一种小体积封装的核酸检测试剂盒及其分装方法和核酸扩增方法与流程

1.本发明属于基因检测技术领域，尤其是涉及一种小体积封装的核酸检测试剂盒及其分装方法和核酸扩增方法。


背景技术：

2.核酸扩增反应是作为一种对于靶标扩增形成具有可检测明显特征的方案，被广泛应用于疾病诊断，药物研发，刑侦检验，检验检疫防控，种子优化等等领域内，核酸扩增的类型也由于本身的扩增机理差异而被归类为不同的方法，美国发明专利us4683202b1中描述了变温工况下的聚合酶链式反应(pcr)，该方法也是当今应用最广泛的技术，基于其开发了各种不同类型的设备，另一种技术路线则是恒温检测路线，其主要包括链替代扩增(sda)、滚环扩增法(rca)、环介导恒温核酸扩增法(lamp)、重组酶聚合酶扩增(rpa)等技术，为了保证现场使用的便捷性，目前不同的扩增基本均采用预封装的检测试剂盒进行售卖。
3.预封装提供了生产到使用端的封闭化的转运方案，使用时间一般和生产时间存在比较长的时间，需要设计出比较稳定且存储方便的预封装方案来保证使用时的检测效果。近些年采用较多的方案包含冻干和液态化两种预封装方案，基于不同的形态美国专利申请us20180320218a1提出了一种在两个独立的子空间内分别进行dna聚合酶、三磷酸核苷、反应缓冲液和盐的组分等的组分液态化保存，进而将容易受到影响的成分进行分离化设计，保证了试剂盒能够较长时间的稳定仓储，然而这种设计意味着需要有特殊设计的pcr耗材和更精密的试剂转移分配设备；欧洲发明专利ep0632134b1公开的技术方案显示了二价阳离子浓度在合适的浓度范围内对于pcr的热稳定dna聚合酶发挥出有效的保护作用；美国授权专利us10351840b2设计的试剂盒能针对rna病毒进行更有效的检测，其添加了一种在ph在8以上具有更高活性的逆转录酶，而在封装状态中使溶液具有的ph值在6-8之间，能够保证试剂更长效稳定的存储；中国授权发明专利cn115354036b也公开了一种适宜液态长效保存的rna类型病毒检测试剂盒主要改进点在于组分。另外一种兴起的封装方案为冻干的几乎无水化的保存方案，美国专利申请us20170029870a1公开了一种冻干长效稳定仓储的方案，其中最主要的是添加了相当高比例的糖，能够很好地固形并以其强的水合性来尽量维持各组分稳定的特性；pct国际申请wo2017184028a1公开了一种适用于冻干长效保存的配方方案，其给出了最优化保存期许下不同组分的浓度配比关系；中国发明专利申请cn105463125a也公开了一种冻干保护方法，其对于低温冻干工艺下的最佳冻干保护剂进行了探索。
4.从上述的分析可以得知，目前液态化封装试剂盒长效稳定保存的改进探索主要在于新试剂，合理浓度酸碱度条件，以及对于不同待检测对象的差异化设计，冻干方案主要探索了组分配比和稳定剂设计等等。然而，目前采用的液态化封装体系多为体积比较接近最终扩增的待扩增混合液体积，需要添加浓度较高的稳定剂才能发挥稳定剂的作用，然而这种稳定剂如果添加量较高则可能对于后续的扩增产生影响，严重的可能抑制扩增导致检测
结果出现假阴性，对于不同稳定剂的添加液需要经过多轮严密的验证，使得开发周期也相当长；另外，pcr反应等的扩增反应中一般包含各种酶，一般情况下酶的脱水将导致酶活性的快速降低，水在酶周围能形成保护性包裹，进而稳定它们的三级结构并阻止酶与聚合物或其他试剂发生其他反应，为了保证酶活性的稳定，一般的pcr反应液中还需要添加非离子聚合物，例如聚乙氧基化胺等，这种稳定剂的添加也需要一定量的水来保证其作用；另外冻干态对于存储耗材的密封性要求很高，需要严格控制耗材存储环境的湿度。
5.因此，亟待开发一种能够融合现有冻干方案和液态化封装优势的新方案来解决现有技术问题。


技术实现要素：

6.本发明针对现有技术的不足，提供了一种小体积封装的核酸检测试剂盒及其分装方法和核酸扩增方法。不需要对现有设备或者生产工艺进行复杂的改变，融合液态封装和冻干封装的综合优势，实现更长效稳定的保存。
7.为此，本发明第一方面提供了一种小体积封装的核酸检测试剂盒，包括n个井单元，所述井单元内包含以第一体积封装的扩增体系试剂，加入含有靶标基因的样本后的所述井单元内包含第二体积的待扩增混合液；所述第一体积不超过第二体积的1/3。
8.在本发明的一些实施方式中，所述第一体积为4.5-6μl。在一些例子中，例如，所述第一体积包括但不限于：4.5μl、5μl、5.5μl或6μl。
9.在本发明的一些实施方式中，所述第二体积为20μl或50μl。
10.在本发明的一些实施方式中，所述扩增体系试剂包括对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp和水。
11.在本发明的一些实施方式中，所述对应于靶标基因的靶标引物探针组包括靶标正向引物、靶标反向引物和靶标探针。
12.在本发明的一些实施方式中，所述扩增体系试剂中靶标正向引物浓度为0.6-1.6μm。
