包括：基于本发明提供的asfv p30蛋白单克隆抗体作为被阻断酶标抗体对非洲猪瘟病毒抗体构建阻断elisa方法进行检测，该检测方法与csfv、prrsv及prv等抗血清均无交叉反应；最低能检出1∶512稀释的阳性血清特异性抗体；批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.116％和5.187％；与商品试剂盒的阳性符合率92.31％，阴性符合率92.38％，总符合率为92.36％。
附图说明
14.图1为asfvp30蛋白的表达与纯化的sds-page分析；
15.图2为p30蛋白的western-blot鉴定；
16.图3为重组asfvp30免疫小鼠的血清特异性抗体效价；
17.图4为重组asfvp30单克隆抗体融合后5d细胞克隆；
18.图5为单克隆抗体腹水纯化结果；
19.图6为细胞上清中的单克隆抗体效价；
20.图7为腹水抗体效价；
21.图8为单克隆抗体的westernblot鉴定；
22.图9为单克隆抗体的ifa鉴定；
23.图10为单克隆抗体的相对亲和力分析；
24.图11为p30单克隆抗体的特异性分析；
25.图12为elisa检测单克隆抗体的抗原识别区域；
26.图13为单克隆抗体c7和g10与p30蛋白肽段(100-134aa、130-164aa和160-194aa)的反应；
27.图14为单克隆抗体c7和g10与p30蛋白表位115-134的反应；
28.图15为hrp标记的腹水抗体效价；
29.图16为p30阻断elisa阴性血清pi值的正态分布分析；
30.图17为p30阻断elisa的特异性分析；
31.图18为p30阻断elisa的敏感性分析；
32.其中，图1中，m:低分子量蛋白标准；1-2：p30重组菌诱导前后；3:p30蛋白纯化后；4：p30蛋白透析复性后；图5中，m:低分子量蛋白标准；1-2：单克隆抗体c7腹水纯化前后；3-4：单克隆抗体g10腹水纯化前后；图8中，m：预热蛋白分子量标准；1、6：p30蛋白；2、7：p30n端蛋白；3、8：p30c端蛋白；4、9：pet-32a空载体诱导后；5、10：asfvmgf360蛋白；图9中，a-c:c7与pcdna3.1-p30(100-194aa)转染vero细胞的反应；d-f：g10与pcdna3.1-p30(100-194aa)转染vero细胞的反应；g-i：c7与pcdna3.1-p30(1-105aa)转染vero细胞的反应；j-l：g10与pcdna3.1-p30(1-105aa)转染vero细胞的反应；m-o:c7与pcdna3.1空质粒转染vero细胞的反应；图13中，(1-3：分别为肽段：100-134aa、130-164aa和160-194aa；4-6：分别为bsa、asfvp72和cd2v蛋白；7：p30蛋白)；图14中，1：115-134aa肽段；2：bsa；3：p30蛋白。
具体实施方式
33.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
34.本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
35.本发明实施例提供一种asfv p30蛋白单克隆抗体，其能够识别的p30蛋白的抗原表位115aa-134aa。
36.在一些具体实施例中，p30蛋白抗原表位的多肽包括如seq id no.1所示序列。
37.需要说明的是，asfvp30蛋白是asfv的重要结构蛋白，在病毒感染的早期表达，并持续整个感染期，是asfv检测方法研究的主要靶蛋白之一。
38.还需要说明的是，本发明将纯化的重组asfvp30蛋白与弗氏佐剂乳化后，免疫6w-8w雌性balb/c小鼠，第3次免疫后14天，对小鼠进行腹腔冲击免疫；冲击免疫后第3天取小鼠脾脏，分离脾细胞，将脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接elisa方法筛选分泌p30蛋白特异性抗体的阳性杂交瘤细胞。在对阳性杂交瘤细胞经过3-4次亚克隆后，最终获得了2株稳定分泌asfv p30蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,mab)的杂交瘤细胞株(c7和g10)。2株杂交瘤细胞株分泌的抗体均为igg1亚类和kappa链(igg1κ)。c7和g10杂交瘤细胞培养上清液中的抗体效价分别为1∶1280和1∶320。western blot和间接免疫荧光试验(ifa)鉴定结果显示，单克隆抗体c7和g10均能够与p30蛋白c端(100aa-194aa)特异性结合；不与猪流行性腹泻病毒s蛋白、asfv-p72蛋白、猪圆环病毒2型衣壳蛋白等发生交叉反应。进而，针对p30蛋白c端(100aa-194aa)的氨基酸序列，设计合成了4条多肽，应用间接elisa和斑点免疫印迹试验对单克隆抗体c7和g10识别的抗原表位进行了鉴定，结果显示2株抗体识别的抗原表位相同，即p30
115 ctssfetlfeqepssevpkd
134
(seq id no.1)。
39.另外，本发明实施例获得的2株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体类型均为igg1κ，与yu x(张鑫宇,左伟勇,朱善元,等.非洲猪瘟病毒p54抗体胶体金试纸检测方法的建立.中国预防兽医学报,2014,36(04):281-285.)报道的抗体类型一致，但不同于zhou等制备的两株p30单克隆抗体的亚类(igg2a和igg2b)。在表位鉴定过程中，为了减少合成肽段的数量和降低工作量，本发明实施例采用逐步缩小抗体结合p30肽段的策略。首先构建了表达p30蛋白n
′
端(1aa-105aa)和c
′‑
端(100aa-194aa)的原核和真核表达质粒，通过转化大肠杆菌和转染vero细胞表达相应蛋白片段，经western blot和免疫荧光实验鉴定后，明确两株抗体均能够与p30-c端结合。然后，根据c端的氨基酸序列，人工合成了3个肽段(100aa-134aa、130aa-164aa和160aa-194aa)，证明两株抗体均与肽段100aa-134aa结合。最后结合网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)对p30蛋白序列抗原表位的预测结果，合成了肽段115aa-134aa，并最后证明2株单克隆抗体均能够识别抗原表位115aa-134aa。
40.本发明另一实施例提供一种用于检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂，其包括上述的
