血液来源的样品在制备囊泡中的应用

1.本发明属于生物医药领域，涉及一种血液来源的样品在制备囊泡中的应用。


背景技术：

2.细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是细胞分泌的含有蛋白质、核酸及各种细胞因子的纳米级载体。细胞外囊泡可以通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，在细胞间物质传递和信息交流过程中发挥了重要作用。研究发现，细胞外囊泡所介导的信息交流在机体生理或病理过程中发挥了重要的调控作用，涉及到免疫调节、肿瘤生长、血管生成、损伤修复等。细胞外囊泡是细胞间通讯的重要媒介，使得细胞内地生物活性分子从一个细胞转移到另一个细胞从而发挥功能。因此，越来越清楚的是，这些囊泡参与许多生理过程，这将为疾病的治疗提供了应用的机会。
3.目前该领域的研究主要集中在外泌体(exosomes)方向。外泌体是直径在30-150nm左右的细胞外囊泡，其内含有rna、脂质和蛋白质等成分。外泌体广泛参与了机体的各种生理/病理性调控，能够用作多种疾病的诊断、治疗和预后评估。迄今为止，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)被认为是产生外泌体能力最强的细胞。众多的研究发现mscs来源的外泌体能模拟mscs的生物学功能，在促进细胞生长和分化，修复组织缺损等方面发挥了重要的调控作用。因此，近年来以mscs来源的外泌体为基础的细胞囊泡疗法取得了显著的发展。然而，目前以外泌体为基础的细胞囊泡治疗仍然存在诸多问题，主要表现在外泌体的提取和纯化过程复杂，耗时长，对设备和试剂的要求较高，生理性外泌体产量较低等等，这些缺陷都限制了外泌体治疗的临床转化和应用。
4.急性呼吸窘迫综合征(ards)自首次被描述以来，一直受到人们的关注，被认为是呼吸医学的主要临床问题，具有较高的发病率和死亡率。ards是由于肺内或/和肺外各种原因引起的、以肺损伤为主要表现的临床综合征，临床表现的显著特征是进行性呼吸困难和顽固性低氧血症。引起ards的肺内原因有重症肺炎、溺水误吸、肺挫伤、有毒物质吸入等，肺外原因有严重感染、严重外伤、休克、重症胰腺炎、中毒、大手术、心肺复苏后等，它们共同的病理基础是急性肺损伤。除了众所周知的ards的危险因素外，暴露于高臭氧水平和低维生素d血浆浓度也被发现是易感环境。ards治疗费用昂贵,然而目前除保护性肺通气、治疗原发病及支持治疗方法外，仍缺乏针对性治疗手段。基于最新研究，尽管ards总体生存率正在提高，但考虑到几项观察研究的住院死亡率，这可以解释为危险因素、诊断的可用性、识别ards的能力以及影响临床诊断的一些选择偏差试验，这些数据表明ards在世界范围内仍处于诊断不足和治疗不足的状态，目前对ards的定义在大多数临床情况下是不充分的。基于药物的预防战略仍然是一个重大挑战，一些最近的研究致力于改善这种疾病急性呼吸窘迫综合征的预后，但高死亡率和高致残并发症仍然有待改善。
5.结肠炎又称非特异性溃疡性结肠炎，其种类繁多，引发原因多样，并且起病多缓慢，病情轻重不一，主要临床表现腹泻、腹痛、粘液便及脓血便、里急后重、甚则大便秘结、数日内不能通大便，时而腹泻时而便秘，常伴有消瘦乏力等，多反复发作。腹痛一般多为隐痛
或绞痛，常位于左下腹或小腹。其它表现有食欲不振、腹胀、恶心、呕吐及肝大等，左下腹可有压痛，有时能触及痉挛的结肠。常见的全身症状有消瘦、乏力、发热、贫血等。有少部分病人在慢性的病程中，病情突然恶化或初次发病就呈暴发性，表现严重腹泻，给人或动物带来极大的痛苦。


技术实现要素：

6.在一些实施方案中，本发明提供了一种来源于血液的样品在制备囊泡中的应用，所述囊泡为诱导性囊泡。
7.在一些实施方案中，所述血液包括血浆、全血。
8.在一些实施方案中，所述血液为外周血。
9.在一些实施方案中，所述血液含有血细胞。
10.在一些实施方案中，所述样品包含外周血单个核细胞。
11.外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmcs)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，是一个有用的细胞来源，因其收集容易，为临床应用提供了方便。单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重在1.092左右，单个核细胞的比重为1.075-1.090，血小板为1.030-1.035。因此利用一种介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与单个核细胞分离。
12.在一些实施方案中，所述样品包含红细胞。
13.在一些实施方案中，所述外周血单个核细胞为来源于血液的经分离或未经分离的细胞。
14.在一些实施方案中，所述诱导性囊泡是在来源于的血液的样品中的细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而产生的囊泡。
15.在一些实施方案中，所述外力包括添加星形孢菌素、紫外线照射、饥饿法、或热应力法或其中一种或多种的组合。
16.在一些实施方案中，所述外力为热处理。
17.在一些实施方案中，所述热处理是在38℃～60℃范围内进行的。
18.在一些实施方案中，所述热处理是在40℃～55℃范围内进行的。
19.在一些实施方案中，所述热处理是在40℃～52℃范围内进行的。
20.在一些实施方案中，所述热处理是在42℃～52℃范围内进行的。
21.在一些实施方案中，所述热处理是在42℃～50℃范围内进行的。
22.在一些实施方案中，所述热处理的时间为3～20小时。
23.在一些实施方案中，所述热处理的时间为3～15小时。
24.在一些实施方案中，所述热处理的时间为3～12小时。
