HPV检测引物组、试剂盒及其应用的制作方法

hpv检测引物组、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及hpv病毒检测技术领域，尤其涉及hpv检测引物组、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.宫颈癌（cevical cancer，cc）是女性最常见的癌症之一，而人乳头瘤病毒（human papillomavirus，hpv）的持续感染是宫颈癌的主要危险因素之一。hpv是一种无包膜双链环状dna病毒，属于乳头瘤病毒科，有核心单拷贝的病毒基因组dna及病毒蛋白衣壳构成。目前发现的hpv约有200种型别，分为高危型和低危型，其中高危型hpv（high-risk hpv，hr-hpv）感染被认为是宫颈癌发病机制中最主要的因素。全世界传播的hr-hpv包括hpv16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82。
3.宫颈癌发病率和致死率较高，究其原因，是宫颈癌隐匿性较高，其通常在晚期才被发现，据统计全世界仍有近50%的患者诊断为局部晚期，但宫颈癌预防性筛查在发展中国家并未普及，造成宫颈癌发病率和致死率居高不下。who于2021年发布的宫颈癌筛查指南推荐hpv-dna检测作为宫颈癌筛查的首选筛查方法。因此，发展基于hpv-dna的宫颈癌快捷筛查方法，特别是针对hr-hpv的识别，将宫颈病变的高危人群筛查出来，有助于个性化早筛早诊，对于提示宫颈癌风险，从而降低宫颈癌发病率和致死率具有重要意义。
4.传统的hpv的检测手段，如细胞学检测和镜检，存在场所（专业实验室）和人员（专业检测人员）的限制，且检测所需时间较长，不利于hpv筛查的推广。
5.现有技术中针对hpv的检测主要使用荧光定量pcr技术，其依赖于特定荧光仪器和专业人员的操作，不利于检测的推广和便捷化。并且现有产品存在灵敏度和特异性不高的问题，如专利cn112575123a，其检测灵敏度约1.25e+05 copies/ml，也可能会受其他病原体的干扰，在实际中可能导致出现漏检或假阳性现象。因此，hpv病毒检测的准确程度还需改进；另外，中国专利cn114107560a公开了一种使用lamp技术进行hpv检测的引物组合及试剂盒，但其分别使用荧光法和染色体显色法进行检测，仍存在仪器要求高（荧光法）、在低浓度下判读困难及易出现假阴性（染色体显色法）的缺陷。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供hpv检测引物组，利用该引物组可对hpv进行检测，且灵敏度高；同时，本发明提供了含有该引物组的试剂盒，使用该试剂盒可实现对hpv的居家检测。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了hpv检测引物组，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.1所示的引物hpv16 f3；核苷酸序列如seq id no.2所示的引物hpv16 fip；核苷酸序列如seq id no.3所示的引物hpv16 lf；核苷酸序列如seq id no.4所示的引物hpv16 bip；核苷酸序列如seq id no.5所示的引物hpv16 lb；
核苷酸序列如seq id no.6所示的引物hpv16 b3；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.7所示的引物hpv18 f3；核苷酸序列如seq id no.8所示的引物hpv18 fip；核苷酸序列如seq id no.9所示的引物hpv18 lf；核苷酸序列如seq id no.10所示的引物hpv18 bip；核苷酸序列如seq id no.11所示的引物hpv18 lb；核苷酸序列如seq id no.12所示的引物hpv18 b3；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.13所示的引物hpv33 f3；核苷酸序列如seq id no.14所示的引物hpv33 fip；核苷酸序列如seq id no.15所示的引物hpv33 lf；核苷酸序列如seq id no.16所示的引物hpv33 bip；核苷酸序列如seq id no.17所示的引物hpv33 b3；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.18所示的引物hpv52 f3；核苷酸序列如seq id no.19所示的引物hpv52 fip；核苷酸序列如seq id no.20所示的引物hpv52 bip；核苷酸序列如seq id no.21所示的引物hpv52 lb；核苷酸序列如seq id no.22所示的引物hpv52 b3；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.23所示的引物hpv58 f3；核苷酸序列如seq id no.24所示的引物hpv58 fip；核苷酸序列如seq id no.25所示的引物hpv58 bip；核苷酸序列如seq id no.26所示的引物hpv58 lb；核苷酸序列如seq id no.27所示的引物hpv58 b3；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：具有seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列经删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：具有seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列经核苷酸取代或修饰，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列具有80%以上同源性或与与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列功能相似的衍生引物；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列互补的引物。
8.优选的，所述hpv16 bip引物的5’端标记有荧光基团；所述hpv16 lf引物的5’端标记有生物素；
所述hpv18 fip引物的5’端标记有荧光基团；所述hpv18 lf引物的5’端标记有生物素；所述引物hpv33 lf的5’端标记有荧光基团；所述引物hpv33 bip的5’端标记有生物素；所述引物hpv52 bip的5’端标记有荧光基团；所述引物hpv52 lb的5’端标记有生物素；所述引物hpv58 bip的5’端标记有荧光基团；所述引物hpv58 lb的5’端标记有生物素。
9.优选的，所述荧光基团为fam或fitc。
10.本发明还提供了上述hpv检测引物组在制备检测试剂盒中的应用。
11.优选的，所述hpv的分型包括hpv16、hpv18、hpv33、hpv52和hpv58中的一种或几种。
12.本发明还提供了一种检测hpv的试剂盒，包括上述hpv检测引物组和检测试剂。
13.优选的，所述试剂盒中引物hpv16 fip、引物hpv16 bip、引物hpv18 fip、引物hpv18 bip、引物hpv33 fip、引物hpv33 bip、引物hpv52 fip、引物hpv52 bip、引物hpv58 fip或引物hpv58 bip的终浓度独立的为1.6~2.4μmol/l。
14.优选的，所述检测试剂包括等温扩增缓冲液、dntp和bst dna聚合酶。
15.优选的，所述等温扩增缓冲液包括tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4和tween-20。
16.优选的，所述试剂盒还包括胶体金免疫层析试纸条，所述胶体金免疫层析试纸条包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫设置于底板上；所述判读区上设置检测线和质控线；所述检测线中包被有fam抗体，fam抗体的浓度为0.05~0.15mg/ml；所述质控线中包被有biotin-bsa溶液，所述biotin-bsa溶液的浓度为1.5~3mg/ml。
17.本发明的技术效果和优点：1、本发明组合灵敏度高，检测限低至500 copies/ml，有助于hpv16、hpv18、hpv33、hpv52、hpv58病毒感染的早筛早诊，便于及时进行干预治疗和控制病情；2、本发明组合使用恒温扩增-核酸胶体金层析法，可在35min内完成检测反应，结果判断简便；3、本发明组合使用恒温扩增-核酸胶体金层析法，仪器设备要求低，适用于基层医疗单位，具有发展为居家自测的潜力，同时保持了检测的低成本化，有助于宫颈癌的早筛早诊。
18.4、lamp技术在配合相应的样本核酸释放剂时，可适用于居家自测，在降低检测费用的同时也有效提高了检测的便利性，对于hpv的早筛早诊、降低宫颈癌的发病率和致死率具有重要意义。
附图说明
19.图1为hpv16检测试剂盒的一致性测试结果；图2为hpv18检测试剂盒的一致性测试结果；图3为hpv33检测试剂盒的一致性测试结果；
图4为hpv52检测试剂盒的一致性测试结果；图5为hpv58检测试剂盒的一致性测试结果；图6为hpv16检测试剂盒的特异性测试结果；图7为hpv18检测试剂盒的特异性测试结果；图8为hpv33检测试剂盒的特异性测试结果；图9为hpv52检测试剂盒的特异性测试结果；图10为hpv58检测试剂盒的特异性测试结果。
具体实施方式
