一种HTCP荧光探针及其用途

一种htcp荧光探针及其用途
技术领域
1.本发明涉及物质定量检测技术领域，尤其是指一种htcp荧光探针及其用途。


背景技术：

2.生命系统中的物质变化和能量转换是由众多化学反应共同作用的结果。氧化还原反应是一种重要的细胞生化反应，参与能量产生、信号转导、增殖、分化、凋亡等多种生理和病理过程。机体中氧化物质含量异常高时不仅对dna和蛋白质造成严重破坏，还会引发一系列疾病，如炎症、动脉粥样硬化、神经退行性疾病和癌症。为了减轻氧化损伤和维持氧化还原动态平衡，抗氧化剂起着关键作用。体内起氧化还原作用的物质很多，其中，半胱氨酸、过氧化氢是重要的氧化还原性物质。
3.半胱氨酸（cys）是生物硫醇之一，它是一种半必需氨基酸（aa），因为它可以从饮食中获得，也可以通过硫磺途径降解蛋氨酸而产生。在哺乳动物的饮食中，半胱氨酸被认为是含硫氨基酸的代表。在我们体内最丰富的形式是l-半胱氨酸。在人体血浆中，半胱氨酸浓度水平为240-360μm，在人体内的生物过程中起着重要的作用。它参与催化许多重要的代谢反应，是维持体内氧化还原平衡过程中的关键调节物质，同时参与蛋白质合成，转录后修饰，以及体内代谢重金属的解毒过程。半胱氨酸含量失常时会对机体产生严重影响，可作为许多疾病的生物标志物，如生长迟缓、帕金森症、心血管疾病等。因此，定量检测生物体中半胱氨酸浓度具有重要的应用价值。目前用来定量检测生物硫醇的传统方法主要包括高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,hplc）、滴定分析、质谱学（massspectrometry,ms）和电位法（electrochemicalmethod,em），然而这些分析方法操作复杂，成本较高；相较之下，荧光技术具有灵敏度高、检测限低、实时检测、简单、经济等优点，得到了广泛应用。研究表明，已报道的半胱氨酸荧光探针主要基于裂解、环化、michale加成反应和其他反应机理，同时以丙烯酸酯、α,β-不饱和酮基为识别基团实现对半光氨酸的检测。
4.但以上探针仍存在如合成繁琐、斯托克斯位移小、选择性不高、灵敏度欠缺、生物适应性差、响应时间较长等不足，因此，在探针的设计中，需要考虑高选择性、高灵敏度、高光学稳定性、大斯托克斯位移、近红外区发射和良好的溶解性等。
5.迄今为止，各种用于不同领域的新型荧光探针不断被人们发掘，但到目前为止以羟基三氰基吡咯（htcp）（分子式如下）为受体检测生物小分子的荧光探针少有报道。因而此方向值得进行深入研究。
6.

技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是提供一种htcp荧光探针及其用途，基于分子内电荷转移（ict）机制设计合成了三种以htcp为受体的荧光探针，各探针对其分析物均具有较高的选择性和灵敏度；初步验证了探针的光学性质及其识别性能，为氧化还原性物质的定量测定和浓度监测提供了新的途径。
8.为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种htcp荧光探针，基于htcp分别合成了“off-on”荧光探针htcp-cys、小分子近红外荧光探针bpin-h2o2及小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2；所述“off-on”荧光探针htcp-cys的具体合成方法如下：；所述小分子近红外荧光探针bpin-h2o2的具体合成方法如下：；所述小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2的具体合成方法如下：
。
9.优选地，合成所述“off-on”荧光探针htcp-cys具体包括以下步骤：s11，htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙和2,3-丁二酮，加去离子水搅拌均匀后，再缓慢加入naoh溶液，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物；通过1hnmr、
13
cnmr进行表征；s12，htcp中间体的合成及表征：向烧瓶中加入htcp，对羟基苯甲醛和乙酸铵，加入无水乙醇，置于磁力搅拌器上常温反应5h；反应完成后，在烧杯中加入大量石油醚，用吸管将反应液吸入石油醚中，重结晶析出橙红色结晶即为中间体；随后进行抽滤，干燥后得到纯净的中间体；通过1hnmr、
13
