一种微滴式数字PCR在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用的制作方法

一种微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用
技术领域
1.本发明涉及微滴式数字pcr应用技术领域，特别涉及一种微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用。


背景技术：

2.人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，hiv)，即艾滋病(aids，获得性免疫缺陷综合征)病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。hiv病毒是一种rna病毒，主要感染人体中的免疫细胞，进入人体的hiv病毒经逆转录后将自身序列整合至人基因组序列上，之后再利用人宿主细胞的转录翻译系统进行大量病毒复制，严重破坏人体的免疫系统。
3.目前hiv的检测还是以全血中rna检测为主，市面上有很多rna的定量定性检测方式，例如普通pcr或者q-pcr技术，但是这些技术只是从核酸层面对病毒基因进行相对定量检测，而不能够反应艾滋病毒感染的阳性细胞数量或者比例。
4.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，旨在解决现有pcr技术无法实现对艾滋病毒感染的阳性细胞进行可视化检测的问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其中，包括步骤：
8.预先制备艾滋病毒pcr反应液，所述艾滋病毒pcr反应液包括预处理的艾滋患者外周血单个核细胞样本、艾滋病毒基因引物、艾滋病毒基因探针、内参基因引物、内参基因探针；
9.在微滴生成区，将艾滋病毒pcr反应液加入微滴生成卡的加样孔中，将微滴生成油加至微滴生成卡的加油孔中；
10.将微滴生成卡中的艾滋病毒pcr反应液与微滴生成油混合均匀后，用密封垫对所述微滴生成卡进行密封并置入微滴发生仪中；
11.启动微滴发生仪使微滴生成油包裹艾滋患者外周血单个核细胞样本形成微滴悬浊液；
12.将所述微滴悬浊液转移至96孔pcr板中并进行ddpcr扩增；
13.待ddpcr扩增结束后，将96孔pcr板放置于微滴分析仪中进行荧光信号读取，使用分析软件对荧光信号的强度和数目进行分析，实现艾滋病毒阳性细胞可视化检测。
14.所述微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其中，预先制备艾滋病毒pcr反应液的步骤包括：
15.采用常温pbs对获取的艾滋患者外周血液样品进行稀释，得到稀释血液样品；
16.对所述稀释血液样品在ficoll-paque plus中进行梯度离心，得到单个核细胞层；
17.向单个核细胞层中加入红细胞裂解液，吹打混匀后再加入pbs进行离心处理，弃上清得外周血单个核细胞(pbmc)；
18.用0.9％的生理盐水溶液对pbmc重悬稀释，调整细胞浓度得艾滋患者外周血单个核细胞样本；
19.将艾滋患者外周血单个核细胞样本、艾滋病毒基因引物、艾滋病毒基因探针、内参基因引物，以及内参基因探针进行混合，得到艾滋病毒pcr反应液。
20.所述微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其中，所述艾滋患者外周血单个核细胞样本中的细胞浓度为6
×
106个/ml-2
×
107个/ml。
21.所述微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其中，所述艾滋病毒基因引物包括如seq id no.1所示的正向引物和如seq id no.2所示的反向引物；所述艾滋病毒基因探针的序列如seq id no.3所示；所述内参基因引物包括如seq id no.4所示的正向引物和如seq id no.5所示的反向引物；所述内参基因探针的序列如seq id no.6所示。