20.本发明提供了hpv检测引物组，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.1所示的引物hpv16 f3；核苷酸序列如seq id no.2所示的引物hpv16 fip；核苷酸序列如seq id no.3所示的引物hpv16 lf；核苷酸序列如seq id no.4所示的引物hpv16 bip；核苷酸序列如seq id no.5所示的引物hpv16 lb；核苷酸序列如seq id no.6所示的引物hpv16 b3，所述引物组的靶标为l2基因cds区域的第138-353位核酸序列；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.7所示的引物hpv18 f3；核苷酸序列如seq id no.8所示的引物hpv18 fip；核苷酸序列如seq id no.9所示的引物hpv18 lf；核苷酸序列如seq id no.10所示的引物hpv18 bip；核苷酸序列如seq id no.11所示的引物hpv18 lb；核苷酸序列如seq id no.12所示的引物hpv18 b3，所述引物组的靶标为l1基因cds区域的第568-769位核酸序列；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.13所示的引物hpv33 f3；核苷酸序列如seq id no.14所示的引物hpv33 fip；核苷酸序列如seq id no.15所示的引物hpv33 lf；核苷酸序列如seq id no.16所示的引物hpv33 bip；核苷酸序列如seq id no.17所示的引物hpv33 b3，所述引物组的靶标为l2基因上cds区域中第441-634位核酸序列；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.18所示的引物hpv52 f3；核苷酸序列如seq id no.19所示的引物hpv52 fip；核苷酸序列如seq id no.20所示的引物hpv52 bip；核苷酸序列如seq id no.21所示的引物hpv52 lb；核苷酸序列如seq id no.22所示的引物hpv52 b3，所述引物组的靶标为l2基因上cds区域中第252-462位核酸序列；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.23所示的引物hpv58 f3；核苷酸序列如seq id no.24所示的引物hpv58 fip；核苷酸序列如seq id no.25所示的引物hpv58 bip；核苷酸序列如seq id no.26所示的引物hpv58 lb；核苷酸序列如seq id no.27所示的引物hpv58 b3，所述引物组的靶标为l2基因上cds区域中第1058-1268位核酸序列；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：具有seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列经删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；
和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：具有seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列经核苷酸取代或修饰，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列具有80%以上同源性或与与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列功能相似的衍生引物；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列互补的引物。
21.所述hpv16 bip引物的5’端优选标记有荧光基团；所述hpv16 lf引物的5’端优选标记有生物素；所述hpv18 fip引物的5’端优选标记有荧光基团；所述hpv18 lf引物的5’端优选标记有生物素；所述引物hpv33 lf的5’端优选标记有荧光基团；所述引物hpv33 bip的5’端优选标记有生物素；所述引物hpv52 bip的5’端优选标记有荧光基团；所述引物hpv52 lb的5’端优选标记有生物素；所述引物hpv58 bip的5’端优选标记有荧光基团；所述引物hpv58 lb的5’端优选标记有生物素；所述荧光基团优选为fam或fitc。
22.本发明还提供了上述hpv检测引物组在制备检测试剂盒中的应用，所述hpv的分型优选包括hpv16、hpv18、hpv33、hpv52和/或hpv58。
23.本发明还提供了一种检测hpv的试剂盒，包括上述hpv检测引物组和检测试剂，所述试剂盒中引物hpv16 fip、引物hpv16 bip、引物hpv18 fip、引物hpv18 bip、引物hpv33 fip、引物hpv33 bip、引物hpv52 fip、引物hpv52 bip、引物hpv58 fip或引物hpv58 bip的终浓度独立的优选为1.6~2.4μmol/l。
24.在本发明中，所述检测试剂优选包括等温扩增缓冲液、dntp和bst dna聚合酶，所述等温扩增缓冲液优选包括tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4和tween-20，所述试剂盒中tris-hcl的浓度优选为15~18mmol/l，进一步优选为16~17mmol/l；所述试剂盒中(nh4)2so4的终浓度优选为7~9mmol/l，进一步优选为7.5~8.5mmol/l，所述试剂盒中kcl的终浓度优选为11~13mmol/l，进一步优选为11.5~12.5mmol/l，所述试剂盒中mgso4的终浓度优选为1~3mmol/l，进一步优选为1.5~2.5mmol/l，所述试剂盒中tween-20的终浓度优选为0.06~0.1%，进一步优选为0.07~0.09%，所述试剂盒中dntp的终浓度优选为0.55~0.65mmol/l，进一步优选为0.58~0.62mmol/l，所述试剂盒中bst dna聚合酶的终酶活优选为0.2~0.3u，进一步优选为0.24~0.28u。
25.在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括以下步骤：
①
采用基因组dna提取试剂盒提取待测样品的dna；
②
试剂配置：取1.5ml离心管(dnase/rnase-free，灭菌)配制反应体系，将等温扩增pcr反应液和引物混合液加入后，涡旋振荡10秒，离心待用，20μl/管分装至pcr反应管中（无菌和dnase/rnase-free）；
③
加样：将提取的核酸转移10μl到每个pcr反应管中，盖紧管盖、离心、转移至pcr检测区；
④
pcr扩增：将pcr反应管放入等温扩增的样品槽中，60℃反应30min，得到样本扩增产物，测定样本扩增产物是否含有hpv16病毒l2基因cds区域的第138-353位核酸序列、hpv18病毒l1基因cds区域的第568-769位核酸序列、hpv33病毒l2基因上cds区域中第441-634位核酸序列、hpv52病毒l2基因上cds区域中第252-462位核酸序列或hpv58病毒l2基因上cds区域中第1058-1268位核酸序列，即可得知样品中是否含有hpv病毒。
26.在本发明中，所述试剂盒还优选包括胶体金免疫层析试纸条，所述胶体金免疫层析试纸条优选包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫设置于底板上；所述判读区上设置检测线（t线）和质控线（c线），所述检测线中包被有fam抗体，fam抗体的浓度优选为0.05~0.15mg/ml，所述fam抗体优选为兔抗；所述质控线中包被有biotin-bsa溶液，所述biotin-bsa溶液的浓度为1.5~3mg/ml。
27.在本发明中，所述胶体金免疫层析试纸条的使用方法优选包括以下步骤：使用移液器取20μl样本扩增产物至试纸条样本垫区域中，再加入80~120μl层析缓冲液，2~3min内读取结果，判断试纸条检测结果的标准如下：c线出现红色线，同时t线出现红色线，说明被检样品为阳性；c线出现红色线，同时t线没有出现红色线，说明被检样品为阴性；c线没有出现红色线，说明试纸条失效。
28.在本发明中，所述胶体金免疫层析试纸条的检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上c线包被biotin-bsa，t线包被兔抗fam抗体；同时带有fitc/fam和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的t线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至c线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
29.本试剂盒还配置有常规的dna提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
30.上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
31.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
32.实施例1 引物设计与合成本实施例选择hpv16病毒基因组中l2基因cds区域的第138-353位作为检测hpv16的特异性检测靶标，并根据靶标区域序列设计筛选引物：hpv16 f3引物：5