asfv p30蛋白单克隆抗体。
41.需要说明的是，基于上述的asfv p30蛋白单克隆抗体，除可用于检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa试剂，还可以包括非洲猪瘟病毒抗原抗体反应进行检测的辅助检测试剂，比如显色剂，缓冲液等。
42.本发明另一实施例提供一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa试剂盒，其包括上述的asfv p30蛋白单克隆抗体或上述的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa试剂。
43.需要说明的是，本发明的elisa试剂盒根据特异性多克隆抗体(抗血清)阻断酶标记单克隆抗体检测抗体的原理构建，可通过包括但不限于elisa、酶免试纸条、胶体金检测试纸条、荧光试纸条等方法实现抗原检测。另外，elisa试剂盒还可以包括包被有asfv p30抗原蛋白的包被板、酶标单克隆抗体、样品稀释液、20
×
浓缩洗涤液、阳性对照、阴性对照、显色液、终止液等。
44.本发明再一实施例提供一种检测非洲猪瘟病毒的方法，其可以包括：将上述的asfv p30蛋白单克隆抗体作为被阻断酶标记抗体使用阻断elisa方法进行检测。
45.需要说明的是，上述阻断elisa方法为本发明所已知的方法，可以包括以下步骤：先将asfv p30蛋白作为包被抗原进行稀释，将被阻断抗体使用标记酶进行标记；然后将稀释后的包被抗原加入酶标板，孵育，过夜，洗涤，封闭；将asf抗血清和asf阴性血清进行稀释后加入酶标板反应；加入酶标记后的被阻断抗体进行反应；洗涤，显色；酶标仪测定od
450nm
值，并计算阻断率，从而判断待检血清的asfv抗体情况。
46.在一些具体实施例中，上述检测非洲猪瘟病毒抗体的方法中，asfv p30蛋白的包被浓度优为0.5μg/ml，待检血清和酶标被阻断抗体的稀释倍数分别优选为1∶2和1∶1000；和/或封闭液优选为含5％脱脂奶粉pbst。另外，37℃下，asfv p30蛋白抗原-待检血清的反应时间优选为60min；p30蛋白抗原-酶标被阻断抗体的反应时间优选为45min。
47.需要说明的是，标记酶可以为本领域所已知的，比如辣根过氧化酶等。另外，在建立阻断elisa方法过程中，抗原包被浓度，样品稀释液、待检血清的稀释倍数以及酶标阻断抗体的工作浓度等与检测方法的敏感性和特异性都有着密切的联系。本发明实施例首先摸索了抗原包被浓度和血清稀释倍数，发现血清的稀释倍数与间接elisa检测过程中的相差很多，最终确定血清稀释倍数为1∶2稀释，所以，不能机械套用其他方法来确定血清稀释倍数。随后本发明实施例对封闭液/稀释液与酶标抗体的工作浓度进行了优化，选出5％脱脂奶粉pbst为最佳的稀释液，酶标抗体的工作浓度选用的是1∶1000倍稀释。另外，反应时间对elisa的结果也有着至关重要的作用，抗原抗体的最佳结合温度是37℃，因此本发明实施例在反应条件摸索过程中均采用37℃来反应，最终确定了封闭时间为37℃30min，抗血清反应时间为37℃1h，酶标单克隆抗体反应时间为37℃45min。为了检测方法的特异性，本发明实施例使用4种临床上猪病的标准阳性血清(csfv、prv、prrsv、pcv2)进行检测，结果发现pi值均在阴性临界值以下，说明建立的方法有着良好的特异性。
48.还需要说明的是，张冯禧等[张冯禧,肖琦,朱家平,等.非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断elisa方法的建立[j].中国农业科学,2022,55(16):3256-3266]建立了基于p30蛋白单克隆抗体的阻断elisa方法，通过与商品化试剂盒检测相同的血清比较符合率，阳性符合率为90.92％，本发明实施例建立的方法与试剂盒的阳性符合率为92.31％，高于张冯禧等建立的方法。在进行敏感性检测时，本发明实施例用建立的方法检
测了5份asf抗体阳性血清效价，结果显示检测的敏感度为1∶64-1∶512，这是由于血清内抗体水平不一致导致的，因此检测的不同血清抗体的效价也会有所差异，本发明建立的elisa方法最低检测限度为1∶512，高于周改静[改静,罗俊聪,石正旺，等.非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断elisa抗体检测方法的建立[j].畜牧兽医学报,2022:1-10]等、于浩洋于浩洋,王彩霞,吴绍强,等.非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断elisa检测方法的建立[j].中国兽医科学,2022,52(01):48-55]等所建立的elisa方法的敏感性，说明本发明实施例建立的检测方法有着良好的灵敏度。
[0049]
在一些具体实施例中，上述检测非洲猪瘟病毒抗体的方法中当阻断率≥26.58％，待检血清判为非洲猪瘟病毒抗体阳性；当21.42％≤阻断率＜26.58％时，待检血清判为可疑；当阻断率＜21.42％时，待检血清判为阴性。
[0050]
需要说明的是，本发明中的检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，是采用阻断elisa方法进行反应，根据阻断率来进行判定待检血清中的非洲猪瘟病毒抗体的情况，按照上述最优选的检测反应条件时，当21.42％≤阻断率＜26.58％时，待检血清判为可疑；当阻断率＜21.42％时，待检血清判为阴性。另外，判定为可疑的可间隔1-2周再次采集样品重新检测。
[0051]
本发明再一实施例提供一种上述的asfv p30蛋白单克隆抗体在检测非洲猪瘟病毒及其抗体中的应用。
[0052]
本发明再一实施例提供一种分泌上述的asfv p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏编号为cctcc no:c202329。
[0053]
需要说明的是，本实施例筛选出了2株稳定分泌p30的杂交瘤细胞，均分泌igg1类抗体，相对igm型抗体较稳定，容易提取和纯化。
[0054]
另外，本实施例使用原核表达的重组pet-28a-asfv p30蛋白作为免疫原免疫小鼠，刺激小鼠产生特异性抗体，表达的蛋白带有his标签，且蛋白纯化可能仍存在大肠杆菌裂解产物，因此在筛选杂交瘤细胞的过程中，除使用p30蛋白作为包被抗原，还使用了相同诱导条件下pet-28a空载体诱导后的裂解产物作为包被抗原与p30蛋白同时筛选，排除与pet-28a空载体诱导后裂解产物非特异性反应的阳性孔。后续使用带有his标签的pedv s蛋白、pcv2 cap蛋白做特异性检测，筛选出2株能够特异性识别p30蛋白、不与杂蛋白反应、高亲和性的阳性杂交瘤细胞。