13.根据本发明，所述扩增体系试剂中靶标正向引物浓度为1μm。
14.在本发明的一些实施方式中，所述扩增体系试剂中靶标反向引物浓度为0.6-1.6μm。
15.根据本发明，所述扩增体系试剂中靶标反向引物浓度为1μm。
16.在本发明的一些实施方式中，所述扩增体系试剂中靶标探针浓度为0.6-0.8μm。
17.根据本发明，所述扩增体系试剂中靶标探针浓度为0.6μm。
18.在本发明的一些实施方式中，所述内标引物探针组包括内标正向引物、内标反向引物和内标探针。
19.在本发明的一些实施方式中，所述扩增体系试剂中内标正向引物浓度为0.6-1.6μm。
20.根据本发明，所述扩增体系试剂中内标正向引物浓度为1μm。
21.在本发明的一些实施方式中，所述扩增体系试剂中内标反向引物浓度为0.6-1.6μm。
22.根据本发明，所述扩增体系试剂中内标反向引物浓度为1μm。
23.在本发明的一些实施方式中，所述扩增体系试剂中内标探针浓度为0.6-0.8μm。
24.根据本发明，所述扩增体系试剂中内标探针浓度为0.6μm。
25.在本发明的一些实施方式中，所述聚合酶包括taq dna聚合酶。
26.根据本发明，所述扩增体系试剂中聚合酶浓度为240000u/l。
27.在本发明的一些实施方式中，所述5b(+)工作液为5
×
含甘油buffer。
28.在本发明的一些实施方式中，所述buffer为10
×
buffer。
29.根据本发明，所述扩增体系试剂中mgcl2的浓度为0.004m。
30.根据本发明，所述扩增体系试剂中dntp的浓度为0.6mm。
31.在本发明的一些实施方式中，所述水的体积不超过第一体积的2/5。在一些例子中，例如，所述水的体积包括但不限于0.3μl、0.5μl、0.53μl、0.55μl、0.6μl、0.65μl、0.7μl、0.75μl、0.8μl、1μl、1.2μl、1.4μl、1.6μl、1.8μl、2μl、2.2μl或2.4μl。水根据对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液和dntp的添加体积进行添加，添加水将扩增体系试剂的体积补足至第一体积。
32.根据本发明，水在pcr扩增反应的体系中尤其是预封装的反应体系中，水在酶周围能形成保护性包裹，进而稳定它们的三级结构并阻止酶与聚合物或其他试剂发生其他反应，而采用纯冻干的方案使得含水量过少无法发挥其包裹隔绝作用，本发明的方法相当于浓缩的液态，保证了足够量的水，同时又不至于像一般的采用大体积液态化封装方案存在的含水量过高，酶活性比较容易受到影响进而导致存储时间较短最终使用时试剂盒的稳定性与准确性均存在较大问题。
33.在本发明的一些实施方式中，所述待扩增混合液中水的体积比扩增体系试剂中水的体积增加100％-400％。
34.在本发明的一些实施方式中，所述扩增体系试剂还包括非离子型高分子化合物稳定剂。
35.在本发明的一些实施方式中，所述非离子型高分子化合物稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮。
36.在本发明的一些实施方式中，所述稳定剂体积与第一体积的体积百分比为0.01％-0.02％。在一些例子中，例如，所述稳定剂体积与第一体积的体积百分比包括但不限于：0.01％、0.012％、0.014％、0.016％、0.018％或0.02％。
37.为了进一步满足本发明的浓缩试剂盒稳定长效保存的需求，本发明的小体积封装核酸检测试剂盒中的扩增体系试剂还添加包含非离子型高分子化合物稳定剂，优选地，所述非离子型高分子化合物稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮，当然其他的具有稳定功能的非离子型高分子化合物也可以，此处并不限定。这种稳定剂在本发明的体系中由于存在一定量的水也能发挥其作用，而不是像冻干态的试剂盒那样由于缺少水使其稳定性效果难以发挥，本发明的小体积封装核酸检测试剂盒中非离子型高分子化合物稳定剂的最佳添加量占比扩增体系试剂总体积的0.01％-0.02％，当含量过小时难以发挥其稳定性能，而过高的含量可能对后续的扩增存在影响。
38.在本发明的一些实施方式中，所述n为不小于1的整数。在一些例子中，例如，所述n包括但不限于：1、2、3、4、5、6、7或8。
39.在本发明的一些实施方式中，n个所述井单元内包含的扩增体系试剂均以相同体
积封装；优选为以相同的第一体积封装。
40.本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的小体积封装的核酸检测试剂盒的分装方法，包括如下(a)、(b)、(c)中任一所述的分装方法：
41.(a)先将对应于靶标基因的引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp形成能用于分装不少于m个扩增体系试剂的反应液，再定量加入水，形成待分装扩增体系试剂，再将待分装扩增体系试剂以第一体积分别加入每一个所述井单元中，形成以第一体积封装的扩增体系试剂盒；