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acaatatggaagtatgggtgta-3’，如seq id no.1所示，位置为l2基因中cds区域上第138-159位；hpv16 fip引物：5
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caatggaatatacccagtgcgtctttggtgggttaggaattgg-3’，如seq id no.2所示，包含两个在cds上相间隔的片段，分别位于cds区域上第163-182和第203-225位；hpv16 lf引物：5
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cctgtacccgaccctgtt-3’，如seq id no.3所示，位于cds区域第183-200位；hpv16 bip引物：5
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cctcccacagctacagatacaagaaggatcagaagggcc-3’，如seq id no.4所示，由位于cds区域上第235-255和第295-312位的两段序列相连接组成；hpv16 lb引物：5
’‑
ctcctgtaagaccccctttaacagt-3’，如seq id no.5所示，位于cds区域上第260-284位；hpv16 b3引物：5
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ccagcatcaataaaactagtttct-3’，如seq id no.6所示，位于cds
569位和第590-611位；b3引物：5
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atgttacattactactgtctgtg-3’，如seq id no.17所示，位于cds区域上第612-634位。
37.其中，fip引物 5’端标记有fam基团，lf引物 5’端标记有生物素。
38.实施例6 引物设计与合成与实施例1的不同之处仅在于，修饰方案采用：fip引物 5’端标记有fitc基团，lf引物 5’端标记有生物素。
39.实施例7 引物设计与合成以hpv52病毒基因组中l2基因cds区域的第252-462位作为检测hpv52的特异性检测靶标，并根据靶标区域序列设计筛选引物：f3引物：5
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cacgtccactattcgtcc-3’，如seq id no.18所示，位置为l2基因cds区域上第252-269位；fip引物：5
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cgccagactcaataaatgttgtttcgtagaacccattggtccct-3’，如seq id no.19所示，由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第280-298和第328-352位；bip引物：5
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ctgctccatctattccatcagcgatgttacattaattattgcaggag-3’，如seq id no.20所示，同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第356-377位和第413-437位；lb引物：5
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cagggtttgatgttacaacatctgc-3’，如seq id no.21所示，位于cds区域第380-404位；b3引物：5
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tgattgtacagatgattcaccta-3’，如seq id no.22所示，位于cds区域上第440-462位。
40.其中，bip引物 5’端标记有fam基团，lb引物 5’端标记有生物素。
41.实施例8 引物设计与合成与实施例1的不同之处仅在于，修饰方案采用：bip引物 5’端标记有fitc基团，bf引物 5’端标记有生物素。
42.实施例9 引物设计与合成以hpv58病毒基因组中l2基因cds区域的第1058-1268位作为检测hpv58的特异性检测靶标，并根据靶标区域序列设计筛选引物：f3引物：5
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tttctccctatagtattaatgatgg-3’，如seq id no.23所示，位置为l2基因cds区域上第1058-1082位；fip引物：5
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tggcaaaggaggtatgtgagtgacgatgctgatactatacatga-3’，如seq id no.24所示，由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第1102-1124和第1142-1162位；bip引物：5
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ccacacgtaccagtaatgtgtccaatgtctggaccaggttc-3’，如seq id no.25所示，同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第1163-1185位和第1228-1245位；lb引物：5
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actggatttgacactcctcttgt-3’，如seq id no.26所示，位于cds区域第1198-1220位；
b3引物：5
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gacatagatgttacagaagatgt-3’，如seq id no.27所示，位于cds区域上第1246-1268位。
43.其中，bip引物 5’端标记有fam基团，lb引物 5’端标记有生物素。
44.实施例10 引物设计与合成与实施例1的不同之处仅在于，修饰方案采用：bip引物 5’端标记有fitc基团，bf引物 5’端标记有生物素。
45.实施例11 检测试剂盒的制备1）采用实施例1中得到的引物组配制混合液，各引物浓度为：hpv16 f3 0.2μmol/l；hpv16 fip 1.6μmol/l；hpv16 lf 0.67μmol/l；hpv16 bip 1.6μmol/l；hpv16 b3 0.2μmol/l；hpv16 lb 0.67μmol/l。
46.2) 配制环介导等温扩增反应液，各组分的含量为：dntp 0.58mmol/l；tris-hcl 16.67mmol/l；(nh4)2so48.33mmol/l；kcl 12.5mmol/l；mgso41.67mmol/l；tween-20 0.08%；bst聚合酶 0.27u/l。
47.3）制备检测卡（可选用江苏猎阵，hdu01），检测卡包括试纸条和外壳；试纸条的结构包括样品垫、判读区和吸水垫；判读区包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为pvc板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有c线（质控线）和t线（检测线），其中c线区包被有biotin-bsa溶液，t线区包被有兔抗fam抗体。所述biotin-bsa溶液的浓度为1.5-3mg/ml，兔抗fam抗体的浓度为0.05-0.15mg/ml。把试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
48.其检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上c线包被biotin-bsa，t线包被兔抗fam抗体；同时带有fitc/fam和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的t线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至c线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
49.4）本试剂盒还配置有常规的dna提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
50.上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
51.实施例12 检测试剂盒的制备1）采用实施例3中得到的引物组配制混合液，各引物浓度为：hpv18 f3 0.2μmol/l；hpv18 fip 1.6μmol/l；hpv18 lf 0.67μmol/l；hpv18 bip 1.6μmol/l；hpv18 b3 0.2μmol/l；hpv18 lb 0.67μmol/l。
