一株泰国肠球菌及其应用

1.本发明属于生物领域，具体涉及一株高产辛酸的泰国肠球菌(enterococcus thailandicus)及其应用。


背景技术：

2.在白酒酿造过程中，酸类是形成酯类的前体物质，同时也可以构成其他香味物质。适量的有机酸可使酒体丰满、醇厚，回味悠长。辛酸在浓度低时，呈现水果清香，并是形成辛酸乙酯的前体物质。
3.李志斌等人研究发现(李志斌，李净.浓香型白酒中辛酸乙酯含量及其风味贡献分析[j].酿酒科技,2013(4):3.)辛酸乙酯是浓香型白酒中的重要物质，其香气强度值(oav)在酯类中仅次于己酸乙酯。优质窖泥是生产高品质浓香型白酒的基本条件之一。传统的优质窖泥是需要通过长年不断，周而复始的生产，对酿酒有益微生物进行驯化，从而自然老熟，但这一过程需要经过漫长的时间。可通过复合菌种培养液和老窖泥搭配使用的人工窖泥培养技术，缩短窖泥老熟时间。
[0004]
但需要筛选挖掘优质的相关菌种，这是决定效果好坏的关键。但目前窖泥培养技术的菌种选择以产高己酸的菌株为主，往往忽略了复合菌系中产辛酸的能力。现有文献中，菌株产辛酸含量为0.066-4.277g/l，而从白酒优质老窖泥中筛选挖掘出适应白酒酿造环境，不破坏酿酒微生态平衡，且能高产辛酸的菌株，对促进酿酒技术发展具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供的泰国肠球菌菌株筛选于浓香型优质老窖泥，已于2022年6月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号：cgmcc no.25135，名称为：泰国肠球菌zqw21(enterococcus thailandicus)。
[0006]
本发明也提供一种高产辛酸的泰国肠球菌的应用，将所述泰国肠球菌作为增强菌剂应用于白酒酿造领域中，如应用于人工窖泥培养或强化大曲制备，以提高辛酸含量，为辛酸乙酯的形成提供前体物质。将所述泰国肠球菌作为增强菌剂对酿酒微生物进行生物强化工作，开发白酒新产品。
[0007]
优选的，所述增强菌剂的形式包括是液体、冻干制剂或粉末。
[0008]
优选的，所述增强菌剂包括辅料。所述辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养物质包括但不限于：酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、水。
[0009]
本发明由此也提供一种用于白酒酿造的增强剂，其由于所述的泰国肠球菌zqw21制备而成。具体地，所述增强菌剂的形式选自是由所述的泰国肠球菌zqw21培养后制备成的液体、冻干制剂或粉末。任选地，所述增强菌剂还包括辅料，所述辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养物质包括但不限于：酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、水。
[0010]
本发明提供的泰国肠球菌筛选于优质窖泥中，适应白酒酿造的环境，该发明菌株37℃发酵72h时，辛酸产量达5.45g/l，高于现有文献中的菌株辛酸的产量，例如
cn201310587108.中公开了一株可产辛酸和癸酸及其对应乙酯的酵母，其辛酸产量为4277.56mg/l。
附图说明
[0011]
图1为泰国肠球菌zqw21产辛酸gc-ms图。
[0012]
图2为泰国肠球菌zqw21所产的辛酸gc-ms分子碎片质谱图。
[0013]
图3为辛酸标准品gc-ms分子碎片质谱图。
[0014]
菌株保藏信息：
[0015]
本发明的泰国肠球菌zqw21已于2022年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。该菌株的保藏编号为cgmcc no.25135，其分类命名为泰国肠球菌enterococcus thailandicus。
具体实施方式
[0016]
下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。
[0017]
实施例中涉及的培养基配方：
[0018]
mrs液体培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉4g/l，牛肉浸粉5g/l，吐温80 1g/l，柠檬酸三铵2g/l，醋酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.05g/l，磷酸氢二钾1g/l，ph7.0，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
[0019]
mrs固体培养基：在mrs液体培养基基础上添加15g/l的琼脂，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
[0020]
实施例1：泰国肠球菌的分离与鉴定
[0021]
1)分离方法：取20g泸州老窖窖泥样品，放入装有180ml无菌蒸馏水的锥形瓶中，恒温摇床振荡10min将样品充分打散、混匀。取1ml样品悬液，采用倍比稀释法，稀释至10-2
～10-7
，从每个梯度的稀释液中吸取100μl，均匀涂布于含有1％caco3的mrs固体培养基平板上，平行制备两块平板，倒置，放于37℃厌氧下培养36-48h，并及时观察。
[0022]
2)划线纯化：将长出菌落的平板取出，挑取不同菌落形态且有明显透明圈的单菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。
[0023]
3)菌种保藏：将纯化完成后的每种菌株的单菌落挑入5mlmrs液体培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20-24h，吸取1ml菌液至保菌管中，加入0.5ml60％的无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。
[0024]
4)16srdna序列扩增：吸取1ml菌液10000rpm离心5min，去上清，得菌泥，加入ctab溶液及苯酚-氯仿—异戊醇(25：24：1)萃取核酸dna，12500rpm离心5min取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)，混匀后12000rpm离心5min取上清，乙醇溶液漂洗两次，12000rpm离心5min去上清，沉淀吹干，加入50μl无菌水重悬，即得菌株dna模板。引物为27f：5
′‑
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′
和1492r：5
′‑
ggttaccttgttacgactt-3
′
。进行pcr扩增，测序获得16s rdna片段的基因序列，通过ncbi的blast比对，确定菌株种属信息。
[0025]
最终本发明筛选得到4株产酸能力明显的菌株，经鉴定其分别为泰国肠球菌
zqw21、意大利肠球菌rsj24、类肠膜魏斯氏菌rsj26、泰国肠球菌rsj28。其中泰国肠球菌zqw21的16s rdna片段核苷酸序列如seq id no：1所示：
[0026]
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[0027]
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[0028]
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[0029]