25.在一些实施方案中，所述热处理的时间为3～10小时。
26.在一些实施方案中，所述囊泡对annexinv,integrin alpha 5和syntaxin 4表达呈阳性。
27.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-6μm。
28.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-4.5μm。
29.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-1μm。
30.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.04-1μm。
31.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05-1μm。
32.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.1-1μm。
33.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.15-1μm。
34.在一些实施方案中，本发明提供了一种制备囊泡的方法，所述方法包括对来源于血液的样品进行外力处理从而获得所述囊泡，所述囊泡为诱导性囊泡。
35.在一些实施方案中，本发明提供了一种囊泡，由上述方法获得。
36.在一些实施方案中，本发明提供了来源于血液的样品的诱导性囊泡或含有所述囊泡的药物组合物在制备治疗或预防或改善疾病或所述疾病并发症的产品中的应用。
37.在一些实施方案中，所述产品包括药品、食品、保健品、化妆品、添加剂或中间品。
38.在一些实施方案中，所述疾病包括肺部疾病或肠道疾病或糖尿病。
39.在一些实施方案中，所述产品用于促进毛囊修复和/或毛发再生。
40.在一些实施方案中，所述肺部疾病为急性呼吸窘迫综合症。
41.在一些实施方案中，所述肠道疾病为肠炎。
42.在一些实施方案中，所述肠炎为急性肠炎。
43.在一些实施方案中，所述药物用于改善急性肠炎导致的小鼠体重下降或结肠缩短的症状。
44.在一些实施方案中，所述糖尿病为1型糖尿病。
45.在一些实施方案中，所述药物用于促进1型糖尿病伤口愈合。在一些实施方案中，所述血液为外周血。
46.在一些实施方案中，所述血液含有血细胞。
47.在一些实施方案中，所述样品包含外周血单个核细胞。
48.在一些实施方案中，所述样品包含红细胞。
49.在一些实施方案中，所述外周血单个核细胞为来源于血液的经分离或未经分离的细胞。
50.在一些实施方案中，所述诱导性囊泡是在来源于的血液的样品中的细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而产生的囊泡。
51.一些实施方案中，本发明提供的这种以外周血为样品在体外获得诱导性囊泡之后可以直接再用回原个体的体内，具有采样方便，来自自体的优点，因而具有极好的可操作性和安全性。
52.在一些实施方案中，所述外力包括添加星形孢菌素、添加乙醇、添加双氧水、紫外线照射、饥饿法、裂解液、热应力法、或机械力法中一种或多种的组合。
53.在一些实施方案中，所述外力为热处理法。
54.在一些实施方案中，所述热处理是在38℃～60℃范围内进行的。
55.在一些实施方案中，所述热处理是在40℃～55℃范围内进行的。
56.在一些实施方案中，所述热处理是在40℃～52℃范围内进行的。
57.在一些实施方案中，所述热处理是在42℃～52℃范围内进行的。
58.在一些实施方案中，所述热处理是在42℃～50℃范围内进行的。
59.在一些实施方案中，所述热处理的时间为3～20小时。
60.在一些实施方案中，所述热处理的时间为3～15小时。
61.在一些实施方案中，所述热处理的时间为3～12小时。
62.在一些实施方案中，所述热处理的时间为3～10小时。
63.在一些实施方案中，所述囊泡对annexinv,integrin alpha 5和syntaxin 4表达呈阳性。
64.在一些实施方案中，所述囊泡为诱导性囊泡。
65.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-6μm。
66.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-4.5μm。
67.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-1μm。
68.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.04-1μm。
69.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05-1μm。
70.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.1-1μm。
71.在一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.15-1μm。
72.在一些实施方案中，pbmc可通过30℃～100℃范围内的温度下加热pbmc持续预定时间来获得。或者，pbmc可通过在30℃至100℃范围内的温度下加热pbmc 1分钟至1000分钟范围内的时间段来获得。或者，pbmc可通过在30℃至100℃范围内的温度下加热pbmc10分钟至100分钟范围内的时间段来获得。或者，pbmc可通过在40℃至70℃范围内的温度下加热pbmc持续预定时间来获得。或者，pbmc可通过在40℃至70℃范围内的温度下加热干细胞1分钟至1,000分钟范围内的时间段来获得。或者，pbmc可通过在40℃至70℃范围内的温度下加热pbmc10分钟至100分钟范围内的时间段来获得。
