一种益生菌微胶囊及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种益生菌微胶囊及其制备方法。


背景技术：

2.益生菌是一类能够对宿主健康产生有益作用的活性微生物，它能粘附定植在宿主肠道，通过与肠道致病菌竞争营养物质或发酵产生有机酸、细菌素、过氧化氢等物质来抑制致病菌生长，从而起到维持肠道微生态平衡和调节肠道功能的作用。随着人们保健意识的增强，益生菌在国内逐步进入迅猛发展的阶段，在保健食品、功能性食品、化妆品、医药等领域得到了广泛应用。不过，益生菌普遍具有高温高湿易失活，不耐酸、胆盐和自由基，贮藏期短的问题。
3.在益生菌粉的工业生产中，为了最大限度地维持菌体存活率，通常采用冷冻干燥法进行湿菌体的脱水处理，而在冻干过程中一般需要添加适量的保护剂，以减少菌体的死亡。但是，在运输、销售、贮存等过程中，裸露的菌体仍易受到环境、温湿度的影响而难以长时间存活。微胶囊技术是利用能够形成薄膜的包埋材料将芯材包裹在半透性或密封囊膜的微型胶囊，直径在1～5000μm范围内。微胶囊壁材可以作为屏障保护芯材免受外界环境、胃酸、胆盐等不良因素的影响，从而起到提高芯材的商业价值和经济价值的作用。中国专利申请号为202011579685.1公开了一种益生菌微胶囊及其制备方法和应用，所述益生菌微胶囊包含：益生菌、天然纤维和疏水性载体，其中，所述益生菌与天然纤维的质量比为0.4∶1～1.2∶1，制备方法包含以下步骤：(1)将益生菌分散在天然纤维中；(2)将步骤(1)所得混合物分散于疏水性载体中形成微胶囊；(3)将步骤(2)所得微胶囊干燥。缺陷：不溶性膳食纤维无良好的凝胶性和成膜性，壁材机械强度弱，稳定性差，且此方法获得的益生菌微胶囊安全性有待确认。中国专利申请号为201410652096.x公开了一种添加有益生元的益生菌微胶囊及制备方法所述芯材包括益生菌菌剂、益生元、中药提取液、脱脂乳粉，壁材为海藻酸钠与蛋白质壁材的混合物，比例为2:1，终浓度为3％-5％，蛋白质壁材为大豆蛋白或乳清蛋白。上述专利存在的缺陷为原料制备工艺要求严格，不易控制，很难应用于大生产；芯材配方复杂，易对益生菌造成多重破坏；另外，海藻酸钠制成的囊壳孔径较大，蛋白质难以弥补其缺陷而形成坚硬的外壳。目前，行业内的微胶囊技术普遍具有工艺复杂、不易规模化生产，且在制备以及冻干湿胶囊的过程中，由于是裸露的益生菌直接与壁材接触，容易造成部分益生菌失活，降低产品价值，导致成本增加。因此，上述问题急需解决。


技术实现要素：

4.本发明提供一种益生菌微胶囊及其制备方法，具体实施方式如下：
5.一种益生菌微胶囊，所述微胶囊包括由益生菌制成的芯材、由冻干保护剂制成的冻干保护层和由多糖制成的壁材，其中，冻干保护层介于芯材和壁材之间；
6.进一步的，微胶囊的直径为4-300μm；
7.进一步的，冻干保护层由麦绿素、菊粉、海藻糖三种冻干保护剂制成，所述壁材由
海藻酸钠、果胶、壳聚糖三种多糖组成；
8.进一步的，麦绿素、菊粉、海藻糖的质量用量比为(2-6):2:1；
9.进一步的，海藻酸钠和果胶的质量用量比为(9-30):1；
10.进一步的，益生菌选自植物乳杆菌、发酵乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或多种。
11.另，本发明还提供一种益生菌微胶囊的制备方法，将活菌浓度达到108cfu/g的益生菌菌悬液与冻干保护剂溶液按1:(1-2)的质量比例进行混合得到混合液a，混合液a与海藻酸钠果胶混合液按1:2的质量比例进行混合得到混合液b，将混合液b逐滴加入到壳聚糖溶液中，室温下搅拌30-50分钟，再静置1-2h后进行离心得到湿胶囊，将湿胶囊进行干燥即得益生菌微胶囊；
12.进一步的，冻干保护剂溶液的制备过程包括：将麦绿素、菊粉、海藻糖按(2-6):2:1的质量用量比混合，加入9-10倍去离子水，搅拌均匀制成冻干保护剂溶液；