[0055]
还需要说明的是，本发明中使用原核表达的重组pet-28a-asfv p30蛋白作为免疫原免疫小鼠，刺激小鼠产生特异性抗体，表达的蛋白带有his标签，且蛋白纯化可能仍存在大肠杆菌裂解产物，因此在筛选杂交瘤细胞的过程中，除使用p30蛋白作为包被抗原，还使用了相同诱导条件下pet-28a空载体诱导后的裂解产物作为包被抗原与p30蛋白同时筛选，排除与pet-28a空载体诱导后裂解产物非特异性反应的阳性孔。后续使用带有his标签的pedv s蛋白、pcv2 cap蛋白做特异性检测，筛选出2株能够特异性识别p30蛋白、不与杂蛋白反应、高亲和性的阳性杂交瘤细胞。
[0056]
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
[0057]
以下实施例中，sp2/0骨髓瘤细胞、vero细胞、原核表达质粒pet32a(+)、pet-28a(+)和真核表达质粒pcdna3.1(+)质粒、大肠杆菌(escherichia coli,e.coli)感受态细胞dh5α和rosetta(de3)均由河北农业大学传染病实验室保存，pet-28a-asfv p30重组质粒由
河北农业大学传染病实验室构建并保存。
[0058]
以下实施例中，spf级balb/c小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0059]
以下实施例中，hrp标记和fitc标记的山羊抗小鼠igg，购自北京索莱宝生物科技有限公司；抗his标签鼠源单克隆抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司；asfv抗体阳性、阴性猪血清及临床血清，由保定市动物疫病预防控制中心保存。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)s蛋白、asfv-p72蛋白、asfv-cd2v蛋白、asfv-mgf360蛋白、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,pcv2)衣壳(cap)蛋白，由河北农业大学传染病实验室保存。
[0060]
以下实施例中，所用到的试剂与试剂盒及其购买厂家如表1所示。
[0061]
表1主要试剂/试剂盒与耗材
[0062][0063]
实施例1asfv p30蛋白的表达、纯化与鉴定
[0064]
(1)asfv p30蛋白的诱导表达与纯化
[0065]
取1μl原核重组表达质粒pet-28a-asfv p30转化到100μl rosetta(de3)感受态细胞中，冰上静置30min，42℃水浴1min 30s，再次放置于冰上静置3min，加入1ml无抗性的液体lb，37℃摇床振摇培养60min，5000r/min离心5min，弃400μl上清液，剩余吹吸混匀，取100μl均匀涂布于卡那霉素抗性(kana
+
)lb平板上。次日，挑取单菌落接种到kana
+
抗性的液体lb培养基中，37℃200r/min，培养至对数生长期(od
600nm
＝0.6～0.8)，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，28℃230r/min摇菌4小时。收集菌体，进行超声裂解，裂解条件为：裂解5s、间歇10s、功率40％、裂解时间共20min。10000r/min 4℃离心15min，分离上清和沉淀，沉淀用binding buffer重悬，使包涵体充分溶解，10000r/min 4℃离心20min，收集上清。
[0066]
取600μl包涵体上清加入150μl 5
×
sds上样缓冲液，105℃变性9min，进行sds-page。电泳结束后，将分离胶置于0.25mol/l的kcl溶液中显色，将两块淡白色条带切下置于透析袋中。向透析袋中加入1.5ml pb洗脱液，用夹子夹紧两端，置于水平电泳槽中，80v恒压
电泳3h，翻转电极电泳10min。电泳结束后取出透析袋中洗脱下来的蛋白溶液，nanodrop2000测定浓度并进行sds-page鉴定。
[0067]
sds-page鉴定结果如图1所示，可以表达预期大小(约30kda)的目的重组蛋白。进而收集诱导后的菌泥进行超声破碎，经电洗脱法纯化、pbs透析复性和peg20000浓缩，取制备后的重组asfv p30蛋白，经sds-page检测，可见目的条带清晰单一，纯度高，几乎没有杂带。
[0068]
(2)asfv p30蛋白的鉴定
[0069]
分别取纯化后的重组p30蛋白以及pet-28a空质粒转化菌诱导表达产物进行sds-page，电泳结束前准备好蛋白转印缓冲液(tris-甘氨酸-甲醇溶液)和甲醇溶液，将凝胶和滤纸置转印缓冲液中浸泡20min，期间活化pvdf膜，即将pvdf膜置于100％甲醇中浸泡5min，再于20％甲醇中浸泡2min。随后进行转膜，具体操作为：依次按照滤纸、pvdf膜、凝胶、滤纸的顺序制备三明治结构，盖上电极，23v恒压电转30min。转膜结束后，将pvdf膜置于5％脱脂奶粉tbst(含0.05％tween-20的tris-hcl缓冲盐溶液)中4℃条件下封闭10～12h；tbst洗膜3次，分别加入抗his标签鼠源单克隆抗体(1∶4000稀释)、asfv抗体阳性猪血清(1∶100稀释)、asfv抗体阴性猪血清(1∶100稀释)，室温条件下孵育2h；洗膜3次，分别加入1∶5000倍稀释的羊抗鼠igg-hrp/羊抗猪igg-hrp，室温条件下孵育1.5h；洗膜后，将pvdf膜置于dab底物显色液中避光显色5～10min，直至目的条带显色清晰后，用蒸馏水冲洗终止显色反应，观察抗体与表达蛋白的反应情况。
[0070]
western blot鉴定结果如图2所示，在pvdf膜上30kda处出现棕色条带，不与asfv抗体阴性猪血清反应；且相同条件下空质粒转化大肠杆菌的诱导产物泳道未见相应大小的条带，说明重组p30蛋白表达成功。
[0071]
实施例2p30单克隆抗体的制备
[0072]
(1)小鼠免疫
[0073]