52.2) 配制环介导等温扩增反应液，各组分的含量为：dntp 0.58mmol/l；tris-hcl 16.67mmol/l；(nh4)2so48.33mmol/l；kcl 12.5mmol/l；mgso41.67mmol/l；tween-20 0.08%；bst聚合酶 0.27u/l。
53.3）制备检测卡（可选用江苏猎阵，hdu01），检测卡包括试纸条和外壳；
试纸条的结构包括样品垫、判读区和吸水垫；判读区包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为pvc板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有c线（质控线）和t线（检测线），其中c线区包被有biotin-bsa溶液，t线区包被有兔抗fam抗体。所述biotin-bsa溶液的浓度为1.5-3mg/ml，兔抗fam抗体的浓度为0.05-0.15mg/ml。把试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
54.其检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上c线包被biotin-bsa，t线包被兔抗fam抗体；同时带有fitc/fam和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的t线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至c线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
55.4）本试剂盒还配置有常规的dna提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
56.上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
57.实施例13 检测试剂盒的制备1）采用实施例5中得到的引物组配制混合液，各引物浓度为：hpv33 f3 0.2μmol/l；hpv33 fip 1.6μmol/l；hpv33 lf 0.67μmol/l；hpv33 bip 1.6μmol/l；hpv33 b3 0.2μmol/l。
58.2) 配制环介导等温扩增反应液，各组分的含量为：dntp 0.58mmol/l；tris-hcl 16.67mmol/l；(nh4)2so48.33mmol/l；kcl 12.5mmol/l；mgso41.67mmol/l；tween-20 0.08%；bst聚合酶 0.27u/l。
59.3）制备检测卡（可选用江苏猎阵，hdu01），检测卡包括试纸条和外壳；试纸条的结构包括样品垫、判读区和吸水垫；判读区包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为pvc板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有c线（质控线）和t线（检测线），其中c线区包被有biotin-bsa溶液，t线区包被有兔抗fam抗体。所述biotin-bsa溶液的浓度为1.5-3mg/ml，兔抗fam抗体的浓度为0.05-0.15mg/ml。把试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
60.其检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上c线包被biotin-bsa，t线包被兔抗fam抗体；同时带有fitc/fam和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的t线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至c线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
61.4）本试剂盒还配置有常规的dna提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管
和反应管各五支以上。
62.上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
63.实施例14 检测试剂盒的制备1）采用实施例7中得到的引物组配制混合液，各引物浓度为：hpv52 f3 0.2μmol/l；hpv52 fip 1.6μmol/l；hpv52 bip 1.6μmol/l；hpv52 b3 0.2μmol/l；hpv52 lb 0.67μmol/l。
64.2) 配制环介导等温扩增反应液，各组分的含量为：dntp 0.58mmol/l；tris-hcl 16.67mmol/l；(nh4)2so48.33mmol/l；kcl 12.5mmol/l；mgso41.67mmol/l；tween-20 0.08%；bst聚合酶 0.27u/l。
65.3）制备检测卡（可选用江苏猎阵，hdu01），检测卡包括试纸条和外壳；试纸条的结构包括样品垫、判读区和吸水垫；判读区包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为pvc板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有c线（质控线）和t线（检测线），其中c线区包被有biotin-bsa溶液，t线区包被有兔抗fam抗体。所述biotin-bsa溶液的浓度为1.5-3mg/ml，兔抗fam抗体的浓度为0.05-0.15mg/ml。把试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
66.其检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上c线包被biotin-bsa，t线包被兔抗fam抗体；同时带有fitc/fam和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的t线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至c线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
67.4）本试剂盒还配置有常规的dna提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
68.上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
69.实施例15 检测试剂盒的制备1）采用实施例9中得到的引物组配制混合液，各引物浓度为：hpv58 f3引物：0.2μmol/l；hpv58 fip引物：1.6μmol/l；hpv58 bip引物：1.6μmol/l；hpv58 lb引物：0.67μmol/l；hpv58 b3引物：0.2μmol/l。
70.2) 配制环介导等温扩增反应液，各组分的含量为：dntp 0.58mmol/l；tris-hcl 16.67mmol/l；(nh4)2so48.33mmol/l；kcl 12.5mmol/l；mgso41.67mmol/l；tween-20 0.08%；bst聚合酶 0.27u/l。
71.3）制备检测卡（可选用江苏猎阵，hdu01），检测卡包括试纸条和外壳；试纸条的结构包括样品垫、判读区和吸水垫；判读区包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为pvc板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的
示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有c线（质控线）和t线（检测线），其中c线区包被有biotin-bsa溶液，t线区包被有兔抗fam抗体。所述biotin-bsa溶液的浓度为1.5-3mg/ml，兔抗fam抗体的浓度为0.05-0.15mg/ml。把试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
72.其检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上c线包被biotin-bsa，t线包被兔抗fam抗体；同时带有fitc/fam和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的t线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至c线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
73.4）本试剂盒还配置有常规的dna提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
74.上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
75.实验例1 hpv的检测过程1. 取患者宫颈液，采用基因组dna提取试剂盒提取，得到待测样品的dna；2. 试剂配置：取环介导等温扩增反应液和引物混合液，在离心管中混合，涡旋振荡摇匀，取20μl/管分装至pcr反应管中；3. 加样：将待测样品的dna 溶液10μl转移到上述pcr反应管中；4. pcr扩增：将pcr反应管放入等温扩增的样品槽中，60℃反应30min，居家检测可采用家庭内任意常规恒温设备或方法保持60℃恒温。