13.进一步的，藻酸钠果胶混合液的制备过程包括：将海藻酸钠、果胶按(9-30):1的质量用量比混合，加入50-100倍去离子水，在35-45℃下搅拌20-40min得到海藻酸钠果胶混合溶液；
14.进一步的，壳聚糖溶液制备过程包括：以1％的冰醋酸为溶剂，加入壳聚糖，制成质量百分比为0.8-1.2％的壳聚糖溶液，在18-25℃的条件下，搅拌20-40min。
15.由于采用了以上技术方案，本发明的有益技术效果是：
16.1.本发明提供一种益生菌微胶囊，一方面，麦绿素作为天然活性物质与益生菌协同增效制备的微胶囊具有降低尿酸的功效，另一方面，在微胶囊冻干过程中麦绿素与菊粉和海藻糖作为冻干保护剂可以提高活菌载率，显著改善由于冷冻干燥造成的菌体细胞膜破裂和细胞过度失水而引起的菌体死亡；
17.2.本发明中海藻酸钠、果胶和壳聚糖协同作用，形成致密的聚电解质复合物微胶囊壁，保护菌体；
18.3.本发明还从麦绿素呈弱碱性的角度考虑，麦绿素作为冻干保护剂介于芯材和壁材之间，当益生菌微胶囊的壁材遇酸分解后，其可与部分胃酸中和，提高菌体对胃酸的耐受性，达到对菌体的“多层”保护作用。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.一种益生菌微胶囊，所述微胶囊包括由益生菌制成的芯材、由冻干保护剂制成的冻干保护层和由多糖制成的壁材，其中，冻干保护层介于芯材和壁材之间。微胶囊的直径为4-300μm。益生菌微胶囊在芯材和壁材之间增加了冻干保护层，增强微胶囊在生产、贮藏和消化等过程中益生菌的抗逆性和存活率。
21.具体地，冻干保护层由麦绿素、菊粉、海藻糖制成，所述壁材由海藻酸钠、果胶、壳聚糖组成。麦绿素在微胶囊中具有多重作用，其中一方面，麦绿素作为天然活性物质与益生
菌协同增效具有降低尿酸的功效，另一方面，在制备微胶囊的冻干过程中麦绿素与菊粉和海藻糖作为冻干保护剂可以提高活菌载率，显著改善由于冷冻干燥造成的菌体细胞膜破裂和细胞过度失水而引起的菌体死亡。本发明充分利用麦绿素的性能使得制备的微胶囊具有重要的降低尿酸的作用，同时制备的微胶囊冻干存活率、活菌率、贮藏稳定性等更高。
22.麦绿素作为绿色植物营养素，富含蛋白质以及多糖、植物黄酮、多酚类化合物等活性物质，研究表明，蛋白质可以在菌体细胞外形成一种保护膜，从而起到包裹菌体的作用；多糖的氢键能代替水与菌体细胞膜上的蛋白质结合，形成更稳定的空间结构；此外，麦绿素中的植物黄酮、多酚类物质具有抗氧化作用，可以阻隔氧、自由基对菌体的攻击，增加益生菌的抗逆性，延长货架期内益生菌的存活率。菊粉是一种水溶性膳食纤维，也是常用的益生元，可以在细胞膜周围形成玻璃态保护壳。而海藻糖具有较强的持水能力，可以进入细胞，阻止胞内结合水的过快过量流失，进而起到保护生物大分子结构和功能的作用。
23.海藻酸钠、果胶和壳聚糖协同作用，形成致密的外壳，保护菌体。海藻酸钠是一种天然多糖，因具有良好的胶凝性和热稳定性，成为微胶囊壁材最常用的材料之一，但海藻酸钠对酸敏感且具有多孔性，经过胃部时，胃酸易扩散到胶囊内部攻击芯材，因而在胃液条件下，微胶囊抗逆性降低，这也限制了其在益生菌微胶囊中的广泛应用。果胶广泛存在于果蔬等植物细胞壁中，具有良好的乳化性和成膜性，且对胃酸稳定，将果胶与海藻酸钠复配作为壁材，可以明显提高微胶囊对胃酸的耐受性。壳聚糖则可与海藻酸钠和果胶通过静电作用形成聚电解质复合物，对海藻酸钠和果胶进一步包覆，形成坚硬而致密的微胶囊外壳。
24.实施例1
25.益生菌微胶囊的制备方法：
26.(1)芯材的制备：无菌操作下，将低温保藏的植物乳杆菌和干酪乳杆菌菌种接种活化，然后接种在mrs液体培养基培养48h，在4℃、5000rmp条件下离心15min，得到菌体，用灭菌后的生理盐水重悬菌体得到菌悬液；
27.(2)冻干保护剂溶液制备：将麦绿素、菊粉、海藻糖按4:2:1的质量用量比混合，加入9倍去离子水，搅拌均匀制成冻干保护剂溶液，备用；具体地，所述麦绿素由大麦苗和青稞苗通过水浸提法制得；
