一种制备高稳定性类胡萝卜素的方法与流程

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种制备高稳定性类胡萝卜素的方法。


背景技术：

2.类胡萝卜素是一类在自然界中普遍存在并且在微生物，植物，动物中具有重要功能的四萜烯有机分子化学色素。植物、藻类、酵母、真菌和一些细菌可以利用类异戊二烯为原料生产类胡萝卜素。类胡萝卜素特殊的不饱和结构赋予了它特别的功能。在植物与蓝细菌中，β-胡萝卜素参与了光合作用的能量传递过程。在高等动物中，类胡萝卜素是一种类高效的自由基猝灭剂。在微生物中，类胡萝卜素参与微生物对外界环境的抵抗。人类与类胡萝卜素更是密切相关，β-胡萝卜素是维生素a的前体，参与人体多种必需的反应，缺乏维生素a会导致夜盲症。类胡萝卜素的功能主要表现它能猝灭氧自由基，抗氧化，增强人体免疫力，预防心血管疾病，抗癌等多种功能。类胡萝卜素因其不饱和度和两端结构不同它们的颜色呈现从红色、黄色到橙色。目前已发现超过1100种来自不同物种的不同的类胡萝卜素，不同的类胡萝卜素具有不同的颜色和不同的生物功能特性。
3.2017年全球类胡萝卜素市场为15亿美元，2020年达到约20亿美元。全球市场调查(2018-2024年)估计，类胡萝卜素在食品和饮料、药品、化妆品、动物饲料和膳食补充剂中的市场份额分别为26.1％、9.2％、6.5％、34.8％和23.5％。目前，约80～90％的类胡萝卜素供应由化学合成完成。因此，与化学合成类胡萝卜素相比，天然类胡萝卜素的市场份额要低得多，因为其成本较高。化学合成类胡萝卜素的市场价值相对较低位250～2000美元每公斤，而天然植物类胡萝卜素的市场价值为350～7500美元每公斤。由于植物来源的类胡萝卜素价格昂贵，近年来，由于其经济可持续性和成本效益，市场对微生物类胡萝卜素生产的兴趣不断上升。