73.一些实施方案中，本发明提供的这种以外周血为样品，采用热处理的方法获得所述的诱导性囊泡由于诱导过程无需额外添加诱导试剂，只需要加热处理，无需担心试剂残留残留的问题。具有采样方便，来自自体，在体外获得诱导性囊泡之后可以直接再用回原个体的体内，因而具有极好的可操作性和安全性。
74.在一些实施方案中，本发明的发明人意外地研究发现，对于人源的pbmc尤其适合采用热处理这种方法诱导获得诱导性囊泡。与鼠来源的pbmc相比，人源的pbmc采用热处理获得的囊泡极显著地高于鼠来源的pbmc采用热处理获得的囊泡。这样，进一步地体现了热处理pbmc获得诱导性囊泡具有极好的产业化前景，有利于大规模的生产。
75.在一些实施方案中，所述诱导性囊泡的制备方法包括步骤：(1)培养间充质干细胞；(2)收集间充质干细胞的培养基上清；(3)从步骤(2)中的培养基上清中分离出囊泡。
76.在一些实施方案中，通过选自由聚合物沉淀、免疫分离、磁免疫捕获、超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤、超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤和它们的组合所组成的组中的方法从培养基中分离所述囊泡。
77.在一些实施方案中，所述分离囊泡的方法包括以annexin v、integrin alpha 5和syntexin 4为标志物进行分离。
78.在一些实施方案中，所述步骤(1)中的培养间充质干细胞的步骤包括：(4)从组织中分离间充质干细胞；(5)添加培养基培养间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养基中接触凋亡诱导剂。
79.在一些实施方案中，所述步骤(3)中，分离囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。
80.在一些实施方案中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的培养上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收到的沉淀进行第四次离心，取沉淀。
81.在一些实施方案中，所述第一次离心为500-1500g离心5-30分钟；或者所述第一次离心为500-1000g离心5-20分钟；或者所述第一次离心为500-900g离心5-15分钟；或者第一次离心为800g离心5-10min。在一些实施方案中，所述第二次离心为1000-3000g离心5-30分钟；或者所述第二次离心为1500-2500g离心5-20分钟；或者所述第二次离心为1500-2200g离心5-15分钟；或者所述第二次离心为2000g离心5-10分钟。在一些实施方案中，所述第三次离心为10000-30000g离心15-60分钟；或者所述第三次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第三次离心为12000-20000g离心20-40分钟；或者所述第三次离心为16000-16500g离心30-35分钟。在一些实施方案中，所述第四次离心为10000-30000g离心15-60分钟，或者所述第四次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第四次离心为12000-20000g离心20-40分钟；或者所述第四次离心为16000-16500g离心30-35分钟。
82.在一些实施方案中，所述的血液样品来源于哺乳动物。
83.在一些实施方案中，所述哺乳动物选自灵长类动物或鼠。
84.在一些实施方案中，所述灵长类动物为人。
85.在一些实施方案中，本发明提供了一种囊泡，所述囊泡由上述方法获得的。
86.在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，包括所述的囊泡以及药学上可接受的辅料。
87.在一些实施方案中，所述药物组合物的制剂形式选自冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊、或贴剂。
附图说明
88.图1为使用福麦斯pbmc分离管分离人源pbmc的过程。
89.图2为ficoll-hypaque密度梯度离心分离pbmc的过程。
90.图3为人源pbmc凋亡状态图。
91.图4为ievs提取标准化流程技术路线图。
92.图5为利用流式细胞技术对提取的ievs进行分析。图5a为ievs的颗粒直径分布图。图5b为人源pbmcs在不同诱导条件下产出ievs的纳米粒子跟踪分析(nta)结果。图5c为鼠源pbmcs在不同诱导条件下产出ievs的纳米粒子跟踪分析(nta)结果。
93.图6为流式细胞技术对分离提取的pbmcs以及pbmcs来源的ievs的表面膜蛋白进行分析的结果。
94.图7为利用蛋白印记验证不同方式诱导得到的pbmc-ievs的蛋白内容物表达的结果。
95.图8为pbmcs来源的ievs治疗急性呼吸窘迫综合症的肺组织的he染色结果。
96.图9为pbmcs来源的ievs治疗急性呼吸窘迫综合症的肺组织的肺的湿/干重比结
果。
97.图10为pbmcs来源的ievs治疗肠炎的结果。图10a显示ievs治疗显著减轻了dss诱导的结肠炎小鼠体重减轻的趋势。图10b显示ievs治疗显著缓解dss诱导导致结肠长度显着减少，严重的结肠上皮和隐窝破坏以及炎性细胞的大量浸润的症状。图10c为he染色图显示ievs能抑制dss诱导的肠炎。
98.图11为pbmc来源的ievs能诱导肠炎小鼠cd3+t细胞的凋亡。
99.图12为pbms来源的ievs能抑制肠炎小鼠th17细胞的激活。
100.图13显示红细胞裂解液处理红细胞产生囊泡的状态图。