42.或，(b)先向每一个所述井单元中分别加入包括对应于靶标基因的引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp的混合试剂，再向每一个所述井单元中分别补充加入水，形成以第一体积封装的扩增体系试剂盒；
43.或，(c)将对应于靶标基因的引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp和水依次分别加入每一个所述井单元内，形成以第一体积封装的扩增体系试剂盒。
44.在本发明的一些实施方式中，所述m优选为不小于5的整数。在一些例子中，例如，所述m包括但不限于：15、35、80、100、200、500、800或1000。
45.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中靶标正向引物的添加体积为0.03-0.08μl。
46.根据本发明，每一个所述井单元中靶标正向引物的添加体积为0.05μl。
47.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中靶标反向引物的添加体积为0.03-0.08μl。
48.根据本发明，每一个所述井单元中靶标反向引物的添加体积为0.05μl。
49.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中靶标探针的添加体积为0.03-0.04μl。
50.根据本发明，每一个所述井单元中靶标探针的添加体积为0.03μl。
51.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中内标正向引物的添加体积为0.03-0.08μl。
52.根据本发明，每一个所述井单元中内标正向引物的添加体积为0.05μl。
53.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中内标反向引物的添加体积为0.03-0.08μl。
54.根据本发明，每一个所述井单元中内标反向引物的添加体积为0.05μl。
55.在本发明的一些实施方式中，每一个所述井单元中内标探针的添加体积为0.03-0.04μl。
56.根据本发明，每一个所述井单元中内标探针的添加体积为0.03μl。
57.根据本发明，每一个所述井单元中聚合酶的添加体积为0.4μl。
58.根据本发明，每一个所述井单元中5b(+)工作液的添加体积为1.8μl。
59.根据本发明，每一个所述井单元中buffer的添加体积为1.1μl。
60.根据本发明，每一个所述井单元中mgcl2的添加体积为0.01μl。
61.根据本发明，每一个所述井单元中tris工作液的添加体积为0.6μl。
62.根据本发明，每一个所述井单元中dntp的添加体积为0.3μl。
63.根据本发明，每一个所述井单元中水的添加体积为0.53μl。
64.本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的小体积封装的核酸检测试剂盒的核酸扩增方法，所述扩增方法包括：向所述井单元内分装好的扩增体系试剂中加入包含靶标基因的样本液，形成包含靶标基因的第二体积的待扩增混合液；使所述待扩增混合液在恒温或变温条件下进行扩增反应。
65.在本发明的一些实施方式中，所述扩增反应包括以下条件：(1)预变性反应：95℃反应3-5min；(2)扩增反应：95℃反应15s，63.5℃反应30-45s，45个循环。
66.根据本发明，所述扩增反应包括以下条件：(1)预变性反应：95℃反应3min；(2)扩增反应：95℃反应15s，63.5℃反应45s，45个循环。
67.在本发明的一些实施方式中，所述样本液包括样本原液、样本原液稀释液或样本洗脱液。
68.根据本发明，所述包含靶标基因的待扩增混合液的第二体积为20μl或50μl。
69.在本发明的一些实施方式中，所述小体积封装的核酸检测试剂盒可以用于但不限于对结直肠癌相关基因位点、癫痫相关基因位点、精神疾病相关基因位点、糖尿病相关基因位点、ugt1a1*28、polg c.3708g》t、cypc9*3、kcnj11 c.67t》c、abcg2、cyp3a5或cyp2c19基因位点进行检测。不限定只能在所列举的靶标和标点检测中使用，其他一些基因位点检测也同样适用，并不限定。
70.本发明的有益效果：
71.(1)本发明通过将n个井单元内封装用于扩增的第一体积的扩增体系试剂，这种扩增体系试剂的体积仅为执行扩增的待扩增混合液体积的1/3或者更少，如此能够维持封装的扩增体系试剂内各组分具有较高的浓度，不需要添加稳定剂即可保证各组分能够稳定保存的基础，在添加稳定剂后能够更稳定长效的保存，同时能够更广泛适用于更多靶基因的稳定性检测；另一方面通过配置比冻干状态高很多的含水量，能够保持水对于酶的包裹性和对于非离子聚合物的保障作用，满足了液态化封装性能更长效可靠且更稳定的要求。