cnmr进行表征；s13，探针htcp-cys的合成及表征：向烧瓶中加入htcp中间体，用无水乙腈溶解后，于冰浴中加入三乙胺，溶液变为紫色；搅拌两分钟后加丙烯酰氯，溶液变黄且有大量白烟，反应15min后取出反应瓶，随后用硅胶柱层析进行纯化，以二氯甲烷/甲醇作流动相进行洗脱，用旋转蒸发仪去除洗脱剂，真空干燥，得黄色固体；通过1hnmr、
13
cnmr和esi-ms进行表征。
10.优选地，合成所述小分子近红外荧光探针bpin-h2o2具体包括以下步骤：s21，htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙和2,3-丁二酮，加去离子水搅拌均匀后，再缓慢加入naoh溶液，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物；通过1hnmr、
13
cnmr进行表征；s22，探针bpin-h2o2的合成及表征：取4-甲酰基苯硼酸频哪醇酯，htcp，乙酸铵置于圆底烧瓶中，加入的无水乙醇中，混合物在室温下搅拌6h；反应完成后，通过柱色谱法纯化，使用二氯甲烷/甲醇作为流动相进行洗脱，得到黄色固体；通过1hnmr、
13
cnmr和esi-ms进行表征。
11.优选地，合成所述小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2具体包括以下步骤：s31，htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙和2,3-丁二酮，加去离子水搅拌均匀后，再缓慢加入naoh溶液，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物；通过1hnmr、
13
cnmr进行表征；s32，化合物3的合成：取对羟基苯甲醛，4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，碳酸钾置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈，在80℃下回流7h；反应完后用水和乙酸乙酯萃取，收集有机层浓
缩之后得到化合物3；s33，取化合物3，htcp，乙酸铵加入无水乙醇中，混合物在室温下搅拌6h，反应完成后，通过柱色谱法纯化，使用二氯甲烷/甲醇作流动相进行洗脱，得到黄色固体；通过1hnmr、
13
cnmr和esi-ms进行表征。
12.上述任意一项所述的一种htcp荧光探针的用途，基于htcp的“off-on”荧光探针htcp-cys应用于半胱氨酸的检测；基于htcp的小分子近红外荧光探针bpin-h2o2应用于h2o2的检测；基于htcp的小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2应用于h2o2的检测。
13.本发明的有益效果：（1）本发明设计并合成了基于htcp的“off-on”荧光探针htcp-cys，并成功地将其应用于半胱氨酸的检测。该探针通过“ict”机制对半胱氨酸进行特异性地响应。半胱氨酸与探针的丙烯酸酯基团成环离去，o-加长了共轭结构，从而导致荧光信号的变化。探针的荧光强度与分析物浓度具有较好的线性、选择性和较低的检出限（40.36nm）。
14.（2）本发明设计并合成了基于htcp的小分子近红外荧光探针bpin-h2o2，并成功地将其应用于h2o2的检测。该探针以硼酸酯基为响应基团，与过氧化氢发生氧化反应，使共轭结构延长，导致探针的发射波长发生变化，对h2o2进行特异性地响应。探针的荧光强度与分析物浓度具有较好的线性、选择性和较低的检出限（102.02nm）。
15.（3）本发明设计并合成了基于htcp的小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2，并成功地将其应用于h2o2的检测。该探针以芳基硼酸酯基为响应基团，与过氧化氢发生氧化反应，使共轭结构延长，导致探针的发射波长发生变化，对h2o2进行特异性地响应。探针的荧光强度与分析物浓度具有较好的线性、选择性和较低的检出限（310.93nm）。
16.综上所述，本发明基于分子内电荷转移（ict）机制设计合成了三种以htcp为受体的荧光探针，各探针对其分析物均具有较高的选择性和灵敏度；初步验证了探针的光学性质及其识别性能，为氧化还原性物质的定量测定和浓度监测提供了新的途径。
附图说明
17.图1为本发明的htcp核磁氢谱；图2为本发明的htcp核磁碳谱；图3为本发明的htcp中间体核磁氢谱；图4为本发明的htcp中间体核磁碳谱；图5为本发明的htcp-cys的核磁氢谱图6为本发明的htcp-cys的核磁碳谱；图7为本发明的htcp-cys的质谱；图8为本发明的bpin-h2o2的核磁氢谱；图9为本发明的 bpin-h2o2的核磁碳谱；图10为本发明的bpin-h2o2的质谱；图11为本发明的phbpin-h2o2的核磁氢谱图12为本发明的phbpin-h2o2的核磁碳谱；图13为本发明的phbpin-h2o2的质谱；图14为本发明的htcp-cys的响应测试；