101.图14a-14b为流式初步检测囊泡的粒径以及分析凋亡表面标志物annexin v的表达情况。图14a为红细胞裂解液处理红细胞的结果。图14b为红细胞裂解液处理hbmscs的结果。
102.图15为红细胞产生的囊泡的治疗肠炎的结果。图15a为小鼠体重降低比例(％)；图15b为小鼠结肠组织照片和长度测量(cm)。
103.图16为各组小鼠脱毛区毛发新生情况。
104.图17为各组小鼠脱毛区皮肤组织结构。
105.图18为各组小鼠肺组织he染色。
106.图19为各组小鼠皮肤创口愈合情况。
107.图20a-20c为利用流式细胞技术对不同温度诱导pbmc产的ievs纳米粒子跟踪分析(nta)结果。图20a为产ievs的数量图。图20b为产ievs的粒径图。图20c为产ievs的电位图。
具体实施方式
108.以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
109.本文中，所述的“红细胞裂解液”来源于武汉赛维尔生物科技有限公司，货号g2015。
110.本发明实施例中的ievs为诱导性囊泡的简称，可称为诱导性囊泡，也可称为诱导性细胞外囊泡(induced extracellular vesicles,ievs)。诱导性细胞外囊泡是指的是一种在前体细胞(例如干细胞)正常存活时，被干预或诱导，使其凋亡产生的一类亚细胞产物。通常这一类亚细胞产物，具有膜结构，表达凋亡性标志物，部分包含有遗传物质dna。发明人发现诱导性细胞外囊泡是区分于细胞和常规细胞外囊泡(如外泌体等)的一类物质。在在一些实施方案中，所述的正常存活时的细胞，例如是非凋亡的细胞、非衰老的细胞、非老化而增殖停滞的细胞、非冻存后复苏的细胞、非发生恶变而异常增殖的细胞或非出现损伤的细胞等。在一些实施方案中，所述的正常存活时的细胞取自细胞培养过程中，细胞接触融合80-100％的时候的细胞。在一些实施方案中，所述的正常存活时的细胞取自对数期细胞。在一些实施方案中，所述的正常存活时的细胞取自人或鼠组织来源的原代培养及其传代培养细胞。在一些实施方案中，所述的正常存活时的细胞取自已确立的细胞系或细胞株。在一些实施方案中，所述的前体细胞取自早期的细胞。
111.本文中，所述的“pbmc”是指外周血单个核细胞，是外周血中具有单个核的细胞，包
括淋巴细胞和单核细胞。
112.本文中，所述的“红细胞裂解液”来源于武汉赛维尔生物科技有限公司，货号g2015。
113.本文中，“ab”同“ievs”或“apopevs”。rbc-evs(lysis)指的是裂解液诱导产生的红细胞来源的囊泡。
114.实施例1 pbmc来源的ievs的获得
115.1、人源pbmc分离实验
116.抗凝管取血，用pbs稀释血液(pbs：外周血＝1：1稀释血液)，之后加入到福麦斯pbmc分离管(预装，含分离液)，800g离心10min，取离心后白膜层(如图1)到新的50ml离心管，用适量pbs 300g，10min洗两次，rpmi(不含fbs)重悬细胞团进行细胞计数，细胞计数后调整细胞浓度为1x106/ml培养基，加入10cm培养皿中进行培养。
117.2、鼠源pbmc分离实验
118.ficoll-hypaque密度梯度离心分离pbmc细胞(solarbio各种动物外周血淋巴细胞分离液试剂盒)：
119.1.采血：左手拇、食指抓取小鼠(c57bl/6wt 12周雄性小鼠)双耳及颈后皮肤，小指固定尾部
→
中指将小鼠左侧前肢轻压在胸骨心脏部位，无名指按在腹部，捻动拇指，轻压取血侧眼部皮肤，使眼球充血突出
→
用弯头镊夹取眼球
→
根据需要捻动拇指与食指的方向，使血液从眼眶内以不同速度垂直流入离心管
→
同时用左手中指轻按小鼠心脏部位，以加快心脏泵血速度
→
当血液流尽时，用脱臼法处死小鼠。此法取小鼠全血0.8～1.2ml，注入edta-k2抗凝管中，轻轻摇匀。
120.2.稀释：室温下加入等体积的稀释液或pbs，轻轻吹打摇匀；
121.3.加样：取15ml离心管，吸取与1+2步骤等体积的分离液于离心管中，移液枪头贴着管壁缓慢将稀释后的血液平铺在分离液液面上面，(当1+2稀释后血液体积小于3ml时，加入3ml分离液；大于等于3ml时，加入等体积分离液)。
122.4.离心：室温，500g，15min，
↑4↓
0，离心后从管底至液面分4层，依次为红细胞和粒细胞层、分离液层、单个核细胞层、血浆层。
123.5.回收：将移液管直接插入白膜层(或先吸去上层的血浆)，轻轻吸出白膜层(如图2)至新的15ml离心管中。
124.6.洗涤：加入至少pbmc细胞体积3倍的pbs，室温，400g，5min，两次。
125.7.流式检测：取适量细胞进行cd11b和cd45染色，流式上机检测。
126.8.细胞计数：弃上清，加入1mlrpmi-1640培养基(含10％胎牛血清)，吹打混匀，制成pbmc细胞悬液。
127.9.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为1x106/ml培养基，加入10cm培养皿中进行培养。
128.3、pbmc来源的ievs的获得
129.分离提取的pbmc细胞，接种到不同刺激(pbmc+sts 500nm 16h，pbmc+乙醇200mm 16h，pbmc+乙醇800mm 16h，pbmc+h2o2200μm 16h，pbmc+h2o2800μm 16h，pbmc+uv 4h，pbmc+45℃6h)的培养皿中诱导凋亡，sts组、酒精组和双氧水组于37℃，5％二氧化碳培养箱培养；紫外线组于紫外交联仪300mj/cm2处理4h，加热组于45℃水浴锅处理6h。
130.各组的培养基为rpmi-1640培养基(含10％胎牛血清)，如在其基础上添加sts或乙醇或h2o2，或进行uv或加热处理。
131.采用以下方法分离提取ievs：诱导凋亡以后，检查细胞状态，确认大部分细胞发生凋亡(图3)，按照ievs提取标准化流程进行ievs的分离，技术路线详见图4：