72.(2)本发明通过对于8联管类型的广泛应用的pcr耗材进行小体积封装，能够适用于各种类型的pcr设备上，方法简单、通用性也更高；进一步本发明的分装方案中将酶和引物探针等组分混合在一起进行封装，不必对于耗材本身进行修改，利用了小体积状态下各组分高浓度的特性保证了各组分能长时间保存的性能，进一步通过加入非离子型的高分子化合物稳定剂尤其是聚乙烯吡咯烷酮，其加入量按照本发明的扩增体系试剂体积占比为0.01％-0.02％配置，不需要对现有设备或者生产工艺进行复杂的改变，即能够更可靠地保证封装的小体积试剂长效稳定保存。
73.(3)本发明的小体积封装的扩增体系试剂中含水量不超过总体积的2/5，而在扩增中待扩增混合液的含水量有100％-400％的增加，通过保证小体积封装的扩增体系试剂具有预定的浓缩范围，如此才能融合液态封装和冻干封装的综合优势，保证封装的小体积试剂长效稳定保存。
74.(4)本发明的扩增方法可以通过加入稀释后的样本或者更多量的样本进入小体积封装试剂盒中，能够保证加样量和样本中更大概率包含被检测靶标的效果，从而实现更可靠的扩增。
75.(5)本发明通过先混合形成能用于分装不少于m个扩增体系试剂的待分装试剂，再
分装形成以第一体积封装的扩增体系试剂盒；或者先分装混合试剂再分装水；或者直接依次分装各组分试剂，可以便捷且低成本的进行分装。
76.(6)本发明提供的小体积封装的核酸检测试剂盒可以对结直肠癌相关基因位点、癫痫相关基因位点、精神疾病相关基因位点、糖尿病相关基因位点、ugt1a1*28、polg c.3708g》t、cypc9*3、kcnj11 c.67t》c、abcg2、cyp3a5、cyp2c19等基因位点进行准确稳定检测，具有广泛的适应性，能够适用于更多靶基因的准确稳定检测。
附图说明
77.图1是本发明提供的小体积封装试剂盒以及后续加样和pcr扩增过程中状态示意图，其中，(a)-小体积封装小体积状态，(b)-加入样本形成待扩增混合液状态，(c)-最终使用状态；
78.图2是本发明实施例3中小体积封装的核酸检测试剂盒对于结直肠癌相关基因位点重复性验证检测结果图；
79.图3是本发明实施例4中不同封装试剂盒对于ugt1a1*28位点检测结果图，其中，(a)-小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果，(b)-市售常规大体积液态化封装试剂盒检测结果；
80.图4是本发明实施例5中不同封装试剂盒对于polg c.3708g》t位点检测结果图，其中，(a)-小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果，(b)-市售常规大体积液态化封装试剂盒检测结果；
81.图5是本发明实施例6中不同封装试剂盒在4℃保存72小时后对于cypc9*3位点的检测结果图，其中，c01-小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果，c02-市售常规大体积液态化封装试剂盒检测结果；
82.图6是本发明实施例7中不同封装试剂盒在室温光照8小时后对于kcnj11 c.67t》c位点的检测结果图，其中，c03-小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果，c04-市售常规大体积液态化封装试剂盒检测结果；
83.图7是本发明实施例8中不添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒在反复冻融1、3、5、8次之后对于糖尿病相关基因位点检测结果图，其中，(a)-冻融1次检测结果，(b)-冻融3次检测结果，(c)-冻融5次检测结果，(d)-冻融8次检测结果；
84.图8是本发明实施例9中添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒在反复冻融1、3、5、8次之后对于糖尿病相关基因位点检测结果图，其中，(a)-冻融1次检测结果，(b)-冻融3次检测结果，(c)-冻融5次检测结果，(d)-冻融8次检测结果；
85.图9是本发明实施例10中小体积封装的核酸检测试剂盒对于精神类疾病相关基因位点检测结果图，其中，(a)-添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果，(b)-不添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果；