图15为本发明的htcp-cys的光学性能；图16为本发明的bpin-h2o2的响应测试；图17为本发明的bpin-h2o2的光学性能；图18为本发明的phbpin-h2o2的响应测试；图19为本发明的phbpin-h2o2d的光学性能。
18.附图标记：14-（a）、用cys（50μm）处理后htcp-cys（10μm）的紫外-可见吸收光谱变化。
19.15-（b）、探针htcp-cys（10μm）对cys（50μm）在pbs（10 mm, ph = 7.4, 10% dmso，v/v）溶液中的荧光强度。
20.14-（c）、探针htcp-cys（10μm）在不同时间对cys（50μm）的荧光强度。λex = 520 nm，狭缝：10 nm/10 nm。
21.15-（a）、加入cys（0
–
30μm）后htcp-cys（10μm）的荧光滴定。
22.15-（b）、615 nm处的荧光强度与cys浓度（0
–
12μm）的标准曲线。
23.15-（c）、探针htcp cys（10μm）对pbs中各种氨基酸和其他分析物的荧光响应。每种氨基酸的浓度为1 mm，其他分析物的浓度为500μm。λex = 520 nm，狭缝：10 nm/10 nm。
24.16-（a）、用h2o2（100 μm）处理后，bpin-h2o2（10μm）的紫外-可见吸收光谱变化。
25.16-（b）、探针bpin-h2o2（10μm）对h2o2（100μm）在pbs（10 mm, ph = 7.4, 10% etoh，v/v）溶液中的荧光强度。
26.16-（c）、探针bpin-h2o2（10μm）在不同时间对h2o2（100μm）的荧光强度。 λ
ex
=520 nm，狭缝：10 nm/10 nm。
27.17-（a）、加入h2o2（0
–
50 μm）后bpin-h2o2（10μm）的荧光滴定；17-（b）、612nm处的荧光强度与h2o2浓度（0
–
50μm）的标准曲线。
28.17-（c）、探针bpin-h2o2（10μm）对pbs中各种氨基酸和其他分析物的荧光响应。
29.18-（a）、用h2o2（100 μm）处理后phbpin-h2o2（10μm）的紫外-可见吸收光谱变化。
30.18-（b）、探针phbpin-h2o2（10μm）对h2o2（100μm）在pbs（10 mm, ph = 7.4, 10% etoh，v/v）溶液中的荧光强度。
31.18-（c）、探针phbpin-h2o2（10 μm）在不同时间对h2o2（100 μm）的荧光强度。λex = 520 nm，狭缝：10 nm/10 nm。
32.19-（a）、加入h2o2（0
–
100μm）时phbpin-h2o2（10μm）的荧光滴定。
33.19-（b）、612 nm处的荧光强度与h2o2浓度（0
–
50μm）的标准曲线。
34.19-（c）、探针phbpin-h2o2（10μm）对pbs中各种氨基酸和其他分析物的荧光响应。每种氨基酸的浓度为1 mm，其他分析物的浓度为500 μm。λ
ex
= 520 nm；狭缝：10 nm/10 nm。
具体实施方式
35.为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
36.合成“off-on”荧光探针htcp-cys。
37.（1）htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙烯（2.5g,0.02mol）和2,3-丁二酮（3.2ml,0.04mol），加去离子水40ml搅拌均匀后，再缓慢加入0.5mol/l的naoh溶液500μl，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物。
38.通过1hnmr、
13
cnmr进行表征。1hnmr（400mhz,methanol-d4）（如图1）δ2.27（s,3h）,1.54（s,3h）。
13
cnmr（100mhz,methanol-d4）（如图2）δ178.4,160.8,113.8,113.1,110.4,104.4,93.9,45.9,21.8,11.6。