76.5. 准备检测卡：将检测卡从铝箔袋中取出，放置于干燥的水平台面上。
77.6. 加样检测：移取20μl样本扩增产物至检测卡的加样孔中，再加入80-120μl层析缓冲液，2-3min内读取结果。
78.7. 检测及结果判定：结果判定标准：c线出现红色的线，同时t线出现红色的线，说明待测样品为hpv16阳性；c线出现红色的线，同时t线没有出现红色的线，说明待测样品为hpv16阴性；c线没有出现红色的线，说明检测卡失效。
79.利用实施例11中的试剂盒，采用上述方法hpv16参考品进行验证检测，hpv16样本的浓度约为5000 copies/ml，重复检测10次，检测结果如图1所示。由图1可以看出，10次检测的结果均为hpv16阳性，且显色均一，表明本发明提供的引物组具有良好的检测一致性。
80.利用实施例12中的试剂盒，采用上述方法hpv18参考品进行验证检测，hpv18样本的浓度约为2500 copies/ml，重复检测10次，检测结果如图2所示。由图2可以看出，10次检测的结果均为hpv18阳性，且显色均一，表明本发明提供的引物组具有良好的检测一致性。
81.利用实施例13中的试剂盒，采用上述方法hpv33参考品进行验证检测，hpv33样本的浓度约为5000 copies/ml，重复检测10次，检测结果如图3所示。由图3可以看出，10次检测的结果均为hpv33阳性，且显色均一，表明本发明提供的引物组具有良好的检测一致性。
82.利用实施例14中的试剂盒，采用上述方法hpv52参考品进行验证检测，hpv52样本
的浓度约为5000 copies/ml，重复检测10次，检测结果如图4所示。由图4可以看出，10次检测的结果均为hpv52阳性，且显色均一，表明本发明提供的引物组具有良好的检测一致性。
83.利用实施例15中的试剂盒，采用上述方法hpv58参考品进行验证检测，hpv58样本的浓度约为5000 copies/ml，重复检测10次，检测结果如图5所示。由图5可以看出，10次检测的结果均为hpv58阳性，且显色均一，表明本发明提供的引物组具有良好的检测一致性。
84.实验例2 灵敏度测试hpv16病毒检测试剂盒的检测灵敏度：将hpv16病毒制备成浓度为2500 copies/ml、1000 copies/ml、500 copies/ml、250 copies/ml和100 copies/ml的待测样本，采用实施例11的试剂盒对每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如下表1所示：表1 hpv16病毒检测限检测结果结果如表1所示，2500 copies/ml、1000 copies/ml和500 copies/ml浓度样本全部检出，250 copies/ml和100 copies/ml浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂，对于hpv16的检出限为500 copies/ml，灵敏度较高，可以用于hpv16核酸检测的试剂盒。
85.hpv18病毒检测试剂盒的检测灵敏度：将hpv18病毒制备成浓度为2500 copies/ml、1000 copies/ml、500 copies/ml、250 copies/ml和100 copies/ml的待测样本，采用实施例12的试剂盒对每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如下表2所示：表2 hpv18病毒检测限检测结果
结果如表2所示，2500 copies/ml、1000 copies/ml和500 copies/ml浓度样本全部检出，250 copies/ml和100 copies/ml浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂，对于hpv18的检出限为500 copies/ml，灵敏度较高，可以用于hpv18核酸检测的试剂盒。
86.将hpv33病毒制备成浓度为2500 copies/ml、1000 copies/ml、500 copies/ml、250 copies/ml和100 copies/ml的待测样本，采用实施例13的试剂盒对每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如表3所示（“+”为阳性，
“‑”
为阴性）：表3 检测限检测结果
由表3可知，2500 copies/ml、1000 copies/ml和500 copies/ml浓度样本全部检出，250 copies/ml和100 copies/ml浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂，对于hpv33的检出限为500 copies/ml，灵敏度较高，可以用于hpv33核酸检测的试剂盒。
87.将hpv52病毒制备成浓度为2500 copies/ml、1000 copies/ml、500 copies/ml、250 copies/ml和100 copies/ml的待测样本，采用实施例14的试剂盒对每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如表4所示（“+”为阳性，
“‑”
为阴性）：表4 检测限检测结果
由表4可知，2500 copies/ml、1000 copies/ml和500 copies/ml浓度样本全部检出，250 copies/ml和100 copies/ml浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂，对于hpv52的检出限为500 copies/ml，灵敏度较高，可以用于hpv52核酸检测的试剂盒。
88.将hpv58病毒制备成浓度为2500 copies/ml、1000 copies/ml、500 copies/ml、250 copies/ml和100 copies/ml的待测样本，采用实施例15的试剂盒对每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如表5所示（“+”为阳性，
“‑”
为阴性）：表5 检测限检测结果由表5可知，2500 copies/ml、1000 copies/ml和500 copies/ml浓度样本全部检
出，250 copies/ml和100 copies/ml浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂，对于hpv58的检出限为500 copies/ml，灵敏度较高，可以用于hpv58核酸检测的试剂盒。
89.实验例3 特异性测试选取13例hr-hpv型别（hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）、1例白色念珠菌（candida albicans，ca；购自美国atcc保藏中心，no.atcc 10231）、1例阴道毛滴虫（trichomonas vaginalis，tv；购自美国atcc保藏中心，no.atcc 30184）和1例加德纳菌（gardnerella vaginalis，gv；购自美国atcc保藏中心，no.atcc 14018），共16例样本进行特异性检测，各待测样本的浓度为2500copies/ml，分别采用实施例11~15中的试剂盒进行检测，检测方法同实验例1，检测结果如图6~10所示。
90.由图6可知，采用实施例11中的试剂盒对13例hr-hpv样本的检测结果中，仅hpv16为阳性，其余型别皆为阴性，1例白色念珠菌、1例阴道毛滴虫和1例加德纳菌的检测结果均为阴性，说明本发明提供的试剂盒可以排除不同病原体的干扰，精准检测出hpv16。
91.由图7可知，采用实施例12中的试剂盒对13例hr-hpv样本的检测结果中，仅hpv18为阳性，其余型别皆为阴性，1例白色念珠菌、1例阴道毛滴虫和1例加德纳菌的检测结果均为阴性，说明本发明提供的试剂盒可以排除不同病原体的干扰，精准检测出hpv18。
92.由图8可知，采用实施例13中的试剂盒对13例hr-hpv样本的检测结果中，仅hpv33为阳性，其余型别皆为阴性，1例白色念珠菌、1例阴道毛滴虫和1例加德纳菌的检测结果均为阴性，说明本发明提供的试剂盒可以排除不同病原体的干扰，精准检测出hpv33。
93.由图9可知，采用实施例14中的试剂盒对13例hr-hpv样本的检测结果中，仅hpv52为阳性，其余型别皆为阴性，1例白色念珠菌、1例阴道毛滴虫和1例加德纳菌的检测结果均为阴性，说明本发明提供的试剂盒可以排除不同病原体的干扰，精准检测出hpv52。
94.由图10可知，采用实施例15中的试剂盒对13例hr-hpv样本的检测结果中，仅hpv58为阳性，其余型别皆为阴性，1例白色念珠菌、1例阴道毛滴虫和1例加德纳菌的检测结果均为阴性，说明本发明提供的试剂盒可以排除不同病原体的干扰，精准检测出hpv58。
95.实验例4 引物组合对比实验引物组合（核酸序列和修饰方式）是影响核酸检测平台检测能力的关键性因素，要求所用引物组合具有较高的特异性和灵敏度，故优选引物组合尤为重要。在本发明试剂盒的研发阶段，分别进行了不同引物组合的比较和不同修饰位点的比较。
96.针对hpv16，本发明设计了以下备选引物：hpv16备选引物组合1选择位于l2基因cds区域第176-395位序列设计引物，具体地：hpv16 f3-1引物的位置为l2基因cds区域上第176-193位，序列为：gaattggaacagggtcgg，如seq id no.28所示；hpv16 fip-1引物由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第208-228和第248-271位，序列为：gtcttacaggagcaagtgtatctgactgggtatattccattggga，如seq id no.29所示；hpv16 lf-1引物位于cds区域第229-247位，序列为：tagctgtgggaggccttgt，如seq id no.30所示；hpv16 bip-1引物同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于