用纯化的asfv p30蛋白作为免疫抗原，免疫6～8周龄的balb/c小鼠6只，免疫程序见表3。三免后14d尾静脉采血，间接elisa检测小鼠血清抗体水平，elisa具体步骤如下：p30蛋白以0.1μg/孔包被于酶标板，37℃孵育1h、4℃过夜。次日，弃去孔内液体，洗涤3次，每次3min；每孔加100μl封闭液，37℃孵育1h；加入1∶102～107稀释的小鼠血清，37℃孵育1h；洗涤3次后拍干；加入hrp标记的羊抗小鼠igg(1∶5000稀释)，37℃孵育45min；洗涤3次后拍干；加入100μl/孔的显色液，室温避光显色15min；终止反应，每孔加2mol/l的硫酸50μl，震荡混匀，酶标仪测定od
450nm
值。选取抗体阳性效价最高的小鼠在融合前三天进行加强免疫，具体免疫程序见下表2。
[0074]
表2小鼠免疫程序表
[0075][0076]
在第3次免疫小鼠后14d，用elisa检测小鼠的血清抗体水平，当od
450nm
值≥0.3时，判定为阳性。结果如图3所示，免疫的6只小鼠特异性抗体效价均可达到1∶105，选择p30抗体
效价最高的1#小鼠进行腹腔冲击免疫，3d后进行细胞融合。
[0077]
(2)细胞融合
[0078]
融合前1d制备饲养细胞(腹腔巨噬细胞)，具体操作如下:拉颈处死小鼠，放到盛有75％酒精的烧杯中浸泡消毒5min，用手术剪将小鼠腹部剪开，剥开皮肤，露出腹膜。用无菌的注射器将3ml无血清的imdm培养液透过腹膜注入腹腔，用酒精棉球轻柔1min，回抽腹腔液体，放入15ml离心管中，反复3-4次，1000r/min离心10min，弃上清。用5ml含15％ fbs、1％hat的imdm培养液重悬细胞沉淀，用0.5％台盼蓝溶液作活细胞计数。将2
×
105个/ml上细胞悬液加入96孔板中，100μl/孔，于37℃，5％co2培养箱中培养。于融合前48h-36h，将sp2/0骨髓细胞扩大培养。融合时将细胞拍下，收集于离心管中。1000r/min离心10min，弃上清；加入10ml含15％fbs的imdm培养液将细胞重悬。用0.5％台盼蓝溶液作活细胞计数，置于37℃，5％co2培养箱内备用。
[0079]
取加强免疫后3d的小鼠，摘除眼球至死，采血收集血清，75％酒精浸泡消毒5min。无菌条件下取出小鼠脾脏，将其置于无血清的imdm培养液中，洗涤2～3次，剥去周围结缔组织。将小鼠脾脏剪碎置于100μm无菌细胞过滤器上研磨过滤，边研磨边加入10ml无血清的imdm培养液，收获脾细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清，将细胞重悬于10ml无血清的imdm培养液中，混匀。取上述细胞悬液，用0.5％台盼蓝溶液作活细胞计数。按照10∶1的比例混合脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞，混匀，1000r/min，离心10min。弃上清，轻弹离心管底部，使细胞散开成糊状，置37℃水浴锅内备用。
[0080]
吸取1ml预热的ph为8.0无血清的imdm培养液加入1g灭菌的peg 4000中，吹吸混匀，使其成为50％peg4000溶液。在1min内将1ml 50％peg4000溶液缓慢加入到sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的混合悬液内(边加边转动离心管，从侧壁滑下来)；加完后，在30s内用吸管将所有的液体吸入吸管中，静置30s，然后30s内缓慢吹入到离心管中。
[0081]
向离心管内加入预热的25ml无血清的imdm培养液终止peg的作用：第1min缓缓加入1ml无血清的imdm培养液，第2min加入1ml无血清的imdm培养液，第3min加入3ml无血清的imdm培养液，然后在3min内加完剩下的20ml的imdm培养液，边加边转动离心管，使终止液从侧壁滑下来。然后再将离心管置于37℃水浴5min，使培养液充分终止融合。
[0082]
1000r/min离心10min，弃上清。用20ml含15％fbs、1％hat的imdm培养液缓慢混悬细胞沉淀；将细胞悬液加入到铺有饲养细胞的96孔板中(100μl/孔)，置37℃5％co2培养箱中培养。每隔3天使用含1％hat的imdm培养液对孔内细胞进行半量换液，第15d开始使用1％ht的imdm培养液半量换液，期间观察记录细胞生长状况。
[0083]
细胞生长状况如图4所示，从脾细胞与sp2/0细胞融合后第9d开始，应用elisa检测有融合细胞生长孔的细胞培养上清，筛选分泌p30特异性抗体的阳性杂交瘤细胞，并对其进行3次亚克隆，最终获得2株稳定分泌抗asfv p30蛋白抗体的杂交瘤细胞株，命名为：4g6-1e6-2b1-c7(简称c7)、4g6-1f10-2b2-g10(简称g10)。
[0084]
(3)阳性杂交瘤细胞的筛选与亚克隆
[0085]
于融合后的第9d、12d、15d用p30间接elisa方法筛选阳性杂交瘤细胞。具体操作同3.2.1，其中杂交瘤细胞上清作1∶2稀释，同时使用大肠杆菌pet-28a空质粒裂解产物包被于酶标板检测细胞上清，对p30抗体阳性、大肠杆菌pet-28a空质粒裂解产物阴性的孔采用有限稀释法进行亚克隆。
[0086]
用200μl吸头吹散阳性孔内的细胞，移至1.5ml离心管中，补800μl营养液至1ml，混匀计数，稀释成20个/ml、10个/ml和5个/ml。将稀释好的细胞按照100μl/孔加入到铺好饲养细胞的96孔板内，每个梯度重复4列即32孔，对克隆余下的杂交瘤细胞转至24孔板内扩大培养，冻存细胞。
[0087]
亚克隆后3-5d后观察记录克隆孔内的细胞状况，每隔3d半量换液一次，对单克隆细胞生长的细胞孔，用p30蛋白及pet-28a空质粒裂解产物同时包被酶标板对细胞培养上清进行间接elisa检测，选取对p30蛋白阳性值高、大肠杆菌pet 28a空质粒转化裂解产物为阴性的克隆孔进行下一次亚克隆。连续3～4次亚克隆后，经间接elisa检测有克隆孔内细胞培养上清全部为阳性且od
450nm
值基本一致时，将阳性杂交瘤细胞转至24孔细胞培养板内，长满后扩大培养及早冻存。
[0088]
(4)杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性检测
[0089]
对上述筛选克隆后所获得的杂交瘤细胞株，进行连续传代培养，传代过程中收集f5、f10、f15、f20代的细胞培养上清液，同时对瓶内的阳性杂交瘤细胞进行冻存，具体操作为：将细胞轻轻拍下，收集于离心管内，1000r/min离心10min，弃去上清液，用imdm冻存液重悬细胞沉淀，取1ml放于2ml冻存管内，封口后置4℃1h，-20℃1h，-80℃过夜，再将其长期保存于液氮罐中。
[0090]
复苏f10代杂交瘤细胞，将细胞从液氮内取出，迅速转移至37℃温水中搅拌使其融化，1000r/min离心10min，弃上清。用含10％fbs imdm培养液重悬细胞沉淀，移入细胞培养瓶中，置37℃，5％co2条件下培养，收集复苏后f2代、f5代细胞培养上清。