39.（2）htcp中间体的合成及表征：向烧瓶中加入htcp（2g,10mmol），对羟基苯甲醛（1.83g,15mmol）和乙酸铵（0.77g,10mmol），加入15ml无水乙醇，置于磁力搅拌器上常温反应5h。反应完成后，在500ml烧杯中加入大量石油醚，用吸管将反应液吸入石油醚中，重结晶析出橙红色结晶即为中间体。随后进行抽滤，干燥后得到纯净的中间体。
40.通过1hnmr、
13
cnmr进行表征。1hnmr（400mhz,dmso）（如图3）δ10.44（d,j=17.3hz,2h）,7.79（d,j=16.2hz,1h）,7.69（d,j=8.8hz,2h）,7.15（d,j=0.9hz,1h）,6.95（d,j=16.1hz,1h）,6.87（d,j=8.7hz,2h）,1.68（s,3h）。
41.13
cnmr（100mhz,dmso-d6）（如图4）δ171.6,161.8,160.9,146.8,131.8,126.3,116.8,115.8,114.6,113.2,112.4,98.2,93.9,44.2,26.2。
42.（3）探针htcp-cys的合成及表征：向烧瓶中加入htcp中间体（304.31mg,1mmol），用15ml无水乙腈溶解后，于冰浴中加入三乙胺（208μl,2mmol），溶液变为紫色。搅拌两分钟后加丙烯酰氯（160μl），溶液变黄且有大量白烟，反应15min后取出反应瓶，随后用硅胶柱层析进行纯化，以二氯甲烷:甲醇（100:1）作流动相进行洗脱，用旋转蒸发仪去除洗脱剂，真空干燥，得黄色固体（30mg,9%）。通过1hnmr、
13
cnmr和esi-ms进行表征。1hnmr（400mhz,methanol-d4）（如图5）δ7.94（d,j=16.4hz,1h）,7.84
–
7.76（m,2h）,7.33
–
7.25（m,2h）,7.21（d,j=16.4hz,1h）,6.60（dd,j=17.3,1.3hz,1h）,6.39（dd,j=17.3,10.4hz,1h）,6.10（dd,j=10.4,1.3hz,1h）,1.77（s,3h）。
43.13
cnmr（100mhz,methanol-d4）（如图6）δ169.9,164.1,160.5,153.0,144.6,132.7,132.5,129.5,127.3,122.3,116.1,114.1,113.3,110.9,93.4,24.9。
44.esi-ms（如图7）实验值m/z=376.1415（[c
20h14
n4o3]+nh4）+，理论值376.1485。
实施例2
[0045]
合成小分子近红外荧光探针bpin-h2o2。
[0046]
（1）htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙烯（2.5g,0.02mol）和2,3-丁二酮（3.2ml,0.04mol），加去离子水40ml搅拌均匀后，再缓慢加入0.5mol/l的naoh溶液500μl，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物。
[0047]
通过1hnmr、
13
cnmr进行表征。1hnmr（400mhz,methanol-d4）（如图1）δ2.27（s,3h）,1.54（s,3h）。
13
cnmr（100mhz,methanol-d4）（如图2）δ178.4,160.8,113.8,113.1,110.4,104.4,93.9,45.9,21.8,11.6。
[0048]
（2）探针bpin-h2o2的合成及表征：
取4-甲酰基苯硼酸频哪醇酯（232 mg, 1 mmol），htcp（200 mg, 1 mmol），乙酸铵（77 mg, 1mmol）置于圆底烧瓶中，加入5 ml的无水乙醇中，混合物在室温下搅拌6 h。反应完成后，通过柱色谱法纯化，使用二氯甲烷:甲醇（100:1, v/v）作为流动相进行洗脱，得到黄色固体（264 mg, 64%）。通过1h nmr、
13
c nmr和esi-ms进行表征。1h nmr（400 mhz, dmso-d6）（如图8） δ 10.64 （s, 1h）, 7.82 （s, 1h）, 7.81 （d, j = 3.8 hz, 2h）, 7.76 （d, j = 8.3 hz, 2h）, 7.23 （s, 1h）, 7.20 （d, j = 5.1 hz, 1h）, 1.71 （s, 3h）, 1.31 （s, 12h）。
13
c nmr （101 mhz, dmso-d6）（如图9） δ 170.5, 160.5, 145.3, 137.6, 135.6, 128.5, 117.6, 115.6, 114.3, 111.9, 101.6, 94.2, 84.4, 73.9, 45.1, 25.8, 25.4。esi-ms （如图10）实验值 m/z =432.2217 （[c