132.(1)用移液器吹打分离细胞，收集细胞及上清液至15ml离心管；
133.(2)800g，10min，4℃；
134.(3)收上清转移至1.5mlep管(注意，勿弃上清)；
135.(4)2000g，10min，4℃；
136.(5)收上清至高速冷冻离心机适用玻璃管，弃沉淀；
137.(6)16,000g，30min,4℃(提前预冷)；
138.(7)弃上清，pbs重悬，转移至1.5mlep管中；
139.(8)16,000g，30min,4℃(提前预冷)；
140.(9)弃上清，无菌pbs重悬ab沉淀，4℃冰箱保存。
141.实施例2 pbmc来源ievs的分析
142.利用流式细胞技术对提取的ievs进行分析，结果显示从诱导后的1h至24h，ievs的颗粒直径分布主要都集中在1um以下，占95％左右(图5a，其为实施例1中鼠源pbmc+sts 500nm 16h组的结果)。纳米粒子跟踪分析(nta)结果显示人源(图5b，表1)和鼠源(图5c，表2)pbmcs在不同诱导条件下均可以产出ievs，且产生的ievs在粒径和电位方面与sts诱导下产生的ievs无显著差异。
143.利用流式细胞技术对上述实施例1分离提取的人源pbmcs进行分析，结果显示分离提取的pbmcs cd45阳性，可得出分离得到的就是pbmcs(如图6)。进一步对pbmcs来源的ievs的表面膜蛋白进行分析，结果显示，ievs能够表达细胞外囊泡的普遍性表面蛋白cd9(图6)。
144.表1人源pbmc来源的ievs
[0145][0146]
表2鼠源pbmc来源的ievs
[0147]
[0148]
利用蛋白印记进行验证不同方式诱导的pbmc-ievs的蛋白内容物表达，结果表明，不同诱导方式产生的ievs均能特异性表达annexin v,integrin alpha 5和syntexin 4(图7)。以上3种蛋白为区分mscs来源的ievs和exosomes的特征性蛋白标志物。
[0149]
实施例3 pbmc来源ievs的应用
[0150]
1、治疗急性呼吸窘迫综合症(ards)
[0151]
急性呼吸窘迫综合症(ards)发病率及死亡率均高，发病机制迄今尚未完全阐明，目前也无特效的治疗方法。本研究观察经气管滴注与尾静脉输注人外周血单个核细胞(pbmc)来源的ievs(或称“apopev”)对急性呼吸窘迫综合症模型小鼠的治疗效果。
[0152]
(1)实验方法
[0153]
1)实验动物：c57bl/6小鼠，性别不限，8-12周龄，spf级。
[0154]
2)研究药物为人pbmc-apopev悬液，其制备步骤如下：采用ficoll密度梯度离心法分离人新鲜全血的pbmc(8ml人全血约分离出1
×
107个pbmc)，pbs洗涤，加入星形孢菌素(sts)诱导凋亡，16小时候收集液体，800g 4℃离心10分钟，收集上清，2000g 4℃离心10分钟，收集上清，16000g 4℃离心30分钟，弃上清，1ml pbs重悬，16000g 4℃离心30分钟，再次弃上清。加pbs配置pbmc-apopev悬液，气管滴注1
×
106/30μl，静脉输注1
×
106/200μl，悬液在使用前4℃保存。
[0155]
3)ards小鼠模型构建及治疗：取8-12周龄c57bl/6小鼠，随机分为4组，每组3-5只，分别是正常对照组(control)，模型组(lps组)，人pbmc-apopev经气管滴注治疗组(pbmc-apopev-l组)及人pbmc-apopev尾静脉注射治疗组(pbmc-apopev-s组)。术前6小时禁食禁水，麻醉使用4％水合氯醛10ml/kg。模型组及治疗组均先气管滴注给予30μl lps(5mg/kg)，4小时后，治疗组分别经气管滴注30μl的pbmc-apopev(apopev约1
×
106个)，经尾静脉注射200μl的pbmc-apopev(apopev约1
×
106个)，造模24小时后处死小鼠(从lps给予后开始计算，到第24小时处死动物)。
[0156]
(2)实验结果
[0157]
1)肺组织的he染色：正常组的he染色切片可见图8中的control；lps组可见肺泡组织结构破坏严重，充血水肿明显，大量炎性细胞浸润，肺泡间隔明显增厚且结构紊乱；pbmc-apopev治疗组，小鼠肺组织的充血及炎症浸润明显减轻，肺组织渗出减少，肺泡间隔增厚和结构紊乱也有明显改善。其中气管滴注组(pbmc-apopev-l组)与全身静脉输注组(pbmc-apopev-s组)疗效相似(图8)。
[0158]
2)肺的湿/干重比：称量肺湿重，烤箱烤干到恒重称量得到肺干重。根据公式计算肺部w/d值。结果表明，lps刺激显著增加了小鼠肺湿/干重比值，而经气管滴注或尾静脉输注的pbmc-apopev治疗则显著降低了这一比值，但各个治疗组之间没有差异(图9)。
[0159]
2、治疗肠炎
[0160]
(1)研究方法
[0161]
1)实验动物：c57bl/6小鼠，性别不限，8-12周龄，spf级。
[0162]
2)人pbmc-apopev悬液的制备：采用ficoll密度梯度离心法分离人新鲜全血的pbmc(8ml人全血约分离出1
×
107个pbmc)，pbs洗涤，加入500nm星形孢菌素(含有500nm sts的rpmi-1640培养基)诱导凋亡，16小时候收集液体，800g 4℃离心10分钟，收集上清，2000g 4℃离心10分钟，收集上清，16000g 4℃离心30分钟，弃上清，1mlpbs重悬，16000g 4℃离心
30分钟，再次弃上清。加pbs配置pbmc-apopev悬液，静脉输注1
×
106/200μl，悬液在使用前4度保存。
[0163]
3)dss诱导的小鼠肠炎模型构建及治疗：取8-12周龄c57bl/6小鼠，给予3％(w：v)硫酸葡聚糖硫酸钠(dss，分子量：36,000
–
50,000da；mp biochemicals，160110)饮水10天诱发结肠炎。在dss处理第3天时，小鼠经尾静脉注射200μl的pbmc-apope(apopev约1