[0091]
将杂交瘤细胞连续培养传至20代，复苏f10代的杂交瘤细胞后传5代，用间接elisa方法检测f2、f5、f10、f15、f20、复苏后f2、f5代细胞培养上清中抗体效价，同一株杂交瘤细胞不同代次之间分泌抗体水平较为稳定，如表3所示，p30 c7株分泌抗体效价在1∶640-1∶2560之间,g10株分泌抗体效价在1∶640-1∶1280之间。
[0092]
表3杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性
[0093][0094][0095]
实施例3单克隆抗体类和亚类的鉴定
[0096]
按照小鼠单抗ig类/亚类鉴定用试剂盒(elisa)说明书要求，鉴定杂交瘤细胞分泌抗体的类型。取恢复至室温的试剂盒，将细胞上清用样本稀释液作1∶1稀释，每孔加入100μl，每个样品重复8孔，阴阳对照不稀释，每孔加入100μl，于37℃反应30min；洗涤5次，每个样品孔分别加入8种酶标抗体100μl，于37℃反应30min；吸弃孔内液体，洗涤5次，加入显色液a和b各50μl/孔，于37℃显色20min；加入反应终止液50μl/孔，测定od
450nm
值。结果判定：阳性对照od
450nm
值＞0.8，阴性对照od
450nm
值＜0.15时，实验结果有效；样品od
450nm
＞阴性od
450nm
+0.15时，判为阳性。
[0097]
结果如下表4所示，2株抗体均与抗igg1抗体和抗kappa轻链抗体反应，样品od明显高于阴性对照，说明获得的2株杂交瘤细胞分泌的抗体均为igg1类κ链，即igg1κ。
[0098]
表4小鼠单抗ig类、亚类鉴定(od
450nm
)
[0099]
细胞株igg1igg2aigg2bigg3igmigakappalambdac72.8610.1730.0780.0580.0490.0602.6030.071g102.8500.1660.0760.0570.0480.0642.6210.050阴性对照0.0590.0800.0670.0550.0480.0670.0510.051阳性对照3.8043.7773.7963.7613.7653.7833.7413.741
[0100]
实施例4腹水制备与单克隆抗体效价的测定
[0101]
采用体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体。将液体石蜡油注射到balb/c小鼠腹腔内；10d后，每只小鼠腹腔注射3
×
106个杂交瘤细胞。待小鼠腹部膨大时，用无菌的注射器抽取腹水，8000r/min离心10min，收集上清，-80℃保存。用igg(1、2a、2b)类小鼠单克隆抗体纯化试剂盒纯化抗体，方法如下：取4ml单克隆抗体腹水加入纯化液a4ml，室温避光倒转30min；8000r/min室温离心20min，沉淀用2ml纯化液b溶解，再加入纯化液c 2ml，室温避光倒转10min；8000r/min室温离心20min，收集上清；每1ml上清液加纯化液d1ml，室温避光倒转20min；8000r/min室温离心20min，弃上清，用1.33ml纯化液b溶解沉淀；将上述纯化后抗体移入蒸馏水煮沸处理好的透析袋内，夹住透析袋两端，抗体体积与igg透析液体积为1∶100，4℃静置透析过夜。收集透析后抗体。以透析后抗体体积：纯化液e的体积＝9∶1的比例加入纯化液e摇匀，室温静置5min。8000r/min室温离心10min，收集上清，放入透析袋中，用透析夹扎紧，4℃透析，每隔4h更换透析液，共换液三次。收集透析后的抗体，8000r/min室温离心10min，收上清，-20℃保存备用。sds-page检验纯化结果：分别取纯化前后的腹水20μl，加入20μl 2
×
sds上样缓冲液，105℃变性10min，进行sds-page。sds-page鉴定结果如图5所示，纯化后的抗体轻、重链清晰，有少量杂带；c7、g10抗体纯化后蛋白含量分别为3.0mg/ml、1.9mg/ml。
[0102]
将纯化的单克隆抗体按照1∶10
2-109系列稀释，应用间接elisa方法检测腹水单克隆抗体的效价，具体步骤同实施例1中(1)。间接elisa检测杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的效价，结果显示(如图6和图7)，p30 2株单抗c7和g10杂交瘤细胞分泌的抗体效价分别为1∶1280和1∶320，制备的腹水抗体效价分别为1∶107和1∶106。
[0103]
实施例5单克隆抗体的鉴定
[0104]
(1)western blot鉴定
[0105]
取纯化的重组p30蛋白、p30 c端蛋白、p30 n端蛋白及阴性对照asfv mgf360蛋白、空质粒pet32a(+)诱导产物进行sds-page电泳后，转膜；将待检的单克隆抗体(腹水)作1:50000倍稀释后进行western blot鉴定。
[0106]
western blot鉴定结果如图8所示，p30单克隆抗体c7和g10分别与重组p30、p30 n端(1-105aa)或c端(100-194aa)蛋白反应后，在p30和p30 c端蛋白泳道均出现一条清晰的特异性反应条带，在p30 n端、pet-32a诱导后、asfv mgf360泳道均没有出现反应条带，说明p30 c7、g10单抗均识别p30c'-端蛋白。
[0107]
(2)间接免疫荧光(ifa)鉴定
[0108]
将2
×
104个/孔的vero细胞铺到96孔细胞培养板中，于37℃ 5％co2条件下培养24h，经脂质体转染法，将p30蛋白n端和c端真核重组表达质粒，即pcdna3.1-p30(1-105aa)和pcdna3.1-p30(100-194aa)，以及pcdna3.1(+)空质粒分别转染vero细胞。质粒脂质体转染过程为：将0.3μl的脂质体(lipofectmaine 2000)和0.1μg的上述质粒分别加入到25μl的
opti-mem培养基内，混匀，室温静置5min；将稀释后的脂质体与各重组表达质粒轻轻混匀，室温静置30min；用预热的0.01mol/l ph7.4的pbs洗涤细胞2次；将dna-脂质体复合物滴加到细胞表面，于37℃、5％co2条件下孵育4h；弃去孔内培养液，每孔加200μl含10％fbs的dmem培养液，培养48-72h；弃掉孔内培养液，洗涤细胞；每孔加入50μl预冷的无水甲醇，-20℃固定10min；洗涤3次，每孔加入100μl封闭液于37℃封闭1h；每孔加入50μl1∶1000倍稀释待检单克隆抗体，37℃孵育1h；洗涤后，每孔加入50μl的fitc标记的山羊抗小鼠igg(1∶300倍稀释)，于37℃孵育45min；洗涤，每孔加入50μlbiben zimed(10μg/ml)，于室温避光反应20min；弃掉孔内液体，洗涤；荧光显微镜下观察，发出绿色荧光的细胞表明待检单克隆抗体与细胞表达的抗原发生了特异性结合。