23h23
bn4o3]+nh4）+，理论值 432.2285。
实施例3
[0049]
（1）htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙烯（2.5g,0.02mol）和2,3-丁二酮（3.2ml,0.04mol），加去离子水40ml搅拌均匀后，再缓慢加入0.5mol/l的naoh溶液500μl，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物。
[0050]
通过1hnmr、
13
cnmr进行表征。1hnmr（400mhz,methanol-d4）（如图1）δ2.27（s,3h）,1.54（s,3h）。
13
cnmr（100mhz,methanol-d4）（如图2）δ178.4,160.8,113.8,113.1,110.4,104.4,93.9,45.9,21.8,11.6。
[0051]
（2）化合物3的合成：取对羟基苯甲醛（1 g, 8.2 mmol），4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯（4.8 g, 16.4 mmol），碳酸钾（2.3 g, 16.4 mmol）置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈15 ml，在80 ℃下回流7 h。反应完后用水和乙酸乙酯萃取，收集有机层浓缩之后得到化合物3。
[0052]
（3）探针phbpin-h2o2的合成及表征：取化合物3（338 mg, 1 mmol），htcp（200 mg, 1 mmol），乙酸铵（77 mg, 1 mmol）加入5 ml的无水乙醇中，混合物在室温下搅拌6 h。反应完成后，通过柱色谱法纯化，使用二氯甲烷/甲醇（100:1, v/v）作流动相进行洗脱，得到黄色固体（270 mg, 52%）。通过1h nmr、
13
c nmr和 esi-ms 进行表征。
[0053]1h nmr （400 mhz, dmso-d6）（如图11） δ 10.52 （s, 1h）, 7.84 （s, 1h）, 7.81
ꢀ–ꢀ
7.77 （m, 2h）, 7.70 （d, j = 7.6 hz, 2h）, 7.47 （d, j = 7.6 hz, 2h）, 7.17 （s, 1h）, 7.11 （d, j = 8.6 hz, 2h）, 7.03 （d, j = 16.4 hz, 1h）, 5.24 （s, 2h）, 1.69 （s, 3h）, 1.29 （s, 12h）。
13
c nmr （100 mhz, dmso-d6）（如图12） δ 171.3, 161.6, 160.8, 146.0, 140.3, 135.1, 131.4, 128.0, 127.3, 116.1, 115.8, 114.5, 114.4, 112.3, 99.2, 94.0, 84.1, 73.9, 69.7, 26.1, 25.1。esi-ms （如图13）实验值 m/z =538.2633 （[c
30h29
bn4o4]+nh4）+，理论值 538.4385。
实施例4
[0054]“off-on”荧光探针htcp-cys、小分子近红外荧光探针bpin-h2o2及小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2的应用：
储备液配制：（1）用dmso溶解探针htcp-cys配制为1 mm的储备液。半胱氨酸用蒸馏水配制为5 mm。各种干扰离子（na
+
, mg
2+
, co
32-, ch3coo-, hco
3-, c2o
42-, br-, s2o
32-, so
32-, ddt, nem）储备液用去离子水溶解并配制成10 mm。各种氨基酸（cys, asp, glu, ile, leu, thr, phe, ala, gly, hcy, gsh）储备液用去离子水溶解并配制成10 mm。
[0055]
（2）用etoh溶解探针bpin-h2o2配制为1 mm的储备液。30%的h2o2用pbs（10 mm, ph = 7.4）溶液配制为5 mm。各种干扰离子（ba
2+
, co
2+
, fe
3+
, pb
2+
, cu
2+
, mg
2+
, k
+
, zn
2+
, ca
2+
, c2o
42-, br-, so
32-）储备液用去离子水溶解并配制成3 mm。各种氨基酸（cys, ile, leu, gsh, phe, val）储备液用去离子水溶解并配制成10 mm。