×
106个)，造模10天时处死小鼠。
[0164]
(2)实验结果
[0165]
1)如图10所示，pbmc能抑制dss诱导的肠炎。结肠炎小鼠的体重显著降低，ievs治疗显著减轻了dss诱导的结肠炎小鼠体重减轻的趋势(图10a)。dss诱导导致结肠长度显著减少，严重的结肠上皮和隐窝破坏以及炎性细胞的大量浸润，而ievs治疗显著缓解这些症状(图10b，10c)。
[0166]
2)图11的结果显示，pbmc ievs能调节肠炎小鼠t细胞过度激活。ievs治疗可显著诱导肠炎小鼠过度激活的cd3
+
t细胞的凋亡。其中pbms来源ievs效果优于pbms外泌体(exo或exosome)。
[0167]
3)pbms来源的ievs能抑制肠炎小鼠th17细胞的激活。ievs治疗可显著诱导肠炎小鼠循环中的th17细胞(图12)。
[0168]
plasma-mv组，plasma-exo low组，plasma exo high组分别指未诱导状态下血浆中的大囊泡，外泌体(小囊泡)低剂量组，外泌体(小囊泡)高剂量组。
[0169]
实施例4红细胞来源的囊泡的获得
[0170]
1、红细胞来源及分离步骤
[0171]
静脉抽取志愿者10ml血液样本置于edta抗凝管内，加入等体积的pbs缓冲液1:1混合制成细胞悬液。取4个新的15ml离心管，预先在每管中加入5ml人外周血淋巴分离液(solarbio,#p8610)，将5ml血与pbs的混合液沿管壁缓慢加入到淋巴液上层，用低速水平离心机550g，4℃，离心30min，升速为4降速为0。离心后管内可见分为4层：最上层是淡黄色稀释的血浆；第二层为云雾状的白膜层，为外周血单个核细胞(pbmc)；第三层为淋巴分离液层；第四层为红细胞，红细胞沉于管底。弃掉红细胞层以上所有液体，吸取红细胞加入40mlpbs缓冲液中，400g，4℃，离心10min，洗去残余的血浆，淋巴分离液以及低速离心去除部分血小板。该离心步骤可重复1次。获得的红细胞可用适量pbs重悬。
[0172]
2、使用红细胞裂解液诱导红细胞(rbc)产生囊泡
[0173]
每1ml全血来源的红细胞使用10ml红细胞裂解液裂解。使用红细胞裂解液处理红细胞4小时，吹打培养皿底细胞，收集所有脱落的细胞和细胞上清；将其进行800g，4℃离心10min，留上清；2000g，4℃离心10min，留上清；上清16000g，4℃离心30min，弃上清，保留囊泡沉淀；加入1ml pbs吹打重悬沉淀，16000g，4℃离心30min，弃上清，保留囊泡沉淀；囊泡沉淀可用适量pbs重悬，待用。
[0174]
使用荧光显微镜进行观察，结果如图13(裂解第30min观察到的)所示，从图13可以看出，使用红细胞裂解液处理rbc可发现细胞膜出现明显皱缩的形态改变以及产生囊泡(红色箭头)。裂解液可诱导rbc以释放“囊泡”的形式死亡，而非细胞胀破。
[0175]
实施例5红细胞裂解液诱导rbc产生的囊泡的分离鉴定
[0176]
收集到的囊泡的鉴定步骤：按bd品牌的annexin v/pi凋亡染色说明书要求，取适
量囊泡用100μl binding buffer重悬，加入2μlannexin v染料(一种特异性结合膜表面磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)的染料)，室温孵育15min，流式细胞仪检测annexin v阳性囊泡比例，即膜表面表达ps阳性囊泡的比例。
[0177]
流式初步检测囊泡的粒径以及分析凋亡表面标志物磷脂酰丝氨酸(ps)的表达情况。结果如图14所示，裂解液诱导rbc死亡后产出的囊泡高表达ps(图14a)，具有类似干细胞来源的ievs的ps强阳性的表面特征(14b)，推测在体内具有类似的代谢途径和功能。
[0178]
其中，使用红细胞裂解液诱导hbmscs产生囊泡：使用红细胞裂解液处理hbmscs(第8代)4小时，800g，4℃离心10min，留上清；2000g，4℃离心10min，留上清；上清16000g，4℃离心30min，弃上清，留囊泡沉淀；加入1ml pbs吹打重悬沉淀，16000g，4℃离心30min，弃上清，留囊泡沉淀；囊泡沉淀可用适量pbs重悬，待用。
[0179]
裂解液诱导rbc产生的囊泡的具体步骤：具体步骤如实施例4中所述。
[0180]
实施例6红细胞裂解液诱导rbc产生的囊泡的应用
[0181]
1、实验方法：
[0182]
使用葡聚糖硫酸钠盐(dextran sulfate sodium salt,dss)溶液诱导小鼠溃疡性结肠炎，观察裂解液诱导产生的红细胞来源的囊泡(rbc-evs)对小鼠肠炎是否有治疗作用。
[0183]
选取8周，雄性，c57小鼠进行实验，每组2只。对照组(control组)正常饮水和喂食，造模组(dss组)和治疗组(hbmsc-apoevs组，rbc-evs组)均自由饮用2.5％dss溶液，正常喂食，持续8天，每日记录体重变化及便血程度。其中，治疗组于第3日予以尾静脉注射相应的囊泡进行治疗，hbmsc-apoevs组每只注射一个10cm dish的hbmscs(大约3
×
10^6个hbmscs)来源的囊泡(方法同中国专利申请202110077486.9中的囊泡获得方法))，rbc-evs组每只注射10^8个rbc裂解产生的囊泡(实施例5的方法获得的)。造模组仅注射同等体积的pbs。第8日，取小鼠结肠组织，拍照，测量长度，组织固定，包埋切片。
[0184]
2、实验结果：
[0185]
结果如图15所示，从图中可以看出，尾静脉注射rbc-evs可明显改善急性肠炎导致的小鼠体重下降和结肠缩短的症状，表明来源于rbc产生的囊泡具有一定的疾病治疗和应用价值。
[0186]
实施例7红细胞(rbc)或红细胞囊泡(rbc-evs)促毛发生长
[0187]
1、实验步骤：
[0188]