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[0030]
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[0031]
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[0032]
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[0033]
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[0034]
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[0035]
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[0036]
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[0037]
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[0038]
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[0039]
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[0040]
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[0041]
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[0042]
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[0043]
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[0044]
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[0045]
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[0046]
实施例2：泰国肠球菌zqw21的相关特性
[0047]
经实验表明，泰国肠球菌zqw21的培养特性：最适生长温度为37℃，ph值为7，兼性厌氧，有氧、无氧或微氧条件下均可生长。在温度耐受性方面：该菌在42℃条件下长势良好，45℃条件下生长缓慢，48℃条件下无法生长。
[0048]
泰国肠球菌zqw21的生化特性如下：
[0049]
1.该菌在37℃厌氧条件下，培养48小时，可分别利用d-半乳糖，d-葡萄糖，d-果糖，d-甘露糖，d-核糖，甲基-αd-吡喃甘露糖苷，n-乙酰葡萄糖胺，苦杏仁苷，熊果苷，水杨苷，d-纤维二糖，d-麦芽糖，d-龙胆二糖，甘露醇，七叶灵柠檬酸铁，d-乳糖，d-海藻糖，葡萄糖酸钾，丙三醇(甘油)，5酮基葡萄糖酸钾等20种单一碳源产酸。其利用能力由强到弱：d-半乳糖，d-葡萄糖，d-果糖，d-甘露糖，d-核糖，甲基-αd-吡喃甘露糖苷，n-乙酰葡萄糖胺，苦杏仁苷，熊果苷，水杨苷，d-纤维二糖，d-麦芽糖，d-龙胆二糖强于甘露醇，七叶灵柠檬酸铁，d-乳糖，d-海藻糖，葡萄糖酸钾强于丙三醇(甘油)，5酮基葡萄糖酸钾。
[0050]
2.该菌在37℃微好氧条件下，静置培养48小时，可利用mrs培养基，代谢生产乳酸11.7g/l，以及种类繁多的41种挥发性代谢产物，其中包括33.6mg/l的辛酸，13.09mg/l的醋酸，7.27mg/l的壬酸，2.29mg/l的己酸，1.33mg/l的正庚醇，1.33mg/l的1-十六烯，1.19mg/l的2,3-二氢-2,2,6-三甲基苯甲醛，1.07mg/l的正癸酸，1.06mg/l的苯乙醛，1.06mg/l的磷酸三异丁酯，0.71mg/l的苯乙醇，0.62mg/l的2,6-二甲基吡嗪，0.56mg/l的庚酸，0.54mg/l的异辛酸，0.5mg/l的苯甲醛；以及其他产量低于0.5mg/l的异戊酸0.49mg/l，乙酸乙烯酯0.48mg/l，丁酸0.42mg/l，香叶基丙酮0.39mg/l，亚油酸乙酯0.36mg/l，棕榈酸乙酯0.35mg/l，2-乙基己醇0.33mg/l，二乙二醇乙醚0.31mg/l，3,4-二甲基苯甲醛0.3mg/l，十一烷0.28mg/l，正丁醇0.27mg/l，1-壬醇0.27mg/l，十五醇0.27mg/l，2-乙基吡嗪0.26mg/l，2,5-二甲基吡嗪0.24mg/l，油酸乙酯0.22mg/l，正辛醇0.12mg/l，苯并噻唑0.11mg/l，苯乙酮0.1mg/l，2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯0.1mg/l，苯酚0.1mg/l；还有产量低于0.1mg/l的微量的3-羟基-2，2，4-三甲基戊基异丁酸酯0.09mg/l，2-甲基吡嗪0.04mg/l，磷酸三丁酯0.03mg/l，2-甲基-6-乙烯基吡嗪0.02mg/l，邻苯二甲酸二异丁酯0.02mg/l。
[0051]
实施例3：泰国肠球菌zqw21产辛酸能力检测
[0052]
1)检测样品制备：将筛选得到的4株产酸能力明显的菌株，即泰国肠球菌zqw21、意大利肠球菌rsj24、类肠膜魏斯氏菌rsj26、泰国肠球菌rsj28，分别将其甘油保存管溶解后接种于10mlmrs液体培养基中，并于37℃静置培养12-20h，活化三代后按2％(体积比)接种量接入400mlmrs液体培养基中进行培养72h。发酵结束后得到发酵菌液，10000rpm离心5min后取上清。
[0053]
2)挥发性酸类测定方法：
[0054]
采用顶空固相微萃取法：取上清液，加入顶空瓶中，加入饱和nacl溶液，以0.822mg/ml的2-辛醇为内标物，将制备好的样品于60℃保温平衡5min后，用50/30μmdvb/car/pdms萃取头在60℃萃取50min，萃取结束后在gc进样口250℃解吸5min。化合物检索结果与nist标准谱库进行匹配，相似度达到80％以上确认为目的化合物。以未添加菌发酵的
培养液为空白对照组，计算各挥发性物质的含量。
[0055]
gc-ms检测色谱条件：
[0056]
气相色谱条件：hp-innowax色谱柱(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)；升温程序：起始温度40℃，保持5min，以4℃/min升到100℃，再以6℃/min升至230℃，
[0057]
保持10min，载气为高纯氦气(1.0ml/min)；进样口温度250℃，不分流。
[0058]
质谱条件：电子电离源，电子能量70ev；电子倍增器电压350v；离子源温度230℃；传输线温度250℃；质量范围40～450m/z。
[0059]
通过hs-spme/gc-ms对本发明筛选出的4株菌株进行发酵产物的挥发性物质检测分析，检测结果如表1所示，其中辛酸组分gc-ms检测结果如图1、图2、图3所示，其中图1为泰国肠球菌zqw21产辛酸gc-ms图；图2为泰国肠球菌zqw21所产的辛酸gc-ms分子碎片质谱图；图3为辛酸标准品gc-ms分子碎片质谱图。
[0060]
表1.不同菌株发酵液的挥发性酸类检测结果
[0061][0062]
从上表可知，泰国肠球菌zqw21发酵72h产辛酸为5.45g/l，相对于其他三株菌株，在产辛酸方面差异显著(p＜0.01)。本发明对泰国肠球菌zqw21进行了保藏，其保藏编号为cgmcc no：25135。