86.图10是本发明实施例11中小体积封装的核酸检测试剂盒在37℃放置6天后对于结直肠癌相关基因位点检测结果图，其中，(a)-添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果，(b)-不添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果。
具体实施方式
87.为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
88.如背景技术中所公开的各种方案，不同的厂家对于试剂盒的长效稳定保存进行了比较充分地探索，主要的两种预封装方案包含液态化试剂盒，为了长效稳定保存在这种试剂盒中通常会添加不同类型的稳定剂，然而目前采用的液态化封装体系多为体积比较接近最终扩增的待扩增混合液体积，需要添加浓度较高的稳定剂才能发挥稳定剂的作用，然而这种稳定剂如果添加量较高则可能对于后续的扩增产生影响，严重的可能抑制扩增导致检测结果出现假阴性，对于不同稳定剂的添加液需要经过多轮严密的验证，使得开发周期也相当长，而背景技术中所采用的另一种冻干类型的方案，将会使封装试剂盒内的水分降低至很微小的量，为了保证部分组分稳定的效果一些文献添加了足够量的糖，而更重要的是需要保证冻干试剂盒能处于非常严密的密封试剂盒中，因此本发明从冻干态与液态试剂盒预封装方案的根本差异出发，设计了一种更适于长效稳定保存的试剂盒。
89.pcr反应通常需要在不同组分的试剂所组成的扩增体系试剂内，加入包含靶标片段的提取液或者是样本液形成待扩增混合液，封闭后在pcr设备上执行两步或者三步法的温度循环扩增，并配合对应的荧光检测方案即可实现对样本中的靶标定性或定量的检测。在内标法的定量扩增方案中，内标与靶标被混合在相同的井单元内形成扩增体系试剂。
90.试剂均为市售试剂。
91.样本均由西安天博医学检验所提供。
92.市售常规大体积液态化封装试剂盒的扩增体系试剂体积为18μl，且不含有非离子型高分子化合物稳定剂。
93.实施例1
94.本实施例以8个井单元组成的8连管类型耗材形成的试剂盒为例，将对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp和水各组分按照下表1的方式进行混合，形成能用于分装1000个扩增体系试剂的待分装扩增体系试剂。
95.表1待分装扩增体系试剂配比表
96.[0097][0098]
表1中不同组分的试剂预混形成的待分装扩增体系试剂能被分装为1000个扩增体系试剂，如图1(a)所示，通过使用移液器或者其他定量仪器将其分装至125个八连管的井单元内，之后封装可以形成5μl的小体积封装的核酸检测试剂盒；如图1(b)所示，之后在执行扩增前打开封闭的八连管试剂盒，加入包含靶标基因的样本后，使井单元内包含20μl的待扩增混合液；如图1(c)所示，当执行扩增时使用盖体对包含待扩增混合液的试剂盒进行封闭，之后可以利用现有的pcr设备进行扩增。
[0099]
这样封装之后的扩增体系试剂体积较小，从表1的配置组分含量也可以看出，本发明的各组分试剂加入混合后只需要加入比较少量的水，此处加水量为不超过最终的扩增体系试剂总量的2/5，并且分装至每个井单元内的扩增体系试剂为5μl，而最终井单元内的待扩增混合液体积则超过了井单元内封装的扩增体系试剂体积的3倍达到了20μl，也就是扩增体系试剂体积不超过待扩增混合液体积的1/3。
[0100]
也可以采用另外一种实施方式，试剂自动化或者分装过程也可以直接采用精密的移液设备或者精密泵，向井单元内直接注入预定量的各种组分与水进而直接配置出小体积封装的扩增体系试剂，此处并不限定。本实施例示意的封装体积为5μl，其他实施方式也可以略大于或者略小于这一体积，例如4.5μl(当然最优地封装体积不小于4.5μl，过小的体积将导致加水量较少对于试剂混合后的均匀性存在挑战，也不利于长效稳定保存)、5.5μl、6μl等等。最终的待扩增混合液体积最优地选择为目前pcr扩增广泛采用的体积例如20μl或者50μl，如此能保证所有反应结果更可靠直观。更优选地，待扩增混合液中水的体积比扩增体系试剂中水的体积有100％-400％的增加，如此保证了虽然封装保存与常规液态试剂盒有较大差异，但是反应时两者类似，也避免了现场直接配置反应体系的繁冗和高专业度需求的问题。
[0101]
执行扩增时，将处理好的样本、阴性对照和阳性对照分别取15μl分别加入分装好的pcr反应管中的扩增体系试剂中，盖紧管盖，混匀离心后将pcr管按一定顺序放入荧光pcr扩增仪上，设置反应体系为20μl，按以下程序进行pcr扩增：预变性反应：95℃反应3min；扩增反应：95℃反应15s，63.5℃反应45s，45个循环。检测荧光选择：fam通道、cy5通道、hex通道、texas red通道。样本可以为样本原液、原液稀释液或经过提取设备提取获得的洗脱液。
[0102]
实施例2
[0103]
本实施例在实施例1的基础上，在扩增体系试剂中加入非离子型高分子化合物稳定剂，各组分按照下表2的方式进行混合，形成能用于分装1000个扩增体系试剂的待分装扩增体系试剂。