[0056]
（3）用etoh溶解探针phbpin-h2o2配制为1 mm的储备液。30%的h2o2用pbs（10 mm, ph = 7.4）溶液配制为5 mm。各种干扰离子（ba
2+
, co
2+
, fe
3+
, pb
2+
, cu
2+
, mg
2+
, k
+
, zn
2+
, ca
2+
, so
32-）储备液用去离子水溶解并配制成3 mm。各种氨基酸（cys, ile, leu, gsh, phe, val）储备液用去离子水溶解并配制成10 mm。
[0057]
（1）在dmso/pbs（v/v = 1/10, 10 mm, ph = 7.4）溶液中将探针稀释至终浓度为10 μm。通过紫外可见分光光度计和荧光分光光度计测定探针htcp-cys响应半胱氨酸的能力。荧光测量激发波长为520 nm，狭缝调为10 nm/10 nm。
[0058]
（2）在etoh/pbs（v/v = 1/10, 10 mm, ph = 7.4）溶液中将探针稀释至终浓度为10 μm。通过紫外可见分光光度计和荧光分光光度计测定探针bpin-h2o2响应h2o2的能力。荧光测量激发波长为520 nm，狭缝调为10 nm/10 nm。
[0059]
（3）在etoh/pbs（v/v = 1/10, 10 mm, ph = 7.4）溶液中将探针稀释至终浓度为10 μm。通过紫外可见分光光度计和荧光分光光度计测定探针phbpin-h2o2响应h2o2的能力。荧光测量激发波长为520 nm，狭缝调为10 nm/10 nm。
实施例5
[0060]
探针htcp-cys的响应测试：首先通过紫外分光光度计测定探针htcp-cys与cys响应前后的吸收光谱。如图（14-a）所示，探针htcp-cys在389 nm 处显示有最大吸收且为单峰。加入cys（50 μm）后，389 nm的紫外吸收峰红移为434 nm 和551 nm的双峰，且吸收强度降低，因此确定该化合物有ict效应。随后用荧光分光光度计，以520 nm为激发波长，测定探针htcp-cys与cys响应前后的荧光光谱。如图（14-b）所示，未加入cys前，探针在615 nm处几乎无荧光信号，加入cys后，探针在615 nm处的荧光增强30倍，表明探针htcp-cys可以用于检测cys。在确定探针能与cys响应的基础上进一步考察了探针与cys响应的反应动力学。如图（14-c）所示，探针htcp-cys的荧光强度随着时间的增加而增强，然后在接近80 min时趋近于稳定，显示反应基本完全，表明探针具有较好的反应活性。
[0061]
探针htcp-cys的线性、选择性和检测限研究：配制0
–
30 μm的cys与探针进行荧光检测，发现在615 nm的荧光强度随cys浓度的增大而增强（如图15-a），且与cys浓度在0
–
12 μm范围内呈良好的线性关系（r2= 0.9905）（如图15-b），lod为40.36 nm。结果表明，探针htcp-cys可以在cys浓度较低的条件下对其进行定量检测。探针的特异性是影响探针实际应用中的重要因素。因此，我们进一步研究了探
针htcp-cys对cys的选择性，如图（15-c）所示，在相同的实验条件下，探针htcp-cys与cys反应后，615 nm处的荧光信号显著增强，而加入其他物质（cys, asp, glu, ile, leu, thr, phe, ala, gly, hcy, gsh, na
+
, mg
2+
, co
32-, ch3coo-, hco
3-, c2o
42-, br-, s2o
32-, so
32-, ddt, nem）后，荧光变化并不明显，图中还显示，探针对hcy和gsh产生的荧光信号较弱，这说明探针可以区分cys、hcy和gsh，表明htcp-cys对cys具有较高的特异性。
实施例6
[0062]
探针bpin-h2o2的响应测试：通过紫外分光光度计测定探针bpin-h2o2的吸收光谱。如图（16-a）所示，探针bpin-h2o2在389 nm处显示有最大吸收且为单峰。加入h2o
2 （100 μm）后，389 nm的紫外吸收峰红移至430 nm和550 nm的双峰，且吸收强度降低。因此确定该化合物有ict效应，随后使用荧光分光光度计，以520 nm为激发波长，对探针bpin-h2o2的响应性能进行探究。如图（16-b）所示，未加入h2o2前，探针在612 nm处几乎无荧光信号，加入h2o2后，探针在612 nm处的荧光增强11倍，因此探针bpin-h2o2可以用于检测h2o2。荧光探针的响应时间是一个重要的参数。因此，我们测量了探针bpin-h2o2与h2o2响应的动力学曲线。如图（16-c）所示，探针bpin-h2o2的荧光强度随着时间的增加而增强，在120 min时荧光强度趋近于稳定，表明探针已完全反应完。