技术实现要素：

4.本发明提供一种制备高稳定性类胡萝卜素的方法，利用优化的发酵条件，不仅提高食醚红球菌发酵产类胡萝卜素的产量，同时还能够得到具有优异稳定性的类胡萝卜素。
5.为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种制备高稳定性类胡萝卜素的方法，包括菌种活化、种子培养和发酵培养：
7.菌种为食醚红球菌(rhodococcusaetherivorans)n1，保藏编号为cctccno：m20221270；
8.所述发酵培养的发酵培养基的配方为碳源10～60g/l，尿素0.2～4g/l，蛋白胨10～20g/l，酵母粉或玉米浆干粉5～10g/l，微量元素1ml/l，其余为水；所述微量元素的配方为fecl2·
4h2o1.5g/l、cocl2·
6h2o 0.19g/l、mncl2·
4h2o 0.1g/l、zncl20.07 g/l、nicl2·
6h2o 0.024g/l、na2mo4·
2h2o 0.036g/l、cucl2·
2h2o 0.002g/l。
9.优选的，所述发酵培养的条件为：ph＝7，温度30℃，培养时间为6天。
10.优选的，所述碳源为葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖或乳糖，更优选为葡萄糖。
11.优选的，所述发酵培养的发酵培养基的配方为葡萄糖30g/l，蛋白胨10g/l，玉米浆干粉5g/l，尿素0.5g/l，微量元素1ml/l。
12.优选的，所述菌种活化的过程为：将食醚红球菌划线至lb固体培养基中培养，培养温度28～32℃，培养时间45～50h。
13.优选的，所述种子培养的过程为：将活化后的菌接种到lb液体培养基中培养，培养温度28～32℃，培养时间28～32h。
14.优选的，所述发酵培养的接种量为5％v/v。
15.优选的，所述发酵培养在好氧条件下进行。
16.所述lb固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 10g/l、琼脂粉1.5g～2.0g。
17.所述lb液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 10g/l。
18.本发明的有益效果如下：
19.本发明中的食醚红球菌n1在摇瓶发酵经过碳源筛选，碳源优化，氮源筛选，氮源优化，利用廉价氮源，可达到最高13g/l细胞干重，合成类胡萝卜素达45.9mg/l，并且有高稳定性对极端的酸，高温，金属离子氧化胁迫有高抵抗力。本发明中的食醚性红球菌n1，在摇瓶发酵中利用葡萄糖为碳源，发酵产生细胞干重为13g/l，生产类胡萝卜素含量为45.9mg/l，rhodococcus aetherivoransn1可以通过发酵积累高稳定性的类胡萝卜素，该类胡萝卜素有着广泛的应用前景。
附图说明
20.图1是实施例1中红球菌菌株利用不同碳源发酵得到的od600检测图。
21.图2是实施例1中红球菌菌株利用不同碳源产类胡萝卜素产量与含量图。
22.图3是实施例2中红球菌菌株利用不同浓度葡萄糖发酵得到的od600检测图。
23.图4是实施例2中红球菌菌株利用不同浓度葡萄糖产类胡萝卜素产量与含量图。
24.图5是实施例3中红球菌菌株利用不同浓度蛋白胨酵母粉发酵得到的od600检测图。
25.图6是实施例3中红球菌菌株利用不同浓度蛋白胨酵母粉产类胡萝卜素产量与含量图。
26.图7是实施例4中红球菌菌株利用不同浓度尿素发酵得到的od600检测图。
27.图8是实施例4中红球菌菌株利用不同浓度尿素产类胡萝卜素产量与含量图。
28.图9是实施例5中红球菌菌株在不同ph下发酵得到的od600检测图。
29.图10是实施例5中红球菌菌株在不同ph下产类胡萝卜素产量与含量图。
30.图11是实施例6中红球菌菌株在不同温度下发酵得到的od600检测图。
31.图12是实施例6中红球菌菌株在不同温度下产类胡萝卜素产量与含量图。
32.图13是实施例7中红球菌菌株发酵不同时间得到的od600检测图。
33.图14是实施例7中红球菌菌株发酵不同时间产类胡萝卜素素产量与含量图。
34.图15是实施例8中红球菌菌株利用酵母粉或玉米浆干粉发酵得到的od600检测图。
35.图16是实施例8中红球菌菌株利用酵母粉或玉米浆干粉产类胡萝卜素产量与含量图。
36.图17是实施例9中红球菌菌株发酵产类胡萝卜素粗提取物、β-胡萝卜素和叶黄素样品稳定性检测对比图。
具体实施方式
37.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
38.本发明类胡萝卜素检测方法如下：
39.取2ml发酵结束后的菌液一式两份，10000rpm、3min处理，一份菌泥至于70℃烘干过夜至恒重，用于检测其生物量。另一份菌泥加入400ul，3m hcl，沸水浴3min后再冰水浴3min，13000rpm，5min处理后弃去上清液，向菌体中加入400ul丙酮，浸提1h，取带有类胡萝卜素的上清保存好，重复此操作3-4次，直到菌体无色。合并丙酮后，用紫外分光光度计测od455。
40.实施例1
41.考察所述红球菌菌株rhodococcus aetherivorans n1利用不同碳源生长及发酵：
42.(1)菌种活化：将食醚红球菌划线至lb固体培养基中培养，从固体培养基上挑取菌株n1单菌落接种到5ml lb液体试管培养基中，30℃，180r
·
min-1
培养24h。
43.(2)种子培养：将活化后的菌以接种量2％v/v接种到100mllb液体培养基中培养，30℃，180r
·
min-1
培养24h。
44.(3)利用葡萄糖、木糖、果糖、乳糖或蔗糖为碳源发酵生产类胡萝卜素：将种子以5％v/v接种到发酵培养基中发酵120h。
45.发酵培养基配方为：碳源30g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、微量元素1ml/l(fecl2·
4h2o 1.5g/l、cocl2·
6h2o 0.19g/l、mncl2·
4h2o 0.1g/l、zncl20.07 g/l、nicl2·
6h2o0.024g/l、na2mo4·
2h2o 0.036g/l、cucl2·
2h2o 0.002g/l)，调节ph至7.0。发酵结果如图1-2所示，上述碳源中，以葡萄糖为碳源生产类胡萝卜素的量最高，达到35mg/l。
46.实施例2
47.考察所述红球菌菌株rhodococcus aetherivorans n1利用不同浓度葡萄糖生长及发酵：
48.步骤(1)、(2)同实施例1。
49.(3)分别以10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l和60g/l葡萄糖为碳源发酵生产类胡萝卜素：将种子以5％v/v接种到发酵培养基中发酵120h。
50.发酵培养基配方为：上述碳源、尿素0.5g/l、蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、微量元素1ml/l(fecl2·
4h2o 1.5g/l、cocl2·
6h2o 0.19g/l、mncl2·
4h2o 0.1g/l、zncl20.07 g/l、nicl2·
6h2o0.024g/l、na2mo4·
2h2o 0.036g/l、cucl2·