22.所述微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其中，将所述微滴悬浊液转移至96孔pcr板中并进行ddpcr扩增的步骤中，ddpcr扩增的条件设置如下所示：
23.变性温度，94℃，30s，1次；
24.退火温度，94℃，5s；
25.延伸温度，60℃，35s，循环49次。
26.有益效果：本发明提供了一种微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，先通过微滴生成油将含艾滋患者外周血单个核细胞样本的pcr反应液均匀包裹生成具有细胞的微滴，然后通过ddpcr程序中的变性与退火，由此实现对其所包裹的单个细胞中所有核酸的pcr，即实现在细胞层面上可视化的观测每个细胞内部的hiv核酸扩增情况。
附图说明
27.图1为本发明提供的一种微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用流程图。
28.图2为油包水微滴生成示意图。
29.图3中a为内参基因gapdh的阳性液滴/阴性液滴散点图，b为hiv
+
细胞/hiv-细胞散点图。
30.图4中a为1号样本细胞上样总数为30000个/孔时检测细胞内参gapdh的液滴可视化呈现图，b为1号样本细胞上样总数为100000个/孔时检测细胞内参gapdh的液滴可视化呈现图。
31.图5中a为1号样本细胞上样总数为30000个/孔时检测hiv
+
细胞(ltr-gag引物)的液滴可视化呈现图，b为1号样本细胞上样总数为100000个/孔时检测hiv
+
细胞(ltr-gag引物)的液滴可视化呈现图。
32.图6中a为5号样本细胞上样总数为30000个/孔时检测细胞内参gapdh的液滴可视化呈现图，b为1号样本细胞上样总数为100000个/孔时检测细胞内参gapdh的液滴可视化呈
现图。
33.图7中a为5号样本细胞上样总数为30000个/孔时检测hiv
+
细胞(ltr-gag引物)的液滴可视化呈现图，b为5号样本细胞上样总数为100000个/孔时检测hiv
+
细胞(ltr-gag引物)的液滴可视化呈现图。
具体实施方式
34.本发明提供一种微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
35.普通pcr或者q-pcr技术只是从核酸层面对病毒基因或者genomic dna进行相对定量检测，现有的ddpcr也都是直接对hiv的核酸进行扩增，这些pcr技术都没有通过液滴直接包裹细胞且在油包水的液滴环境中对其所包裹的dna进行pcr，因此无法在细胞层面上可视化的观测每个细胞内部的hiv核酸扩增情况。
36.基于此，本发明提供了一种微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，如图1所示，其包括步骤：
37.s10、预先制备艾滋病毒pcr反应液，所述艾滋病毒pcr反应液包括预处理的艾滋患者外周血单个核细胞样本、艾滋病毒基因引物、艾滋病毒基因探针、内参基因引物、内参基因探针；
38.s20、在微滴生成区，将艾滋病毒pcr反应液加入微滴生成卡的加样孔中，将微滴生成油加至微滴生成卡的加油孔中；
39.s30、将微滴生成卡中的艾滋病毒pcr反应液与微滴生成油混合均匀后，用密封垫对所述微滴生成卡进行密封并置入微滴发生仪中；
40.s40、启动微滴发生仪使微滴生成油包裹艾滋患者外周血单个核细胞样本形成微滴悬浊液；
41.s50、将所述微滴悬浊液转移至96孔pcr板中并进行ddpcr扩增；
42.s60、待ddpcr扩增结束后，将96孔pcr板放置于微滴分析仪中进行荧光信号读取，使用分析软件对荧光信号的强度和数目进行分析，实现艾滋病毒阳性细胞可视化检测。