cds上第293-315位和第357-375位，序列为：tgggcccttctgatccttctataggaaggtacagatgttggt，如seq id no.31所示；hpv16 b3-1引物位于cds区域上第377-395位，序列为：cctgatacatctgggggaa，如seq id no.32所示。
97.hpv16备选引物组合2选择位于 l2基因cds区域第111-297位设计引物序列，具体地：hpv16 f3-2引物的位置为l2基因cds区域上第111-130位，序列为：aggcaaaactattgctgatc，如seq id no.33所示；hpv16 fip-2引物由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第135-159和第176-195位，序列为：acccgaccctgttccaattcattacaatatggaagtatgggtgta，如seq id no.34所示；hpv16 bip-2引物同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第200-219位和第243-262位，序列为：gcggacgcactgggtatattgagcaagtgtatctgtagct，如seq id no.35所示；hpv16 lf-2引物位于cds区域第221-239位，序列为：cattgggaacaaggcctcc，如seq id no.36所示；hpv16 b3-2引物位于cds区域上第280-297位，序列为：gcccacaggatctactgt，如seq id no.37所示。
98.上述对比组合反应体系中f3引物和b3引物浓度都为0.2μm、fip引物和bip引物浓度都为1.6μm，lf引物（如果有）和lb引物（如果有）浓度都为0.67μm；反应体系中用到的其它组分及浓度同实施例11。
99.除了上述靶点、引物的变化，本实施例还进行了不同修饰位点的比较，包括本发明实施例1引物组合、备选修饰1和备选修饰2，是在本发明实施例1引物序列组合不变的基础上叠加不同的修饰方案，分别为：bip 5’端（fam）+ lf 5’端（biotin）修饰（本发明实施例1）；fip 5’端（fam）+ lf 5’端（biotin）修饰（备选修饰1）；bip 5’端（fam）+ lb 5’端（biotin）修饰（备选修饰2）。
100.上述各组合以制备的hpv16参考品作为待测样本进行检测，并制备成浓度为2500 copies/ml、1000 copies/ml、500 copies/ml、250 copies/ml和100 copies/ml的待测样本，检测方法参照实验例1，结果如表6所示。
101.表6 hpv16各引物组合检测限检测结果
从表6可知，相比不同引物组合和修饰方式，本发明实施例1中的引物组合和修饰方法不但检测限最低，而且灵敏度最高。
102.针对hpv18，本发明设计了以下备选引物：hpv18备选引物组合1位于l1基因cds区域第569-769位核酸序列，具体地：hpv18 f3-1引物的位置为l2基因cds区域上第569-586位，序列为：ctgaaagttcccatgccg，如seq id no.38所示；hpv18 fip-1引物由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第596-615和第641-665位，序列为：cagcccaaaatacataactgtgtctatgtttctgaggacgttagg，如seq id no.39所示；hpv18 bip-1引物同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第671-691位和第714-731位，序列为：ctgctattggggaacactgggccctgtgataaaggacgc，如seq id no.40所示；hpv18 b3-1引物位于cds区域上第747-769位，序列为：ccaaaactgtgtttttaagttct，如seq id no.41所示。
103.hpv18备选引物组合2位于l1基因cds区域第569-769位核酸序列，具体地：hpv18 f3-2引物的位置为l2基因cds区域上第569-586位，序列为：
ctgaaagttcccatgccg，如seq id no.42所示；hpv18 fip-2引物由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第606-623和第646-669位，序列为：ggcacagcccaaaatacataactgggacgttagggacaatgt，如seq id no.43所示；hpv18 bip-2引物同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第671-691位和第714-731位，序列为：ctgctattggggaacactgggccctgtgataaaggacgc，如seq id no.44所示；hpv18 b3-2引物位于cds区域上第747-769位，序列为：ccaaaactgtgtttttaagttct，如seq id no.45所示。
104.其中，各对比组合反应体系中f3引物和b3引物浓度都为0.2μm、fip引物和bip引物浓度都为1.6μm，lf引物（如果有）和lb引物（如果有）浓度都为0.67μm；反应体系中用到的其它组分及浓度同实施例12。
105.不同修饰位点的比较包括 本发明实施例3引物组合、备选修饰1和备选修饰2，是在 本发明实施例3引物序列组合不变的基础上叠加不同的修饰方案，分别为：fip 5’端（fam）+ lf 5’端（biotin）修饰（本发明实施例3）；bip 5’端（fam）+ lf 5’端（biotin）修饰（备选修饰1）；bip 5’端（fam）+ lb 5’端（biotin）修饰（备选修饰2）。
106.各组合以制备的hpv18参考品作为待测样本进行检测，结果如表7所示：表7 hpv18各引物组合检测限检测结果
从表7可知，备选修饰1、备选修饰2和备选引物组1的检出限都为1000copies/ml，备选引物组2的检出限为2500copies/ml。综上，本发明实施例3中的引物组合和修饰方法检测限最低、灵敏度最高。
107.针对hpv33，本发明设计了以下备选引物：hpv33备选引物组合1位于l2基因cds区域的第246-491位核酸序列，具体地：hpv33 f3-1引物的位置为cds区域上第246-263位，序列为：aatccccttgcagcctat，如seq id no.46所示；hpv33 fip-1引物由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第270-289和第329-353位，序列为：gcacctgcctctataaaacttgttttccggttactgtagacactg，如seq id no.47所示；hpv33 lf-1引物位于cds区域第294-318位，序列为：tgacactatagacgagtctaaaggt，如seq id no.48所示；hpv33 bip-1引物同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第367-390位和第430-448位，序列为：attcctacaccatcaggttttgatactccccaacagatgaaac，如seq id no.49所示；hpv33 b3-1引物位于cds区域上第469-491位，序列为：
gtaaatgtgggatttaaatgtgt，如seq id no.50所示。
108.hpv33备选引物组合2位于l2基因cds区域的第270-491位核酸序列，具体地：hpv33 f3-2引物的位置为cds区域上第270-288位，序列为：tccggttactgtagacact，如seq id no.51所示；hpv33 fip-2引物由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第295-316和第335-357位，序列为：tggtgcacctgcctctataaaaccctttagactcgtctatagtgt，如seq id no.52所示；hpv33 bip-2引物同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第367-390位和第430-448位，序列为：attcctacaccatcaggttttgatactccccaacagatgaaac，如seq id no.53所示；hpv33 lb-2引物位于cds区域第398-422位，序列为：catctgcagatactacacctgcaat，如seq id no.54所示；hpv33 b3-2引物位于cds区域上第469-491位，序列为：gtaaatgtgggatttaaatgtgt，如seq id no.55所示。
109.其中，各对比组合反应体系中f3引物和b3引物浓度都为0.2μm、fip引物和bip引物浓度都为1.6μm，lf引物（如果有）和lb引物（如果有）浓度都为0.67μm；反应体系中用到的其它组分及浓度同实施例13。