2h2o 0.002g/l)，调节ph至7.0。发酵结果如图3-4所示，上述不同浓度碳源中，以30g/l葡萄糖培养，生产类胡萝卜素含量最高为36.2mg/l。
51.实施例3
52.考察所述红球菌菌株rhodococcus aetherivorans n1利用不同浓度蛋白胨酵母
粉生长及发酵：
53.步骤(1)、(2)同实施例1。
54.(3)分别以蛋白胨20g/l和酵母粉10g/l(ck)、酵母粉10g/l(g1)、蛋白胨20g/l(g2)、蛋白胨10g/l和酵母粉5g/l(g3)、蛋白胨5g/l和酵母粉2.5g/l(g4)、蛋白胨2.5g/l和酵母粉1.25g/l(g5)发酵生产类胡萝卜素：将种子以5％v/v接种到发酵培养基中发酵120h。
55.发酵培养基配方为：葡萄糖30g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨和酵母粉、微量元素1ml/l(fecl2·
4h2o 1.5g/l、cocl2·
6h2o 0.19g/l、mncl2·
4h2o 0.1g/l、zncl20.07 g/l、nicl2·
6h2o0.024g/l、na2mo4·
2h2o 0.036g/l、cucl2·
2h2o 0.002g/l)，调节ph至7.0。发酵结果如图5-6所示，不同浓度的蛋白胨和酵母粉的组合中，以10g/l蛋白胨和5g/l酵母粉发酵培养生产类胡萝卜素含量最高为37.1mg/l。
56.实施例4
57.考察所述红球菌菌株rhodococcus aetherivorans n1利用不同浓度尿素生长及发酵：
58.步骤(1)、(2)同实施例1。
59.(3)分别以0.2g/l，0.5g/l，1g/l，2g/l或4g/l尿素发酵生产类胡萝卜素：将种子以5％v/v接种到发酵培养基中发酵120h。
60.发酵培养基配方为：葡萄糖30g/l、尿素、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、微量元素1ml/l(fecl2·
4h2o 1.5g/l、cocl2·
6h2o 0.19g/l、mncl2·
4h2o 0.1g/l、zncl20.07 g/l、nicl2·
6h2o0.024g/l、na2mo4·
2h2o 0.036g/l、cucl2·
2h2o 0.002g/l)，调节ph至7.0。发酵结果如图7-8所示，不同浓度的尿素中，以0.5g/l尿素发酵培养生产类胡萝卜素含量最高为35.1mg/g。
61.实施例5
62.考察所述红球菌菌株rhodococcus aetherivorans n1在不同ph下生长及发酵：
63.步骤(1)、(2)同实施例1。
64.(3)分别在ph为4、6、7、8、9条件下发酵生产类胡萝卜素：将种子以5％v/v接种到发酵培养基中发酵120h。
65.发酵培养基配方为：葡萄糖30g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、微量元素1ml/l(fecl2·
4h2o 1.5g/l、cocl2·
6h2o 0.19g/l、mncl2·
4h2o 0.1g/l、zncl20.07 g/l、nicl2·
6h2o 0.024g/l、na2mo4·
2h2o 0.036g/l、cucl2·
2h2o 0.002g/l)，分别调节ph至考察的ph。发酵结果如图9-10所示，各ph条件下，在ph值为7条件下发酵生产类胡萝卜素可达35.41mg/l。
66.实施例6
67.考察所述红球菌菌株rhodococcus aetherivorans n1在不同温度下生长及发酵：
68.步骤(1)、(2)同实施例1。
69.(3)将种子以5％v/v接种到发酵培养基中，分别在温度为22℃、24℃、30℃、37℃条件下，180r
·
min-1
发酵120h。
70.发酵培养基配方为葡萄糖30g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、微量元素1ml/l(fecl2·
4h2o 1.5g/l、cocl2·
6h2o 0.19g/l、mncl2·
4h2o 0.1g/l、zncl20.07 g/l、nicl2·
6h2o0.024g/l、na2mo4·
2h2o 0.036g/l、cucl2·
2h2o 0.002g/l)，调节ph至7。发
酵结果如图11-12所示，在30℃下发酵培养生产类胡萝卜素可达37mg/l。
71.实施例7
72.考察所述红球菌菌株rhodococcus aetherivorans n1不同发酵时间生产类胡萝卜素：
73.步骤(1)、(2)同实施例1。
74.(3)将种子以5％v/v接种到发酵培养基中分别发酵1～8天。
75.发酵培养基配方为葡萄糖30g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、微量元素1ml/l(fecl2·
4h2o 1.5g/l、cocl2·
6h2o 0.19g/l、mncl2·
4h2o 0.1g/l、zncl20.07 g/l、nicl2·
6h2o0.024g/l、na2mo4·
2h2o 0.036g/l、cucl2·
2h2o 0.002g/l)，调节ph至7。发酵结果如图13-14所示，最佳发酵时间为6天。
76.实施例8
77.考察所述红球菌菌株rhodococcus aetherivorans n1利用酵母粉或玉米浆干粉发酵及生长：
78.步骤(1)、(2)同实施例1。
79.(3)将种子以5％v/v接种到发酵培养基中发酵144h。
80.发酵培养基配方为葡萄糖30g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l或玉米浆干粉5g/l、微量元素1ml/l(fecl2·
4h2o 1.5g/l、cocl2·
6h2o 0.19g/l、mncl2·
4h2o 0.1g/l、zncl20.07g/l、nicl2·
6h2o 0.024g/l、na2mo4·
2h2o 0.036g/l、cucl2·
2h2o 0.002g/l)，调节ph至7。发酵结果如图15-16所示，以5g/l玉米浆干粉发酵生产类胡萝卜素可达45.9mg/l，细胞干重可达13g/l。
81.实施例9
82.(1)将红球菌发酵类胡萝卜素粗提取物、β-胡萝卜素、叶黄素标准样品稀释至25mg/l，在37℃下ph调至7.0，持续120分钟，同时通过紫外分光光度计检测三种类胡萝卜素样品od455吸光度变化比值。
83.(2)将三种类胡萝卜素样品在37℃下ph调至7.0并添加1mm亚铁离子，持续120分钟，同时通过紫外分光光度计检测od455吸光度变化比值。
84.(3)将三种类胡萝卜素样品在37℃下ph调至7.0并添加1mm铁离子，持续120分钟，同时通过紫外分光光度计检测od455吸光度变化比值。
85.(4)将三种类胡萝卜素样品在37℃下添加1mm亚铁离子并将类胡萝卜素溶液ph值用3m hcl调至1.0，持续120分钟，同时通过紫外分光光度计检测od455吸光度变化比值。
86.(5)将三种类胡萝卜素样品在37℃下添加1mm铁离子并将类胡萝卜素溶液ph值用3mhcl调至1.0，持续120分钟，同时通过紫外分光光度计检测od455吸光度变化比值。
87.检测结果如图17所示，菌株n1在高温，酸，金属离子氧化胁迫下，相较于β-胡萝卜素，叶黄素标准样品表现出了较高的稳定性和较强的抵抗极端条件的能力。