[0109]
将表达p30蛋白n端和c端的重组真核表达质粒：pcdna3.1-asfv p30(1aa-105aa)和pcdna3.1-asfv p30(100aa-194aa)，以及pcdna3.1(+)空质粒分别转染vero细胞，转染后48h的ifa结果显示，转染p30蛋白c端重组质粒的细胞与单克隆抗体c7或g10反应后，在细胞浆内出现绿色荧光(见图9中，a、b和c、d、e和f)；但转染p30蛋白n端重组质粒与空质粒的细胞与单克隆抗体c7或g10反应后，细胞内无绿色荧光出现(见图9中，g、h、i、j、k、l、m、n和o)。上述实验结果表明，c7和g10单克隆抗体均能与p30蛋白c端的100aa-194aa片段结合。
[0110]
实施例6单克隆抗体的亲和力测定
[0111]
间接elisa方法测定单克隆抗体的相对亲和力，p30蛋白以0.1μg/孔包被于酶标板上，次日5％脱脂奶粉pbst封闭后，将纯化后的单克隆抗体稀释成0.0005μg/ml、0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml进行间接elisa检测。以抗体浓度和od
450nm
值绘制曲线，参照文献[黄超贤.抗trpc6多肽单克隆抗体的制备、鉴定及其初步应用[d].广州：广东药学院,2012]计算抗原与抗体结合达到饱和状态时，50％浓度所对应的抗体浓度，即为该抗体的相对亲和力。
[0112]
以抗体浓度与od值绘制曲线，抗体亲和力浓度的计算：以曲线达到平台时期的抗体浓度为100％，抗原与抗体结合达到平台期时的浓度所对应的50％抗体浓度即为该抗体的相对亲和力，p30两株单抗浓度0.5μg/ml时曲线达到平台期，由此得出p30两株单抗c7、g10相对亲和力相等，均为0.25μg/ml(见图10)。
[0113]
实施例7交叉反应
[0114]
分别用pcv2cap、pedvs、asfp72和p30蛋白包被酶标板，0.1μg/孔；通过间接elisa检测杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与其它蛋白抗原反应的交叉性。
[0115]
经elisa检测发现(如图11所示)，p30蛋白筛选的2株单克隆抗体(c7和g10)除了与asfvp30蛋白发生特异性结合外，与带有his标签的pcv2cap、pedvs和asfvp72蛋白抗原均无交叉反应。结果表明p302株单克隆抗体特异性良好。
[0116]
实施例8单克隆抗体抗原识别表位的鉴定
[0117]
(1)多肽的合成与设计
[0118]
根据p30蛋白c端(100-194aa)的氨基酸序列设计合成4条肽段，即p30(100-134aa)、p30(130-164aa)、p30(160-194aa)和p30(115-134aa)，在每条多肽的n端偶联牛血清白蛋白(bovine serum albumin,bsa)(见表5)。
[0119]
表5p30分段多肽序列
[0120][0121][0122]
(2)elisa鉴定
[0123]
按照2.5μg/ml的浓度将4条肽段分别包被于酶标板，待检的单克隆抗体(腹水)作1∶1 000倍稀释进行间接elisa检测，其他操作步骤同实施例2(1)。
[0124]
用合成的p30(100-134aa)、p30(130-164aa)和p30(160-194aa)肽段分别包被酶标板，经elisa检测显示(见图12)，单克隆抗体c7和g10均可与p30(100-134aa)肽段结合。两个单克隆抗体均不与p30(130-164aa)和p30(160-194aa)结合；进一步用肽段115-134aa包被酶标板或nc膜，经elisa试验检测发现(图12)，两株单克隆抗体均能与该肽段结合。
[0125]
(3)斑点杂交试验鉴定
[0126]
将nc膜置于0.01mol/l ph7.4的pbs中浸润10min；取出，晾干，取2μl不同肽段(4μg)分别滴加到nc膜上，同时设立p30蛋白作为阳性对照，bsa、asfv p72蛋白和cd2v蛋白作为阴性对照；待检的单克隆抗体(腹水)作1∶1 000倍稀释，后续反应同实施例1(2)中的western blot的反应步骤。
[0127]
斑点杂交试验也证明了2株单克隆抗体均可与p30(100-134aa)肽段和p30蛋白反应，在nc膜的相应部位出现棕色斑点，而与p30(130-164aa)、p30(160-194aa)肽段及阴性对照抗原(bsa和p72、cd2v蛋白)不结合(图13)。进一步用肽段115-134aa包被酶标板或nc膜，经斑点杂交试验检测发现，两株单克隆抗体均能与该肽段结合(图14)。
[0128]
上述elisa和斑点杂交实验结果表明，两株单克隆抗体c7和g10识别的抗原表位
115
ctssfetlfeqepssevpkd 134
。
[0129]
实施例9阻断elisa抗体检测方法的建立
[0130]
(1)单克隆抗体的hrp标记
[0131]
按照hrp标记试剂盒说明书标记纯化的单克隆抗体，测定标记抗体的效价，即p30蛋白以1μg/ml包被，将标记后单克隆抗体从1∶100
–
1∶12800稀释，测定标记后的效价。
[0132]
结果表明(表6和图15)，c7、g10标记后效价均可达1∶12800，可用于后续的检测。
[0133]
表6hrp标记腹水后效价测定(od
450nm
)
[0134][0135]
(2)抗原包被浓度和待检血清稀释倍数的确定
[0136]
用ph 9.6的碳酸盐包被缓冲液将p30蛋白稀释为0.5、1、1.5和2μg/ml，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育1h，4℃过夜；次日，用pbst洗涤3次，3min/次，拍干后每孔加入100μl的
封闭液，于37℃封闭1h；将asf抗血清、asf阴性血清作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128倍稀释组成方阵，每孔100μl，37℃条件下反应1h；pbst洗涤后，加入hrp-p30 g10单抗(1∶1000)，100μl/孔，37℃反应45min；pbst洗涤后拍干，加入tmb单组份显色液，100μl/孔，室温避光显色15min；终止反应：每孔加入50μl 2mol/lh2so4。使用酶标仪测定od