43.本发明先通过微滴生成油将含有艾滋患者外周血单个核细胞样本的pcr反应液均匀包裹生成具有细胞的微滴，然后通过ddpcr程序中的变性与退火，即在94℃环境中，使得液滴中的细胞膜裂解，开始进入pcr的工作流程，由此实现对其所包裹的单个细胞中所有核酸的pcr，即实现在细胞层面上可视化的观测每个细胞内部的hiv核酸扩增情况。
44.在一些实施方式中，如图2所示，预先制备艾滋病毒pcr反应液的步骤包括：采用常温pbs对获取的艾滋患者外周血液样品进行稀释，得到稀释血液样品；对所述稀释血液样品在ficoll-paque plus中进行梯度离心，得到单个核细胞层；向单个核细胞层中加入红细胞裂解液，吹打混匀后再加入pbs进行离心处理，弃上清得pbmc；用0.9％的生理盐水溶对pbmc进行重悬稀释，调整浓度得到艾滋患者外周血单个核细胞样本；将艾滋患者外周血单个核细胞样本、艾滋病毒基因引物、艾滋病毒基因探针、内参基因引物，以及内参基因探针进行混合，得到含艾滋患者外周血单个核细胞的艾滋病毒pcr反应液。
45.在本实施例中，所述艾滋病毒基因引物包括如seq id no.1所示的正向引物和如
seq id no.2所示的反向引物，其中，seq id no.1所示的正向引物记为ltr-gag-f，其序列为：gcctcaataaagcttgccttga；seq id no.2所示的反向引物记为ltr-gag-r，其序列为：ggcgccactgctagagtttt；所述艾滋病毒基因探针的序列如seq id no.3所示，记为ltr-gag-探针，其序列为：tgtgactctggtaactagaaccctcagac；所述内参基因引物包括如seq id no.4所示的正向引物和如seq id no.5所示的反向引物，其中，seq id no.4所示的正向引物记为pdh-1，其序列为：tgaaagttatacaaaattgaggtcactgtt，seq id no.5所示的反向引物记为pdh-2，其序列为：tccacagccctcgactaacc；所述内参基因探针的序列如seq id no.6所示，记为pdh-探针，其序列为：cccccagatacacttaagggatcaactcttaattgt。
46.在本实施例中，所述艾滋患者外周血单个核细胞样本中的细胞浓度为：6
×
106个/ml-2
×
107个/ml。
47.下面通过具体实施例对本发明作进一步的解释说明：
48.一种微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其包括以下步骤：
49.1、采用ficoll-paque plus密度梯度离心的方法分离艾滋病患者的外周血单个核细胞(pbmc)，其包括以下步骤：
50.血液稀释：加常温pbs将艾滋患者的外周血液样本进行1：1稀释(在采血管中)，使用胶头滴管轻轻混匀，得到稀释血液样品，将稀释血液样品缓慢加在5ml的ficoll-paque plus上；
51.梯度离心：在18-20℃下以2000rpm对稀释血液样品离心20分钟，之后离心机设置为4℃预冷(program 3)，尽可能将离心机的升降加速度调至最低，参数可调整为：升速为1，降速为0，可以防止离心结束后刹车震动，扰乱分层；
52.吸白膜：使用无菌滴管小心将梯度离心得到的单个核细胞层转移至含6ml的预冷pbs的15ml离心管中，再加入预冷pbs补充到15ml；
53.离心：在4℃，1500rpm离心5分钟，留下层细胞；
54.裂解红细胞：向细胞中加入3ml红细胞裂解液(el buffer)，吹打混匀室温裂红细胞5min后，加入pbs至10ml，离心1500rpm/min，5min；
55.用0.9％生理盐水洗过后重悬，计数，200μl/管分装；
56.最后再用0.9％的生理盐水溶液分别按6
×
106个/ml、2
×
107个/ml稀释pbmc，得到艾滋患者外周血单个核细胞样本。
57.2、微滴式ddpcr实验：
58.将12.5μl的hiv外周血液样本+1.25μl ltr-gag-f(10μm)+1.25μl ltr-gag-r(10μm)+0.625μl ltr-gag-探针(10μm)+1.25μl pdh-1(10μm)+1.25μl pdh-2(10μm)+0.625μl pdh-探针(10μm)+5μl细胞模板(细胞浓度为6