技术特征：
1.一种制备高稳定性类胡萝卜素的方法，包括菌种活化、种子培养和发酵培养，其特征在于，菌种为食醚红球菌(rhodococcusaetherivorans)n1，保藏编号为cctccno：m20221270；所述发酵培养的发酵培养基的配方为碳源10～60g/l，尿素0.2～4g/l，蛋白胨10～20g/l，酵母粉或玉米浆干粉5～10g/l，微量元素1ml/l，其余为水；所述微量元素的配方为fecl2·
4h2o1.5g/l、cocl2·
6h2o0.19g/l、mncl2·
4h2o0.1g/l、zncl20.07g/l、nicl2·
6h2o0.024g/l、na2mo4·
2h2o0.036g/l、cucl2·
2h2o0.002g/l。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：ph＝7，温度30℃，培养时间为6天。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖或乳糖。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖。5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的发酵培养基的配方为葡萄糖30g/l，蛋白胨10g/l，玉米浆干粉5g/l，尿素0.5g/l，微量元素1ml/l。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种活化的过程为：将食醚红球菌划线至lb固体培养基中培养，培养温度28～32℃，培养时间45～50h。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子培养的过程为：将活化后的菌接种到lb液体培养基中培养，培养温度28～32℃，培养时间28～32h。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述lb液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的接种量为5％v/v。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养在好氧条件下进行。

技术总结
本发明公开一种制备高稳定性类胡萝卜素的方法，包括菌种活化、种子培养和发酵培养，其特征在于，菌种为食醚红球菌(Rhodococcusaetherivorans)N1，保藏编号为CCTCCNO：M20221270；所述发酵培养的发酵培养基的配方为碳源10～60g/L，尿素0.2～4g/L，蛋白胨10～20g/L，酵母粉或玉米浆干粉5～10g/L，微量元素1ml/L，其余为水；所述微量元素的配方为FeCl2·


技术研发人员：信丰学 姜万奎 孙敬翔 冯一帆 崔心江 章文明
受保护的技术使用者：山东亚华生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/9/20