[0063]
探针bpin-h2o2的线性、选择性和检测限研究：配制0
–
50 μm的h2o2与探针进行荧光检测，发现在612 nm的荧光强度随h2o2浓度的增大而增强（如图17-a），且与h2o2浓度在0
–
50 μm范围内呈良好的线性关系（r2= 0.9761）（如图17-b），lod为202.02 nm。结果表明，探针bpin-h2o2可以在h2o2浓度较低的条件下对其进行定量检测。探针的特异性是影响探针实际应用中的重要因素。因此，我们进一步研究了探针bpin-h2o2对h2o2的选择性，如图（17-c）所示，在相同的实验条件下，探针bpin-h2o2与h2o2反应后，612 nm处的荧光信号显著增强，而加入其他物质（cys, ile, leu, gsh, phe, val, ba
2+
, co
2+
, fe
3+
, pb
2+
, cu
2+
, mg
2+
, k
+
, zn
2+
, ca
2+
, c2o
42-, br-, so
32-）后，荧光变化并不明显。这表明探针bpin-h2o2对h2o2具有较高的特异性。
实施例7
[0064]
探针phbpin-h2o2的响应测试：通过紫外分光光度计测定探针phbpin-h2o2与h2o2响应前后的吸收光谱。如图（18-a）所示，探针phbpin-h2o2在422 nm处显示有最大吸收且为单峰。加入h2o2（100 μm）后，422 nm的紫外吸收峰红移至432 nm和550 nm的双峰，且吸收强度增强。因此确定该化合物有ict效应，随后使用荧光分光光度计，以520 nm为激发波长，对探针phbpin-h2o2的响应性能进行探究。如图（18-b）所示，未加入h2o2前，探针在612 nm处几乎无荧光信号，加入h2o2后，探针在612 nm处的荧光增强21倍，因此探针phbpin-h2o2可以用于检测h2o2。荧光探针的响应时间是一个重要的参数。因此，我们测量了探针phbpin-h2o2与h2o2响应的动力学曲线。如图（18-c）所示，探针phbpin-h2o2的荧光强度随着时间的增加而增强，在100 min时荧光强度趋近于稳定，表明探针已完全反应完。
[0065]
探针phbpin-h2o2的线性、选择性和检测限研究：
配制0
–
100 μm的h2o2与探针进行荧光检测，发现在612 nm的荧光强度随h2o2浓度的增大而增强（如图19-a），且与h2o2浓度在0
–
50 μm范围内呈良好的线性关系（r2= 0.9960）（如图19-b），lod为310.93 nm。结果表明，探针phbpin-h2o2可以在h2o2浓度较低的条件下对其进行定量检测。探针的特异性是影响探针实际应用中的重要因素。因此，我们进一步研究了探针phbpin-h2o2对h2o2的选择性，如图（19-c）所示，在相同的实验条件下，探针phbpin-h2o2与h2o2反应后，612 nm处的荧光信号显著增强，而加入其他物质（cys, ile, leu, gsh, phe, val, ba
2+
, co
2+
, fe
3+
, pb
2+
, cu
2+
, mg
2+
, k
+
, zn
2+
, ca
2+
, so
32-）后，荧光变化并不明显。这表明探针phbpin-h2o2对h2o2具有较高的特异性。
[0066]
本实施例中的所有技术特征均可根据实际需要而进行外观修改。
[0067]
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本技术方案构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种htcp荧光探针，其特征在于：基于htcp分别合成了“off-on”荧光探针htcp-cys、小分子近红外荧光探针bpin-h2o2及小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2；所述“off-on”荧光探针htcp-cys的具体合成方法如下：；所述小分子近红外荧光探针bpin-h2o2的具体合成方法如下：；所述小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2的具体合成方法如下：。2.根据权利要求1所述的一种htcp荧光探针，其特征在于：合成所述“off-on”荧光探针htcp-cys具体包括以下步骤：