[0104]
表2待分装扩增体系试剂配比表
[0105]
组分规格用量(μl)靶标正向引物母液100μm50靶标反向引物母液100μm50靶标探针母液100μm30内标正向引物母液100μm30内标反向引物母液100μm30内标探针母液100μm30聚乙烯吡咯烷酮100mg/ml0.5-1(用量不计入总体积)聚合酶3u/μl4005b(+)工作液5
×
180010
×
buffer10
×
1100mgcl22m10tris工作液/600du plus dntp mixture10mm300h2o/570
[0106]
表2中不同组分的试剂预混形成的待分装扩增体系试剂能被分装为1000个扩增体系试剂，分装至125个八连管的井单元内，之后封装可以形成5μl的小体积封装的核酸检测试剂盒。
[0107]
实施例3
[0108]
本实施例实验组采用与实施例2相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，采用与实施例1相同的扩增检测方法以采集的全血样本为对象，对结直肠癌相关基因ugt1a1*6、ugt1a1*28、ugt1a1*93位点和内标基因进行扩增检测，每个靶标重复10次验证检测，实验组的结果如图2所示，扩增曲线ct值统计如下表3所示。
[0109]
由图2结果可以看出，本发明小体积封装的核酸检测试剂盒的所有检测结果均能正确无遗漏地识别出靶标基因，图中的扩增曲线形态也基本均呈现出了标准的s型扩增曲线，同时可以看出ct值对应的扩增起始位置也基本一致。
[0110]
表3本发明小体积封装试剂盒对结直肠癌相关基因检测结果ct值统计
[0111][0112]
为了比较本发明的小体积封装试剂盒的稳定性，对照组采用市售常规大体积液态化封装试剂盒对于相同的全血样本进行相同靶标的验证，其扩增曲线的ct值统计结果如下表4所示。
[0113]
表4大体积液态化封装试剂盒对结直肠癌相关基因检测结果ct值统计
[0114][0115][0116]
由表3和表4结果可知，本发明小体积封装的核酸检测试剂盒与市售常规大体积液态化试剂盒均能准确扩增该全血样本，重复10次的结果判读正确且一致，不同通道ct值的
cv均小于2％，也说明了本发明小体积封装的核酸检测试剂盒中各组分的浓度虽然较高，但是这种高浓度不会对不同试剂产生不可接受的破坏性影响，能达到与市售常规大体积液态化试剂盒相同的准确性检测。
[0117]
实施例4
[0118]
本实施例实验组采用与实施例2相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，对照组采用市售常规大体积液态化封装试剂盒，本发明的小体积封装的核酸检测试剂盒与市售常规大体积液态化封装试剂盒在相同生产时间和相同保存条件后，采用与实施例1相同的扩增检测方法对ugt1a1*28位点进行扩增检测，结果如图3所示。
[0119]
由图3结果可知，在ugt1a1*28位点检测时由于其具有结构类似度较高的其他位点干扰，与图3(b)采用市售常规大体积液态化封装试剂盒检测的结果相比，图3(a)采用本发明的小体积封装的核酸检测试剂盒检测的结果可复现性更强同时非特异较好，其检测结果曲线中右下角的非特异性扩增更少，因此结果受到的非特异性干扰更小，也表现出了更好的非特异性。
[0120]
实施例5
[0121]
本实施例实验组采用与实施例2相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，对照组采用市售常规大体积液态化封装试剂盒，本发明的小体积封装的核酸检测试剂盒与市售常规大体积液态化封装试剂盒在相同生产时间和相同保存条件后，采用与实施例1相同的扩增检测方法对polg c.3708g》t位点进行扩增检测，结果如图4所示。
[0122]
由图4结果可知，比较图4(a)采用本发明的小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果和图4(b)采用市售常规大体积液态化封装试剂盒检测结果，本发明的小体积封装的核酸检测试剂盒扩增曲线基本均呈现出了标准的s型形态，扩增的ct值也差异很小，曲线整体也比较聚拢，而相同时间生产的相同保存条件的市售常规大体积液态化，对于polg c.3708g》t位点的扩增则出现了部分扩增曲线呈现出不理想的近似直线的形态，整体也没有呈现出理想的s型形态。如此说明本发明的小体积封装的核酸检测试剂盒具有更高的稳定性也能适应更多的靶标基因检测，虽然扩增曲线中非特异性基因也有所扩增，但是整体而言对于检测结果基本没有影响。
[0123]
实施例6
[0124]
本实施例实验组采用与实施例2相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，对照组采用市售常规大体积液态化封装试剂盒，均于4℃保存72小时后，采用与实施例1相同的扩增检测方法对cypc9*3位点进行扩增检测，结果如图5所示。