450nm
值，并计算阻断率(percent of inhibition,pi)：pi值＝(1-阳性对照孔od值/阴性对照孔od值)
×
100％。
[0137]
当p30蛋白以0.5、1、1.5、2μg/ml包被与待检血清倍比稀释组成方阵，结果如表7所示，当p30蛋白包被浓度为0.5μg/ml，待检血清不稀释时，pi值最高；p30蛋白包被浓度为0.5μg/ml，待检血清1∶2稀释时，pi值与待检血清不稀释时的pi值相当，为了节约血清，故确定最佳包被浓度为0.5μg/ml，最佳血清稀释倍数为1∶2稀释。
[0138]
表7抗原最佳包被浓度和待检血清最佳稀释浓度
[0139][0140]
注：阻断率(pi)＝(1-阳性对照孔od值/阴性对照孔od值)
×
100％。a:两个重复孔的平均值
±
标准差。
[0141]
(3)封闭液和酶标单抗工作浓度的确定
[0142]
取包被好p30蛋白的酶标板，将含5％犊牛血清、5％脱脂奶粉、1％明胶和2％bsa的封闭液分别与1∶500、1∶1000、1∶2000倍稀释的hrp标记的g10抗体组成方阵，检测已知asf阳性和阴性猪血清，elisa反应条件同实施例9中(2)所述。根据pi值的大小，确定最佳封闭液
和酶标抗体的最佳工作浓度。
[0143]
检测结果如下表8所示，以0.5μg/ml p30蛋白为包被抗原，当以含1％明胶pbst作为封闭液时，pi值低于其他三个组合，当封闭液为5％脱脂奶粉pbst、酶标抗体的稀释倍数为1∶1000时，pi值达到最大值，因此最佳封闭液选择5％脱脂奶粉pbst，酶标单抗的最佳稀释倍数为1∶1 000。
[0144]
表8封闭液和酶标抗体最佳稀释度
[0145][0146][0147]
注：阻断率(pi)＝(1-阳性对照孔od值/阴性对照孔od值)
×
100％。a:两个重复孔的平均值
±
标准差
[0148]
(4)反应条件的确定
[0149]
1)包被条件的确定
[0150]
以确定的最佳抗原包被浓度进行包被，包被条件设为：37℃孵育2h后4℃过夜、37℃孵育1h后4℃过夜及4℃过夜；次日按照3.10.2所述的elisa反应步骤检测已知阳性和阴性猪血清；根据pi值确定最佳抗原包被条件。
[0151]
结果如下表9所示，当p30蛋白在37℃孵育1h后再4℃过夜条件下包被时，pi值最大，最佳抗原包被条件为37℃孵育1h，4℃过夜。
[0152]
表9最佳包被条件的确定
[0153][0154]
注：a:表示非洲猪瘟阳性血清；b:表示非洲猪瘟阴性血清；c:两个重复孔的平均值
±
标准差；阻断率(pi)＝(1-阳性对照孔od值/阴性对照孔od值)
×
100％。
[0155]
2)封闭条件的确定
[0156]
取包被好抗原的酶标板，加入筛选的封闭液，分别于37℃条件下封闭30min、1h和2h，按照3.10.2所述的elisa反应步骤检测已知阳性和阴性猪血清，以确定最佳的封闭条件。
[0157]
结果如表10所示，当封闭条件为37℃封闭30min和1h、2h时，三个时间点的pi值均在67％-68％之间，三者接近，考虑到37℃反应30min可缩短elisa反应时间，故选择37℃
30min作为最佳封闭条件。
[0158]
表10最佳封闭条件的确定
[0159][0160]
注：a:表示asf抗体阳性血清；b:表示asf抗体阴性血清；c:两个重复孔的平均值
±
标准差；阻断率(pi)＝(1-阳性对照孔od值/阴性对照孔od值)
×
100％。
[0161]
3)待检血清反应条件的确定
[0162]
取包被好p30蛋白且封闭好的酶标板，加入适当稀释的待检阳性和阴性血清，将酶标板分别置于37℃条件下反应30min、45min和60min，按照3.10.2所述的elisa反应步骤进行后续实验，根据pi值确定待检血清的最佳反应条件。
[0163]
4)酶标抗体反应条件的确定
[0164]
按照实施例9中(2)中所述的elisa程序以及确立好的反应条件进行elisa，当加入酶标抗体后，将酶标板分别置于37℃条件下反应30min、45min和60min，最后根据pi值确定酶标抗体的最佳反应条件。
[0165]
结果如表11所示，当待检血清在37℃条件下反应60min时，pi值最大；酶标抗体在37℃条件下反应45min时，pi值最大，因此最佳待检血清反应条件为37℃反应60min，最佳酶标抗体反应时间为37℃反应45min。
[0166]
表11最佳待检血清与酶标抗体反应条件的确定
[0167][0168]
注：a:表示asf抗体阳性血清；b:表示asf抗体阴性血清；c:两个重复孔的平均值
±
标准差；阻断率(pi)＝(1-阳性对照孔od值/阴性对照孔od值)
×
100％。
[0169]
5)最佳显色时间的确定
[0170]
按照实施例9中(2)所述的elisa反应步骤，保持其他反应条件不变，显色条件分别设置为室温避光显色10min、15min、20min、25min条件，根据计算pi值大小确定最佳显色时间。
[0171]
结果如下表12所示，在室温下避光显色15min时，pi值最大为77.75％，因此最佳显色时间确定为15min。
[0172]
表12最佳显色时间的确定
[0173][0174]
注：a:表示asf抗体阳性血清；b:表示asf抗体阴性血清；c:两个重复孔的平均值
±
标准差；阻断率(pi)＝(1-阳性对照孔od值/阴性对照孔od值)
×
100％。
[0175]
(5)临界值的确定
[0176]
选用98份标准asfv抗体阴性血清，用建立的阻断elisa方法进行检测，计算98份阴性血清pi值，以pi值的平均值(x)+3倍/2倍的标准差(sd)的方法计算建立方法的临界值。当被检样品的pi值≥x+3sd时，判定为阳性。当样品pi值《x+2sd时，判定为阴性，介于两者之间判为可疑。应用spss26.0数据统计软件分析软件对98份阴性血清的pi值进行正态分布分析，评价临界值的准确性。
[0177]
结果显示，p30阻断elisa检测的98份阴性血清的x和sd分别为11.10％和5.16％，故当待检血清的pi值≥26.58％(x+3sd)时，判定血清特异性抗体为阳性，当pi值＜21.42％(x+2sd)时判为阴性；当21.42％≤pi值＜26.58％时，判为可疑。另外，正态分布分析显示(见图16)，建立的p30阻断elisa方法检测98份阴性血清结果的偏度值＝0.297，峰度值＝0.195，均小于1，p＝0.080(p＞0.05)，98份阴性血清样品服从正态分布。
[0178]
(6)特异性试验