技术特征：
1.一种泰国肠球菌（enterococcus thailandicus）zqw21，其保藏号为cgmcc no.25135。2.如权利要求1所述的泰国肠球菌zqw21在白酒酿造中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述泰国肠球菌zqw21作为增强菌剂应用于白酒酿造中。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述泰国肠球菌zqw21应用于人工窖泥培养或强化大曲制备，以提高辛酸含量，为辛酸乙酯的形成提供前体物质。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述泰国肠球菌zqw21作为增强菌剂对酿酒微生物进行生物强化，用于开发白酒产品。6.如权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，所述增强菌剂的形式选自是液体、冻干制剂或粉末。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述增强菌剂还包括辅料，所述辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养物质包括但不限于：酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、水。8.一种用于白酒酿造的增强剂，其由于所述的泰国肠球菌zqw21制备而成。9.如权利要求8所述的增强剂，其特征在于，所述增强菌剂的形式选自是由所述的泰国肠球菌zqw21培养后制备成的液体、冻干制剂或粉末。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述增强菌剂还包括辅料，所述辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养物质包括但不限于：酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、水。

技术总结
本发明属于生物领域，具体涉及一株高产辛酸的泰国肠球菌及其应用。所述泰国肠球菌保藏号：CGMCC No.25135，其筛选于优质窖泥中，适应白酒酿造的环境，在实验中表明该菌株37℃发酵72h时，辛酸产量达5.45g/L，高于现有的菌株的辛酸产量，因而可作为增强菌剂应用于白酒酿造。造。


技术研发人员：赵秋伟 李寅 杨粟平 李姝
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/9/20