选择balb/c小鼠，雄性，毛发生长休止期(第6周)开始实验，以平行脊椎为长轴方向进行背部剃毛，脱毛剂脱毛，制作2cm
×
4cm的脱毛区进行造模；造模次日进行干预，每周尾静脉注射一次1
×
109个鼠rbc裂解产生的ev(共3
×
10
10
个ev)，pbs组注射等rbc-evs(lysis)组体积的pbs，rbc组每周尾静脉注射一次1
×
109个鼠rbc。每日观察小鼠毛发生长情况并拍照记录新生毛发面积。观察周期为4周，4周后取小鼠脱毛区皮肤，组织切片染色，检测毛囊数量，毛囊大小，毛囊细胞增殖情况等。
[0189]
组织染色：取小鼠脱毛区皮肤组织，经固定脱水后行皮肤组织纵切片，免疫荧光染色，蓝色表示细胞核(nucleus)，绿色表示细胞骨架(actin)，统计毛囊数量。
[0190]
rbc-evs(lysis)组的囊泡获得方法同实施例4中红细胞裂解液诱导红细胞(rbc)产生囊泡的方法。
[0191]
2、实验结果：
[0192]
如图16所示，第21天时rbc组和rbc-evs(lysis)组小鼠的新生毛发面积明显高于pbs组。如图17所示，rbc组和rbc-evs(lysis)组小鼠脱毛区毛囊数量明显增加。实验结果表明,rbc或rbc-evs(lysis)具有明显促进小鼠脱毛区毛发新生和增加毛囊数量的作用。
[0193]
实施例8红细胞囊泡(rbc-evs)在小鼠急性呼吸窘迫综合征(ards)和糖尿病伤口愈合模型中的治疗应用
[0194]
1、ards模型
[0195]
1.1实验步骤：
[0196]
取8周龄c57bl/6小鼠，随机分为3组，分别是正常对照组(control)，ards模型组，rbc-evs(lysis)气管滴注治疗组。术前6小时禁食禁水，麻醉使用4％水合氯醛10ml/kg。模型组及治疗组均先气管滴注给予30μl lps(按小鼠体重计算给药，5mg/kg)，正常组滴注等体积的pbs。4小时后，治疗组经气管滴注50μl的rbc-lysis-ev(约3
×
10
10
个)，正常组和ards造模组滴注等体积的pbs。造模48小时后处死小鼠，取肺组织固定切片染色。
[0197]
其中，rbc-evs(lysis)组的囊泡获得方法同实施例4中红细胞裂解液诱导红细胞(rbc)产生囊泡的方法。
[0198]
1.2实验结果：
[0199]
肺组织的he染色：如图18可见，与control组相比，ards组可见肺泡组织结构破坏严重，充血水肿明显，大量炎性细胞浸润，肺泡间隔明显增厚且结构紊乱。rbc-evs(lysis)气管滴注组，小鼠肺组织的充血及炎症浸润程度明显减轻，肺组织渗出减少，肺泡间隔增厚和结构紊乱情况也有明显改善。
[0200]
2、1型糖尿病伤口愈合模型
[0201]
2.1实验步骤：
[0202]
取6周龄c57bl/6小鼠，随机分为3组，分别是正常对照组(control)，1型糖尿病(t1dm)模型组，rbc-evs(lysis)局部注射治疗组。所有小鼠适应性喂养1周。建模开始前禁食、禁水12h，测量空腹体重及血糖并记录。按空腹体重计算小鼠所需链脲佐菌素(streptozotocin，stz)剂量(50mg/kg
·d·
只)，于小鼠左下腹注射，1次/d，连续5d。给药后第7天，连续3d尾静脉取血测随机血糖，血糖平均值≥16.7mmol/l即为建模成功。各组小鼠背部剃毛，脱毛膏脱毛，剪刀剪去背部皮肤，制作1cm
×
1cm的开放性皮肤创口，创口模型建立后治疗组单次局部注射100μl的rbc-lysis-ev(约3
×
10
10
个)，正常组和t1dm模型组局部注射等体积的pbs。每日观察各组小鼠创口愈合情况并拍照记录。
[0203]
其中，rbc-evs(lysis)组的囊泡获得方法同实施例4中红细胞裂解液诱导红细胞(rbc)产生囊泡的方法。
[0204]
2.2实验结果：
[0205]
如图19可见，与control组相比，t1dm组创口愈合速度减慢。创口造模后第7天，rbc-evs(lysis)局部注射治疗组创口愈合程度明显增加，表明rbc-evs(lysis)可明显促进糖尿病小鼠的皮肤创口愈合。
[0206]
实施例9 pbmc来源ievs的分析
[0207]
1、人源pbmc分离(福麦斯pbmc分离管(预装，含分离液)
[0208]
抗凝管取血，用pbs稀释血液(pbs：外周血＝1：1稀释血液)，之后加入到福麦斯pbmc分离管，800g离心10min，取离心后白膜层到新的50ml离心管，用适量pbs 300g，10min
洗两次，rpmi(不含fbs)重悬细胞团进行细胞计数，细胞计数后调整细胞浓度为1
×
106/ml培养基，加入10cm培养皿中进行培养。
[0209]
2、诱导pbmc凋亡：
[0210]
pbmc+sts 500nm 12h，pbmc+42℃6h，pbmc+43℃6h，pbmc+45℃6h，pbmc+48℃6h。
[0211]
3、ievs提取：
[0212]
方法同实施例1。
[0213]
4.zetaview检测：ievs沉淀沉淀用ddh2o重悬，稀释至合适倍数，上机检测(pmx-420-12f-r5)，结果如图20a-20c所示。

技术特征：