110.不同修饰位点的比较包括本发明实施例5引物组合、备选修饰1和备选修饰2，是在本发明实施例5引物序列组合不变的基础上叠加不同的修饰方案，分别为：fip 5’端（fam）+ lf 5’端（biotin）修饰（本发明实施例5）；bip 5’端（fam）+ lf 5’端（biotin）修饰（备选修饰1）；fip 5’端（fam）+ bip 5’端（biotin）修饰（备选修饰2）。
111.各组合以制备的hpv33参考品作为待测样本进行检测，结果如表8所示：表8 hpv33各引物组合检测限检测结果
从表8可知，备选修饰1、备选修饰2、备选引物组1和备选引物组2的检出限都为1000 copies/ml。综上，本发明实施例5的检测限最低，灵敏度最高。
112.针对hpv52，本发明设计了以下备选引物：hpv52备选引物组合1位于l2基因cds区域的第252-462位核酸序列，具体地：hpv52 f3-1引物的位置为cds区域上第252-269位，序列为：cacgtccactattcgtcc，如seq id no.56所示；hpv52 fip-1引物由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第270-289和第328-352位，序列为：cgccagactcaataaatgttgtttcccctgtaactgtagaaccca，如seq id no.57所示；hpv52 lf-1引物位于cds区域第291-314位，序列为：actatagatggttctaagggacca，如seq id no.58所示；hpv52 bip-1引物同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第356-377位和第413-437位，序列为：ctgctccatctattccatcagcgatgttacattaattattgcaggag，如seq id no.59所示；hpv52 lb-1引物位于cds区域第380-404位，序列为：cagggtttgatgttacaacatctgc，如seq id no.60所示；hpv52 b3-1引物位于cds区域上第440-462位，序列为：
tgattgtacagatgattcaccta，如seq id no.61所示。
113.hpv52备选引物组合2位于l2基因cds区域的第402-614位核酸序列，具体地：hpv52 f3-2引物的位置为cds区域上第402-423位，序列为：tgcaaataatactcctgcaata，如seq id no.62所示；hpv52 fip-2引物由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第433-455和第493-516位，序列为：cgggggctgtattatagatggttcacatctataggtgaatcatctgt，如seq id no.63所示；hpv52 lf-2引物位于cds区域第467-492位，序列为：agtgaatgtaggatttaaatgtgtag，如seq id no.64所示；hpv52 bip-2引物同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第523-544位和第571-591位，序列为：gcagaagcatctggtcatgtatagggatttcttcataggtgtg，如seq id no.65所示；hpv52 b3-2引物位于cds区域上第592-614位，序列为：gtagaggtaacaaatgtatccat，如seq id no.66所示。
114.其中，各对比组合反应体系中f3引物和b3引物浓度都为0.2μm、fip引物和bip引物浓度都为1.6μm，lf引物（如果有）和lb引物（如果有）浓度都为0.67μm；反应体系中用到的其它组分及浓度同实施例14。
115.不同修饰位点的比较包括 本发明实施例7引物组合、备选修饰1和备选修饰2，是在本发明实施例7引物序列组合不变的基础上叠加不同的修饰方案，分别为：bip 5’端（fam）+ lb 5’端（biotin）修饰（本发明实施例7）；fip 5’端（fam）+ lb 5’端（biotin）修饰（备选修饰1）；bip 5’端（fam）+ fip 5’端（biotin）修饰（备选修饰2）。
116.各组合以制备的hpv52参考品作为待测样本进行检测，结果如表9所示：表9 hpv52各引物组合检测限检测结果
从表9可知，备选修饰1、备选修饰2和备选引物组1的检出限都为1000 copies/ml，备选引物组2的检出限为2500 copies/ml。综上，本发明实施例7中的引物组合和修饰方法检测限最低、灵敏度最高。
117.针对hpv58，本发明设计了以下备选引物：hpv58备选引物组合1位于l2基因cds区域第1044-1244位核酸序列，具体地：hpv58 f3-1引物的位置为l2基因cds区域上第1044-1066位，序列为：tttaaatacttctgtttctccct，如seq id no.67所示；hpv58 fip-1引物由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第1080-1104和第1120-1142位，序列为：tgcagaggactctgaaaatcatgtggactttatgatatttatgctgac，如seq id no.68所示；hpv58 bip-1引物同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第1143-1163位和第1205-1223位，序列为：ctcacatacctcctttgccacgacacaagaggagtgtcaa，如seq id no.69所示；hpv58 lb-1引物位于cds区域第1164-1185位，序列为：cacacgtaccagtaatgtgtcc，如seq id no.70所示；hpv58 b3-1引物位于cds区域上第1227-1244位，序列为：atgtctggaccaggttcc，如seq id no.71所示。
118.hpv58备选引物组合2位于 l2基因cds区域第1108-1332位核酸序列，具体地：hpv58 f3-2引物的位置为l2基因cds区域上第1108-1132位，序列为：
gctgatactatacatgattttcaga，如seq id no.72所示；hpv58 fip-2引物由两个cds上相间隔的片段组合而成，分别位于cds上第1136-1154和第1194-1218位，序列为：aagaggagtgtcaaatccagtatttctctgcactcacatacctc，如seq id no.73所示；hpv58 lf-2引物位于cds区域第1158-1176位，序列为：actggtacgtgtggtggca，如seq id no.74所示；hpv58 bip-2引物同fip引物相似，也由两个在cds上相间隔的片段组成，分别位于cds上第1221-1241位和第1279-1301位，序列为：gtcattggaacctggtccagaggagttagtggagatataggaat，如seq id no.75所示；hpv58 b3-2引物位于cds区域上第1315-1332位，序列为：atcagcaccatccacaat，如seq id no.76所示。
119.其中，各对比组合反应体系中f3引物和b3引物浓度都为0.2μm、fip引物和bip引物浓度都为1.6μm，lf引物（如果有）和lb引物（如果有）浓度都为0.67μm；反应体系中用到的其它组分及浓度同实施例15。
120.不同修饰位点的比较包括本发明实施例9引物组合、备选修饰1和备选修饰2，是在本发明实施例9引物序列组合不变的基础上叠加不同的修饰方案，分别为：bip 5’端（fam）+ lb 5’端（biotin）修饰（本发明实施例9）；fip 5’端（fam）+ lb 5’端（biotin）修饰（备选修饰1）；bip 5’端（fam）+ fip 5’端（biotin）修饰（备选修饰2）。
121.各组合以制备的hpv58参考品作为待测样本进行检测，结果如表10所示：表10 hpv58各引物组合检测限检测结果
从表10可知，备选修饰1、备选引物组1和备选引物组2的检出限都为1000 copies/ml，备选修饰2的检测限为2500 copies/ml。综上，本发明实施例9中的引物组合和修饰方法检测限最低、灵敏度最高。
122.实验例5 引物浓度对比实验鉴于lamp反应体系中fip和bip的引物浓度对检测灵敏度影响较大，本发明的引物组合进行fip和bip的不同浓度检测对比实验，以获得最适反应浓度。
123.针对hpv16的检测试剂盒，对比实验设计详见下表11，反应体系中其它组分及浓度同实施例11。
124.表11 hpv16不同引物浓度反应体系对比实验设计
各组合以制备的hpv16参考品（500 copies/ml） 作为待测样本进行检测，重复检测10次，结果如表12所示：表12 hpv16不同引物浓度反应体系检测结果由表12可知，组合1、2、3、4、7的重复性较差，均出现了无法检测的情况，而组合5、6、8、9，在hpv16参考品的浓度为500 copies/ml的情况下，检测结果均为阳性，重复性较好。从而，当反应体系中fip和bip浓度均不低于1.6μm时，才能稳定检出500 copies/ml的hpv16参考品，达到灵敏度的要求。因此，结合检测结果和试剂成本考虑，将反应体系中fip和bip引物浓度定为1.6μm。
125.针对hpv18的检测试剂盒，对比实验设计详见下表13，反应体系中其它组分及浓度同实施例12。
126.表13 hpv18不同引物浓度反应体系对比实验设计