[0179]
用建立的方法分别检测prv、pcv2、csfv、prrsv标准阳性血清，操作步骤同实施例9中(2)，通过检测上述阳性血清是否能阻断单克隆抗体与包被蛋白结合来判断所建立方法的特异性。
[0180]
结果如图17所示，只有asfv抗血清阻断了单抗g10与p30蛋白的结合，pi值为87.51％，csfv、prv、prrsv和pcv2抗血清的pi值分别为：-3.21％、-0.21％、3.15％和-0.65％，均为阴性。该结果表明建立的阻断elisa方法具有良好的特异性。
[0181]
(7)敏感性试验
[0182]
用建立的方法检测5份asf抗体标准阳性血清效价，血清作1∶2-1∶10240倍比稀释，操作步骤同实施例9中(2)，通过检测血清效价来判断所建立方法的敏感性。当pi值≥26.58％时，血清特异性抗体判为阳性，结果5份血清检测的效价分别为1∶512、1∶64、1∶128、1∶64、1∶256(见图18)；结果表明建立的方法可以检测到1∶512倍稀释的血清，具有良好的灵敏度。
[0183]
(8)重复性试验
[0184]
在相同条件下使用同一批蛋白包被酶标板，检测7份已知阳性血清样本和2份阴性血清样本，每份血清样本做3个重复，根据od
450nm
值计算批内变异系数(cv)；选用3个批次的p30蛋白包被酶标板，在其他相同试验条件下，检测7份已知阳性血清样本和2份阴性血清样本，根据od450nm值计算批间变异系数；根据批内与批间的cv值大小来判断建立方法的重复性。
[0185]
结果如表13-14所示，批内重复性试验变异系数的平均值为4.116％，批间重复性试验变异系数的平均值为5.187％，批内与批间重复性试验的变异系数均小于10％，该结果
表明，建立的阻断elisa方法具有很好的重复性。
[0186]
表13p30阻断elisa批内重复性试验结果
[0187][0188]
注：a:od
450nm
值
[0189]
表14p30阻断elisa批间重复性试验结果
[0190][0191]
注：a:od
450nm
值
[0192]
(9)与试剂盒的比较
[0193]
为了检测建立方法的临床应用效果，同时与商品化试剂盒进行比较，分别用建立的阻断elisa方法和试剂盒检测157份血清样本。
[0194]
结果如表15所示，p30阻断elisa和试剂盒asf抗体阳性检出率分别为35.67％(56/157)和33.12％(52/157)，阴性检出率分别为64.33％(101/157)和66.88％(105/157)；两种方法的阳性符合率为92.31％，阴性符合率均为92.38％，总符合率为92.36％。该结果表明，建立的elisa方法的抗体阳性检出率高于试剂盒。
[0195]
表15p30阻断elisa与试剂盒的符合率
[0196][0197]
综上所述，本发明开发的基于asfvp30单克隆抗体的阻断elisa方法对非洲猪瘟病毒抗体的检测，具有较高的特异性、敏感性与重复性。
[0198]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

技术特征：
1.一种asfv p30蛋白单克隆抗体，其特征在于，其能够识别的p30蛋白的抗原表位115aa-134aa。2.根据权利要求1所述的asfv p30蛋白单克隆抗体，其特征在于，抗原表位多肽包括如seq id no.1所示序列。3.一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa试剂，其特征在于，包括权利要求1或2中任一权利要求所述的asfv p30蛋白单克隆抗体。4.一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的asfv p30蛋白单克隆抗体或权利要求4所述的用于检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂。5.一种检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，其特征在于，包括：将权利要求1或2所述的asfvp30蛋白单克隆抗体作为被阻断酶标记抗体使用阻断elisa方法进行检测。6.根据权利要求5所述的检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，其特征在于，asfv p30蛋白的包被浓度为0.5μg/ml，待检血清和被酶标阻断抗体的稀释倍数分别为1∶2和1∶1000；和/或封闭液为含5％脱脂奶粉pbst。7.根据权利要求5或6所述的检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，其特征在于，37℃下，asfv p30抗原-待检血清的反应时间分别为60min；待检血清-酶标阻断抗体的反应时间为45min。8.根据权利要求7所述的检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，其特征在于，当阻断率≥26.58％，待检血清判为非洲猪瘟病毒抗体阳性；当21.42％≤阻断率＜26.58％时，待检血清判为可疑；当阻断率＜21.42％时，待检血清判为阴性。9.权利要求1或2所述的asfv p30蛋白单克隆抗体在检测非洲猪瘟病毒及其抗体中的应用。10.一种分泌权利要求1或2所述的asfv p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏编号为cctcc no:c202329。

技术总结
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种ASFVp30蛋白单克隆抗体及其应用。该ASFVp30蛋白单克隆抗体其能够识别p30蛋白抗原表位的115aa-134aa。基于该ASFVp30蛋白单克隆抗体建立的阻断ELISA方法对非洲猪瘟病毒抗体进行检测时，与CSFV、PRRSV及PRV等抗体均无交叉反应；最低能检出1∶512倍稀释的阳性血清特异性抗体；批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.116％和5.187％；与商品试剂盒的阳性符合率92.31％，阴性符合率92.38％，总符合率为92.36％。合率为92.36％。合率为92.36％。


技术研发人员：宋勤叶 马天天 袁晨 冯亚文 逯纪成 孙泰然
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：2023.03.09
技术公布日：2023/9/20