1.来源于血液的样品在制备囊泡中的应用，其特征在于，所述囊泡为诱导性囊泡。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血液包括血浆、全血；优选地，所述血液为外周血；或优选地，所述血液含有血细胞；更为优选地，所述样品包含外周血单个核细胞；或更为优选地，所述样品包含红细胞；优选地，所述外周血单个核细胞为来源于血液的经分离或未经分离的细胞。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诱导性囊泡是在来源于的血液的样品中的细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而产生的囊泡；优选地，所述外力包括添加星形孢菌素、添加乙醇、添加双氧水、紫外线照射、饥饿法、裂解液、热应力法、或机械力法中的至少一种；优选地，所述外力为热处理；优选地，所述热处理是在38℃～60℃范围内进行的；优选地，所述热处理是在40℃～55℃范围内进行的；优选地，所述热处理是在40℃～52℃范围内进行的；优选地，所述热处理是在42℃～52℃范围内进行的；优选地，所述热处理是在42℃～50℃范围内进行的；优选地，所述热处理的时间为3～20小时；优选地，所述热处理的时间为3～15小时；优选地，所述热处理的时间为3～12小时；优选地，所述热处理的时间为3～10小时。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述囊泡对annexinv,integrin alpha 5和syntaxin 4表达呈阳性；优选地，所述囊泡的直径为0.03-6μm；优选地，所述囊泡的直径为0.03-4.5μm；优选地，所述囊泡的直径为0.03-1μm；优选地，所述囊泡的直径为0.04-1μm；优选地，所述囊泡的直径为0.05-1μm；优选地，所述囊泡的直径为0.1-1μm；优选地，所述囊泡的直径为0.15-1μm。5.一种制备囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括对来源于血液的样品进行外力处理从而获得所述囊泡；优选地，所述血液为外周血；或优选地，所述血液含有血细胞；更为优选地，所述样品包含外周血单个核细胞；或更为优选地，所述样品包含红细胞；优选地，所述外周血单个核细胞为来源于血液的经分离或未经分离的细胞。优选地，所述诱导性囊泡是在来源于的血液的样品中的细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而产生的囊泡；
优选地，所述外力包括添加星形孢菌素、添加乙醇、添加双氧水、紫外线照射、饥饿法、裂解液、热应力法或或机械力法中的至少一种；优选地，所述外力为热处理法；优选地，所述热处理是在38℃～60℃范围内进行的；优选地，所述热处理是在40℃～55℃范围内进行的；优选地，所述热处理是在40℃～52℃范围内进行的；优选地，所述热处理是在42℃～52℃范围内进行的；优选地，所述热处理是在42℃～50℃范围内进行的；优选地，所述热处理的时间为3～20小时；优选地，所述热处理的时间为3～15小时；优选地，所述热处理的时间为3～12小时；优选地，所述热处理的时间为3～10小时；优选地，所述囊泡对annexin v,integrin alpha 5和syntaxin 4表达呈阳性；优选地，所述囊泡为诱导性囊泡；优选地，所述囊泡的直径为0.03-6μm；优选地，所述囊泡的直径为0.03-4.5μm；优选地，所述囊泡的直径为0.03-1μm；优选地，所述囊泡的直径为0.04-1μm；优选地，所述囊泡的直径为0.05-1μm；优选地，所述囊泡的直径为0.1-1μm；优选地，所述囊泡的直径为0.15-1μm。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述的囊泡进行提取；优选地，所述的方法包括以下步骤：(1)获得外周血单核细胞，进行培养；(2)在培养基中，对所述的外周血单核细胞进行热处理，诱导所述囊泡的释放；(3)收集步骤(2)的培养基上清，分离出所述囊泡；优选地，通过选自由聚合物沉淀、免疫分离、磁免疫捕获、超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤、超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤和它们的组合所组成的组中的方法从培养基中分离所述囊泡；优选地，所述分离囊泡的方法包括以annexin v、integrin alpha 5和syntexin 4为标志物进行分离；优选地，通过选用超速离心的方法分离所述囊泡。7.如权利要求1-4任一所述的应用或权利要求5-6任一所述的方法，其特征在于，所述样品来源于哺乳动物；优选地，所述哺乳动物选自灵长类动物或鼠；优选地，所述灵长类动物为人。8.一种囊泡，其特征在于，由权利要求5或6所述的方法获得。9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求8所述的囊泡以及药学上可接受的辅料；
优选地，所述药物组合物的制剂形式选自冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊、或贴剂。10.权利要求8所述的囊泡或权利要求9所述的药物组合物在制备治疗或预防或改善疾病或所述疾病并发症的产品中的应用；优选地，所述产品包括药物、食品、保健品、化妆品、添加剂或中间品；优选地，所述疾病包括肺部疾病或肠道疾病或糖尿病；优选地，所述产品用于促进毛囊修复和/或毛发再生；更为优选地，所述肺部疾病为急性呼吸窘迫综合症；或更为优选地，所述肠道疾病为肠炎；优选地，所述肠炎为急性肠炎；优选地，所述药物用于改善急性肠炎导致的小鼠体重下降或结肠缩短的症状；优选地，所述糖尿病为1型糖尿病；优选地，所述药物用于促进1型糖尿病伤口愈合。

技术总结
本发明属于生物医药领域，涉及一种血液来源的样品在制备囊泡中的应用。本发明提供的来源于血液的样品在制备囊泡中的应用，所述囊泡为诱导性囊泡。本发明提供的这种以外周血为样品，在体外诱导获得诱导性囊泡之后可以直接将其再用回原个体的体内，具有采样方便，来自自体的优点，具有极好的可操作性和安全性。具有极好的可操作性和安全性。具有极好的可操作性和安全性。


技术研发人员：寇晓星 施松涛 曹泽源 谭灵屏
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2022.06.02
技术公布日：2023/9/20