[0125]
由图5结果可知，其中c01圈出的曲线簇为本发明的小体积封装核酸检测试剂盒经过4℃低温保存后的检测结果，c02圈出的曲线簇为市售常规大体积液态化封装试剂盒经过4℃低温保存后的检测结果；从这两种不同封装试剂盒的扩增结果可以看出，本发明的小体积封装的核酸检测试剂盒的扩增效率明显优于市售常规大体积液态化封装试剂盒，市售常规大体积液态化封装试剂盒的扩增ct值也明显推后。说明本发明的小体积封装的核酸检测试剂盒显示出了优异的耐低温保存特性，即本发明的小体积封装的核酸检测试剂盒在长期低温下的稳定性较高。
[0126]
实施例7
[0127]
本实施例实验组采用与实施例2相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，对照组采
用市售常规大体积液态化封装试剂盒，均在室温光照8小时后，采用与实施例1相同的扩增检测方法对kcnj11 c.67t》c位点进行扩增检测，结果如图6所示。
[0128]
由图6结果可知，其中c03圈出的曲线簇表示的是本发明的小体积封装核酸检测试剂盒经过较长时间光照影响下的扩增结果，c04圈出的曲线簇表示市售常规大体积液态化封装试剂盒经过较长时间光照影响下的扩增结果；可以发现虽然光照对于检测曲线的ct值影响较小，但是市售常规大体积液态化封装试剂盒在较长时间光照后扩增曲线的涨幅明显减小，而本发明的小体积封装核酸检测试剂盒受光照影响较小，扩增曲线的涨幅也很高，由此也证明了本发明的小体积封装核酸检测试剂盒具有更强的耐光性。
[0129]
实施例8
[0130]
本实施例采用与实施例1相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，在反复冻融1、3、5、8次之后，采用与实施例1相同的扩增检测方法对糖尿病相关基因cyp2c9 c.1075a》c、irs1c.2911g》a、kcnj11 c.67t》c位点进行扩增检测，结果如图7所示。
[0131]
由图7结果可知，本发明的小体积试剂盒在反复冻融次数过多时，检测曲线的形态越来越差，但在不超过3次的冻融其能实现较为可靠的检测。
[0132]
实施例9
[0133]
本实施例采用与实施例2相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，在反复冻融1、3、5、8次之后，采用与实施例1相同的扩增检测方法对糖尿病相关位点进行扩增检测，结果如图8所示。
[0134]
由图8结果可知，可以明显看出经过多次冻融，添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒仍能较为准确地给出检测结果，冻融次数增加，试剂盒的检测结果差异比较小，相比实施例8中图7结果而言，加入稳定剂后的小体积封装的核酸检测试剂盒更能适应反复冻融的极限保存状态，稳定性更高。
[0135]
实施例10
[0136]
本实施例实验组采用与实施例2相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，对照组采用与实施例1相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，采用与实施例1相同的扩增检测方法对精神类疾病相关基因cyp2c9 c.1075a》c、polg c.3708g》t、polg c.3428a》g位点进行扩增检测，结果如图9所示。
[0137]
由图9结果可知，其中9(a)为添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果，9(b)为不添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒检测结果，同一样本分别在添加稳定剂与不添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒中进行精神类疾病相关基因位点检测，可看出不添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒的个别通道扩增曲线为斜直线，荧光高度降低，且ct值较加稳定剂的体系推后，这一结果也说明了本发明添加稳定剂的小体积封装的核酸检测试剂盒具有更为广泛的适应性，能够适用于更多靶基因的稳定性检测。
[0138]
实施例11
[0139]
本实施例实验组采用与实施例2相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，对照组采用与实施例1相同的小体积封装的核酸检测试剂盒，均在37℃放置6天后，采用与实施例1相同的扩增检测方法对结直肠癌相关基因位点进行扩增检测，结果如图10所示。
[0140]