s11，htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙和2,3-丁二酮，加去离子水搅拌均匀后，再缓慢加入naoh溶液，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物；通过1hnmr、
13
cnmr进行表征；s12，htcp中间体的合成及表征：向烧瓶中加入htcp，对羟基苯甲醛和乙酸铵，加入无水乙醇，置于磁力搅拌器上常温反应5h；反应完成后，在烧杯中加入大量石油醚，用吸管将反应液吸入石油醚中，重结晶析出橙红色结晶即为中间体；随后进行抽滤，干燥后得到纯净的中间体；通过1hnmr、
13
cnmr进行表征；s13，探针htcp-cys的合成及表征：向烧瓶中加入htcp中间体，用无水乙腈溶解后，于冰浴中加入三乙胺，溶液变为紫色；搅拌两分钟后加丙烯酰氯，溶液变黄且有大量白烟，反应15min后取出反应瓶，随后用硅胶柱层析进行纯化，以二氯甲烷/甲醇作流动相进行洗脱，用旋转蒸发仪去除洗脱剂，真空干燥，得黄色固体；通过1hnmr、
13
cnmr和esi-ms进行表征。3.根据权利要求1所述的一种htcp荧光探针，其特征在于：合成所述小分子近红外荧光探针bpin-h2o2具体包括以下步骤：s21，htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙和2,3-丁二酮，加去离子水搅拌均匀后，再缓慢加入naoh溶液，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物；通过1hnmr、
13
cnmr进行表征；s22，探针bpin-h2o2的合成及表征：取4-甲酰基苯硼酸频哪醇酯，htcp，乙酸铵置于圆底烧瓶中，加入的无水乙醇中，混合物在室温下搅拌6h；反应完成后，通过柱色谱法纯化，使用二氯甲烷/甲醇作为流动相进行洗脱，得到黄色固体；通过1hnmr、
13
cnmr和esi-ms进行表征。4.根据权利要求1所述的一种htcp荧光探针，其特征在于：合成所述小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2具体包括以下步骤：s31，htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙和2,3-丁二酮，加去离子水搅拌均匀后，再缓慢加入naoh溶液，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物；通过1hnmr、
13
cnmr进行表征；s32，化合物3的合成：取对羟基苯甲醛，4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，碳酸钾置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈，在80℃下回流7h；反应完后用水和乙酸乙酯萃取，收集有机层浓缩之后得到化合物3；s33，取化合物3，htcp，乙酸铵加入无水乙醇中，混合物在室温下搅拌6h，反应完成后，通过柱色谱法纯化，使用二氯甲烷/甲醇作流动相进行洗脱，得到黄色固体；通过1hnmr、
13
cnmr和esi-ms进行表征。5.上述权利要求1-4任意一项所述的一种htcp荧光探针的用途，其特征在于：基于htcp的“off-on”荧光探针htcp-cys应用于半胱氨酸的检测；基于htcp的小分子近红外荧光探针bpin-h2o2应用于h2o2的检测；基于htcp的小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2应用于h2o2的检测。

技术总结
本发明涉及物质定量检测技术领域，尤其是指一种HTCP荧光探针及其用途，基于HTCP分别合成了“OFF-ON”荧光探针HTCP-Cys、小分子近红外荧光探针Bpin-H2O2及小分子近红外荧光探针PhBpin-H2O2。基于HTCP的“OFF-ON”荧光探针HTCP-Cys应用于半胱氨酸的检测；基于HTCP的小分子近红外荧光探针Bpin-H2O2应用于H2O2的检测；基于HTCP的小分子近红外荧光探针PhBpin-H2O2应用于H2O2的检测。本发明基于分子内电荷转移（ICT）机制设计合成了三种以HTCP为受体的荧光探针，各探针对其分析物均具有较高的选择性和灵敏度；初步验证了探针的光学性质及其识别性能，为氧化还原性物质的定量测定和浓度监测提供了新的途径。测提供了新的途径。测提供了新的途径。


技术研发人员：张天行 张二伟 汪文修 梁慧敏
受保护的技术使用者：内蒙古工业大学
技术研发日：2023.08.14
技术公布日：2023/9/19