×
106个/ml、2
×
107个/ml)+1.25μl ddpcr水混合，制得艾滋病毒pcr反应液；
59.其中，艾滋病毒基因ltr区段引物及ltr探针与内参gapdh基因引物及gapdh探针的序列如表1所示：
[0060][0061]
3、微滴的生成：
[0062]
在微滴生成区，将25μl艾滋病毒pcr反应液加入微滴生成卡的加样孔，继而，70μl微滴生成油加至微滴生成卡的加油孔。微滴的反应液与油混合均匀后，用密封垫密封微滴生成卡，置入微滴发生仪，启动微滴发生仪并生成微滴；大约2分钟后，微滴制备完成，取出卡槽，将40μl的微滴悬浊液从最上排孔中移出至96孔pcr板。
[0063]
4、扩增读取条件，及dd pcr条件设置：
[0064]
pcr程序：
[0065]
变性温度，94℃，30s，1次；
[0066]
退火温度，94℃，5s；
[0067]
延伸温度，60℃，35s，循环49次；
[0068]
待pcr扩增结束，将96孔板放置于微滴分析仪中选择fam/hex通道进行信号读取。
[0069]
5、分析统计：
[0070]
使用quantasoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析；可以根据荧光信号的有无及强度，判断阴性/阳性微滴所占比例。
[0071]
本实施利用了液滴发生器当中的微流控技术能够产生“油包水”微滴的方法，使用该方法将含外周血单个核细胞(pbmc)的病毒pcr反应液进行包裹形成微滴；再通过pcr程序中的94℃变性步骤，对单个液滴中所包裹的细胞进行裂解暴露核酸成分作为下一步pcr的模板；接着，通过pcr反应体系中酶与模板及引物互相结合发生反应，产生在单个细胞所包裹的微滴内进行pcr核酸扩增反应。微滴pcr体系核酸产物中的激光信号通过类似于流式细胞仪器的激发检测器逐一通过每个微滴，形成数字及图片信号。最终，通过上述反应及技术的应用，来实现对核酸目的片段阳性细胞的可视化，以及其与阴性细胞比例的区分。又因为具备液滴pcr多种荧光通道，因而可以实现对同一细胞的多靶标多位点检测。
[0072]
采用实施例1中微滴式数字pcr方法对1-8号样本进行可视化检测中，1-8号样本均为临床确认的艾滋患者的外周血单个核细胞样本。其中，1-4号样本来自同一个病人样本，5-8号来自另一个病人样本。并且样本1号，2号，5号，6号细胞上样总数为30000个/孔。样本3号，4号，7号，8号细胞上样总数为100000个/孔。
[0073]
图3中a为内参基因gapdh的阳性液滴/阴性液滴散点图，图3中b为hiv
+
细胞/hiv-细胞液滴散点图。从图中可以看出ddpcr能够对pbmc实现hiv病毒可视化。
[0074]
图4中a为1号样本细胞上样总数为30000个/孔的艾滋患者样本pb mc中试验数据，b为1号样本细胞上样总数为100000个/孔的艾滋患者样本pbmc中试验数据，所述试验数据具体为ddpcr检测内参gapdh的细胞液滴可视化呈现图，蓝色为阴性液滴，橘红色为阳性液
滴。
[0075]
图5中a为1号样本细胞上样总数为30000个/孔的艾滋患者样本pb mc中试验数据，b为1号样本细胞上样总数为100000个/孔的艾滋患者样本pbmc中试验数据，所述试验数据具体为ddpcr检测hiv(ltr-gag引物)的细胞液滴可视化呈现图，蓝色为阴性液滴，橘红色为阳性液滴。
[0076]
图6中a为5号样本细胞上样总数为30000个/孔的艾滋患者样本pb mc中试验数据，b为5号样本细胞上样总数为100000个/孔的艾滋患者样本pbmc中试验数据，所述试验数据具体为ddpcr检测内参gapdh的细胞液滴可视化呈现图，蓝色为阴性液滴，橘红色为阳性液滴。
[0077]
图7中a为5号样本细胞上样总数为30000个/孔的艾滋患者样本pb mc中试验数据，b为5号样本细胞上样总数为100000个/孔的艾滋患者样本pbmc中试验数据，所述试验数据具体为ddpcr检测hiv(ltr-gag引物)的细胞液滴可视化呈现图，蓝色为阴性液滴，橘红色为阳性液滴。图4-图7结果均说明ddpcr能够直接可视化的检测艾滋患者的单个核细胞内部的hiv核酸扩增情况。