各组合以制备的hpv18参考品（500 copies/ml） 作为待测样本进行检测，重复检测10次，结果如表14所示：表14 hpv18不同引物浓度反应体系检测结果由表14可知，组合5、6、8、9，即反应体系中fip和bip浓度均不低于1.6μm时，才能稳定检出500 copies/ml的hpv18参考品，因此，结合试剂成本考虑，反应体系中fip和bip引物浓度定为1.6μm。
127.针对hpv33的检测试剂盒，对比实验设计详见下表15，反应体系中其它组分及浓度同实施例13。
128.表15 hpv33不同引物浓度反应体系对比实验设计
各组合以制备的hpv33参考品（500 copies/ml） 作为待测样本进行检测，重复检测10次，结果如表16所示：表16 hpv33不同引物浓度反应体系检测结果由表16可知，组合5、6、8、9，即反应体系中fip和bip浓度均不低于1.6μm时，才能稳定检出500 copies/ml的hpv33参考品，因此，结合试剂成本考虑，反应体系中fip和bip引物浓度定为1.6μm。
129.针对hpv52的检测试剂盒，对比实验设计详见下表17，反应体系中其它组分及浓度同实施例14。
130.表17 hpv52不同引物浓度反应体系对比实验设计
各组合以制备的hpv52参考品（500 copies/ml） 作为待测样本进行检测，重复检测10次，结果如表18所示：表18 hpv52不同引物浓度反应体系检测结果由表18可知，组合5、6、8、9，即反应体系中fip和bip浓度均不低于1.6μm时，才能稳定检出500 copies/ml的hpv52参考品，因此，结合试剂成本考虑，反应体系中fip和bip引物浓度定为1.6μm。
131.针对hpv58的检测试剂盒，对比实验设计详见下表19，反应体系中其它组分及浓度同实施例15。
132.表19 hpv58不同引物浓度反应体系对比实验设计
各组合以制备的hpv58参考品（500 copies/ml）作为待测样本进行检测，重复检测10次，结果如表20所示：表20 hpv58不同引物浓度反应体系检测结果由表20可知，组合5、6、8、9，即反应体系中fip和bip浓度均不低于1.6μm时，才能稳定检出500 copies/ml的hpv58参考品，因此，结合试剂成本考虑，反应体系中fip和bip引物浓度定为1.6μm。
133.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.hpv检测引物组，其特征在于，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.1所示的引物hpv16 f3；核苷酸序列如seq id no.2所示的引物hpv16 fip；核苷酸序列如seq id no.3所示的引物hpv16 lf；核苷酸序列如seq id no.4所示的引物hpv16 bip；核苷酸序列如seq id no.5所示的引物hpv16 lb；核苷酸序列如seq id no.6所示的引物hpv16 b3；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.7所示的引物hpv18 f3；核苷酸序列如seq id no.8所示的引物hpv18 fip；核苷酸序列如seq id no.9所示的引物hpv18 lf；核苷酸序列如seq id no.10所示的引物hpv18 bip；核苷酸序列如seq id no.11所示的引物hpv18 lb；核苷酸序列如seq id no.12所示的引物hpv18 b3；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.13所示的引物hpv33 f3；核苷酸序列如seq id no.14所示的引物hpv33 fip；核苷酸序列如seq id no.15所示的引物hpv33 lf；核苷酸序列如seq id no.16所示的引物hpv33 bip；核苷酸序列如seq id no.17所示的引物hpv33 b3；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.18所示的引物hpv52 f3；核苷酸序列如seq id no.19所示的引物hpv52 fip；核苷酸序列如seq id no.20所示的引物hpv52 bip；核苷酸序列如seq id no.21所示的引物hpv52 lb；核苷酸序列如seq id no.22所示的引物hpv52 b3；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：核苷酸序列如seq id no.23所示的引物hpv58 f3；核苷酸序列如seq id no.24所示的引物hpv58 fip；核苷酸序列如seq id no.25所示的引物hpv58 bip；核苷酸序列如seq id no.26所示的引物hpv58 lb；核苷酸序列如seq id no.27所示的引物hpv58 b3；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：具有seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列经删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：具有seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列经核苷酸取代或修饰，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：
与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列具有80%以上同源性或与与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列功能相似的衍生引物；和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列互补的引物。2.根据权利要求1所述的hpv检测引物组，其特征在于，所述hpv16 bip引物的5’端标记有荧光基团；所述hpv16 lf引物的5’端标记有生物素；所述hpv18 fip引物的5’端标记有荧光基团；所述hpv18 lf引物的5’端标记有生物素；所述引物hpv33 lf的5’端标记有荧光基团；所述引物hpv33 bip的5’端标记有生物素；所述引物hpv52 bip的5’端标记有荧光基团；所述引物hpv52 lb的5’端标记有生物素；所述引物hpv58 bip的5’端标记有荧光基团；所述引物hpv58 lb的5’端标记有生物素。3.根据权利要求2所述的hpv检测引物组，其特征在于，所述荧光基团为fam或fitc。4.权利要求1~3任一项所述的hpv检测引物组在制备检测试剂盒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述hpv的分型包括hpv16、hpv18、hpv33、hpv52和hpv58的一种或多种。6.一种检测hpv的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的hpv检测引物组和检测试剂。7.根据权利要求6所述的检测hpv的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中引物hpv16 fip、引物hpv16 bip、引物hpv18 fip、引物hpv18 bip、引物hpv33 fip、引物hpv33 bip、引物hpv52 fip、引物hpv52 bip、引物hpv58 fip或引物hpv58 bip的终浓度独立的为1.6~2.4μmol/l。8.根据权利要求6所述的检测hpv的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括等温扩增缓冲液、dntp和bst dna聚合酶。9.根据权利要求8所述的检测hpv的试剂盒，其特征在于，所述等温扩增缓冲液包括tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4和tween-20。10.根据权利要求6所述的检测hpv的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括胶体金免疫层析试纸条，所述胶体金免疫层析试纸条包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫设置于底板上；所述判读区上设置检测线和质控线；所述检测线中包被有fam抗体，fam抗体的浓度为0.05~0.15mg/ml；所述质控线中包被有biotin-bsa溶液，所述biotin-bsa溶液的浓度为1.5~3mg/ml。

技术总结
本发明提供了HPV检测引物组、试剂盒及其应用，属于HPV病毒检测技术领域。本发明提供的HPV检测引物组包括如SEQ ID NO.1~27所示的引物，利用该引物组可对HPV16、HPV18、HPV33、HPV52、HPV58进行检测，且灵敏度高；本发明提供的含有该引物组的试剂盒，使用该试剂盒可实现对HPV的居家检测，便于及时进行干预治疗和控制病情，可在35min内完成检测反应，结果判断简便，仪器设备要求低，适用于基层医疗单位，具有发展为居家自测的潜力，同时保持了检测的低成本化，有助于宫颈癌的早筛早诊。有助于宫颈癌的早筛早诊。有助于宫颈癌的早筛早诊。


技术研发人员：陈冬冬 李翔 曾彦达 陈海琴 童本福
受保护的技术使用者：江苏美克医学技术有限公司
技术研发日：2023.08.15
技术公布日：2023/9/20