由图10结果可知，图10(a)为添加稳定剂的小体积封装核酸检测试剂盒的检测结
果，图10(b)为不添加稳定剂的小体积封装核酸检测试剂盒的检测结果。试剂盒进行破坏试验后，相同样本分别在添加稳定剂与不添加稳定剂的小体积封装核酸检测试剂盒中进行检测，可看出不添加稳定剂的小体积封装核酸检测试剂盒的部分样本扩增ct值推后，扩增曲线ct值分布弥散，这也说明了本发明添加稳定剂的小体积封装核酸检测试剂盒能够更稳定长效地保存，即使经过破坏性实验也能保证检测准确率更高、扩增效果更好的特性。
[0141]
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

技术特征：
1.一种小体积封装的核酸检测试剂盒，其特征在于，包括n个井单元，所述井单元内包含以第一体积封装的扩增体系试剂，加入含有靶标基因的样本后的所述井单元内包含第二体积的待扩增混合液；所述第一体积不超过第二体积的1/3。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一体积为4.5-6μl。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增体系试剂包括对应于靶标基因的靶标引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp和水。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述水的体积不超过第一体积的2/5；优选地，所述待扩增混合液中水的体积比扩增体系试剂中水的体积增加100％-400％。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增体系试剂还包括非离子型高分子化合物稳定剂；优选地，所述非离子型高分子化合物稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述非离子型高分子化合物稳定剂的体积与第一体积的体积百分比为0.01％-0.02％。7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述n为不小于1的整数。8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，n个所述井单元内包含的扩增体系试剂均以相同体积封装；优选为以相同的第一体积封装。9.一种如权利要求1-8中任意一项所述的小体积封装的核酸检测试剂盒的分装方法，其特征在于，包括如下(a)、(b)、(c)中任一所述的分装方法：(a)先将对应于靶标基因的引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp形成能用于分装不少于m个扩增体系试剂的反应液，再定量加入水，形成待分装扩增体系试剂，再将待分装扩增体系试剂以第一体积分别加入每一个所述井单元中，形成以第一体积封装的扩增体系试剂盒；所述m优选为不小于5的整数；或，(b)先向每一个所述井单元中分别加入包括对应于靶标基因的引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp的混合试剂，再向每一个所述井单元中分别补充加入水，形成以第一体积封装的扩增体系试剂盒；或，(c)将对应于靶标基因的引物探针组、内标引物探针组、聚合酶、5b(+)工作液、buffer、mgcl2、tris工作液、dntp和水依次分别加入每一个所述井单元内，形成以第一体积封装的扩增体系试剂盒。10.一种如权利要求1-8中任意一项所述的小体积封装的核酸检测试剂盒的核酸扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括：向所述井单元内分装好的扩增体系试剂中加入包含靶标基因的样本液，形成包含靶标基因的第二体积的待扩增混合液；使所述待扩增混合液在恒温或变温条件下进行扩增反应；优选地，所述扩增反应包括以下条件：(1)预变性反应：95℃反应3-5min；(2)扩增反应：95℃反应15s，63.5℃反应30-45s，45个循环。

技术总结
本发明属于基因检测技术领域，涉及一种小体积封装的核酸检测试剂盒及其分装方法和核酸扩增方法。一种小体积封装的核酸检测试剂盒，包括N个井单元，所述井单元内包含以第一体积封装的扩增体系试剂，加入含有靶标基因的样本后的所述井单元内包含第二体积的待扩增混合液；所述第一体积不超过第二体积的1/3。不需要对现有设备或者生产工艺进行复杂的改变，融合液态封装和冻干封装的综合优势，实现更长效稳定的保存。稳定的保存。稳定的保存。


技术研发人员：王鸿 邓波 范亮波 杨静静 张浩奇 石欣 李红东 苗保刚
受保护的技术使用者：西安天隆科技有限公司
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/20