[0078]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

技术特征：
1.一种微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其特征在于，包括步骤：预先制备艾滋病毒pcr反应液，所述艾滋病毒pcr反应液包括预处理的艾滋患者外周血单个核细胞样本、艾滋病毒基因引物、艾滋病毒基因探针、内参基因引物、内参基因探针；在微滴生成区，将艾滋病毒pcr反应液加入微滴生成卡的加样孔中，将微滴生成油加至微滴生成卡的加油孔中；将微滴生成卡中的艾滋病毒pcr反应液与微滴生成油混合均匀后，用密封垫对所述微滴生成卡进行密封并置入微滴发生仪中；启动微滴发生仪使微滴生成油包裹艾滋患者外周血单个核细胞样本形成微滴悬浊液；将所述微滴悬浊液转移至96孔pcr板中并进行ddpcr扩增；待ddpcr扩增结束后，将96孔pcr板放置于微滴分析仪中进行荧光信号读取，使用分析软件对荧光信号的强度和数目进行分析，实现艾滋病毒阳性细胞可视化检测。2.根据权利要求1所述微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其特征在于，预先制备艾滋病毒pcr反应液的步骤包括：采用常温pbs对获取的艾滋患者外周血液样品进行稀释，得到稀释血液样品；对所述稀释血液样品在ficoll-paque plus中进行梯度离心，得到单个核细胞层；向单个核细胞层中加入红细胞裂解液，吹打混匀后再加入pbs进行离心处理，弃上清得外周血单个核细胞(pbmc)；用0.9％的生理盐水溶液对pbmc重悬稀释，调整细胞浓度得艾滋患者外周血单个核细胞样本；将艾滋患者外周血单个核细胞样本、艾滋病毒基因引物、艾滋病毒基因探针、内参基因引物，以及内参基因探针进行混合，得到艾滋病毒pcr反应液。3.根据权利要求2所述微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其特征在于，所述艾滋患者外周血单个核细胞样本中的细胞浓度为6
×
106个/ml-2
×
107个/ml。4.根据权利要求2所述微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其特征在于，所述艾滋病毒基因引物包括如seq id no.1所示的正向引物和如seq id no.2所示的反向引物；所述艾滋病毒基因探针的序列如seq id no.3所示；所述内参基因引物包括如seq id no.4所示的正向引物和如seq id no.5所示的反向引物；所述内参基因探针的序列如seq id no.6所示。5.根据权利要求1所述微滴式数字pcr在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，其特征在于，将所述微滴悬浊液转移至96孔pcr板中并进行ddpcr扩增的步骤中，ddpcr扩增的条件设置如下所示：变性温度，94℃，30s，1次；退火温度，94℃，5s；延伸温度，60℃，35s，循环49次。

技术总结
本发明涉及微滴式数字PCR应用技术领域，公开了一种微滴式数字PCR在艾滋病毒阳性细胞可视化检测中的应用，先通过微滴生成油将含艾滋患者外周血单个核细胞样本的PCR反应液均匀包裹生成具有细胞的微滴，然后通过ddPCR程序中的变性与退火，由此实现对其所包裹的单个细胞中所有核酸的PCR，即实现在细胞层面上可视化的观测每个细胞内部的HIV核酸扩增情况。化的观测每个细胞内部的HIV核酸扩增情况。化的观测每个细胞内部的HIV核酸扩增情况。


技术研发人员：李倩 王俊 卢洪洲 孙丽琴 肖婉婉 林子洵
受保护的技术使用者：深圳市第三人民医院（深圳市肝病研究所）
技术研发日：2023.07.27
技术公布日：2023/9/20