28.(3)壁材的制备：海藻酸钠果胶混合液的制备：将海藻酸钠、果胶按20:1的质量用量比混合，加入70倍去离子水，在40℃、300r/min下搅拌30min，即得海藻酸钠果胶混合液；
29.壳聚糖溶液制备：以1％的冰醋酸为溶剂，加入壳聚糖，制成质量百分比为1％的壳聚糖溶液，在20℃、250r/min的条件下，搅拌30min；
30.(4)微胶囊制备：将益生菌菌悬液与冻干保护剂混合液按1:1的质量比例混合均匀得到混合液a，混合液a再与海藻酸钠果胶混合液按1:2的质量比例混合得到混合液b，10℃下搅拌40min；采用1ml注射器将混合液b逐滴加入到壳聚糖溶液中，室温下搅拌40min，置于-4℃静置固化1h，离心，收集湿胶囊；将湿胶囊在-20℃预冻24h，采用真空冷冻干燥制成益生菌微胶囊。
31.实施例2
32.益生菌微胶囊的制备方法：
33.(1)芯材的制备：无菌操作下，将低温保藏的发酵乳杆菌菌种接种活化，然后接种在mrs液体培养基培养48h，在4℃、5000rmp条件下离心15min，得到菌体，用灭菌后的生理盐
水重悬菌体得到菌悬液；
34.(2)冻干保护剂制备：将麦绿素、菊粉、海藻糖按2:2:1的质量用量比混合，加入10倍去离子水，搅拌均匀制成冻干保护剂溶液，备用；具体地，所述麦绿素由荞麦苗通过水浸提法制得；
35.(3)壁材材料的制备：海藻酸钠果胶混合液的制备：将海藻酸钠、果胶按9:1的质量用量比混合，加入80倍去离子水，在45℃、250r/min下搅拌20min，即得海藻酸钠果胶混合液；
36.壳聚糖溶液制备：以1％的冰醋酸为溶剂，加入壳聚糖，制成质量百分比为0.8％的壳聚糖溶液，在25℃、250r/min的条件下，搅拌20min；
37.(4)微胶囊制备：将益生菌菌悬液与冻干保护剂混合液按1:2的质量比例混合均匀得到混合液a，混合液a再与海藻酸钠果胶混合液按1:2的质量比例混合得到混合液b，15℃下搅拌30min；采用1ml注射器将混合液b逐滴加入到壳聚糖溶液中，室温下搅拌30min，置于-6℃静置固化1h，离心，收集湿胶囊；将湿胶囊在-20℃预冻24h，采用真空冷冻干燥制成益生菌微胶囊。
38.实施例3
39.益生菌微胶囊的制备方法：
40.(1)芯材的制备：无菌操作下，将低温保藏的双歧杆菌菌种接种活化，然后接种在mrs液体培养基培养48h，在4℃、5000rmp条件下离心15min，得到菌体，用灭菌后的生理盐水重悬菌体得到菌悬液；
41.(2)冻干保护剂制备：以去离子水为溶剂，将麦绿素、菊粉、海藻糖按6:2:1的质量用量比混合，加入9倍去离子水，搅拌均匀制成冻干保护剂溶液，备用；具体地，所述麦绿素由大麦苗通过水浸提法制得；
42.(3)壁材材料的制备：海藻酸钠果胶混合液的制备：将海藻酸钠、果胶按30:1的质量用量比混合，加入60倍去离子水，在35℃、300r/min下搅拌40min，即得海藻酸钠果胶混合液；
43.壳聚糖溶液制备：以1％的冰醋酸为溶剂，加入壳聚糖，制成质量百分比为1.2％的壳聚糖，在18℃、250r/min的条件下，搅拌40min；
44.(4)微胶囊制备：将益生菌菌悬液与冻干保护剂混合液按1:2的质量比例混合均匀得到混合液a，混合液a再与海藻酸钠果胶混合液按1:2的质量比例混合得到混合液b，10℃下搅拌40min；采用1ml注射器将混合液b逐滴加入到壳聚糖溶液中，室温下搅拌50min，置于-5℃静置固化1h，离心，收集湿胶囊；将湿胶囊在-20℃预冻24h，采用真空冷冻干燥制成益生菌微胶囊。
45.对比例1
46.与实施例1相比，冻干保护剂未加入麦绿素，且采用将海藻酸钠、果胶按5:1的质量用量比混合，加40倍水搅拌制成的海藻酸钠果胶溶液制作微胶囊壁，其他部分相同。
47.对比例2
48.与实施例1相比，麦绿素由青稞苗制得，冻干保护剂中麦绿素、菊粉和海藻糖质量用量比为2:1:1，壁材未加入果胶，其他部分相同。
49.对比例3
50.与实施例1相比，益生菌微胶囊中未加入冻干保护剂，其他部分相同。
51.分别对实施例1-3和对比例1-3制得益生菌微胶囊进行包埋率和存活率试验以及体外耐胃酸试验、耐胆盐试验以及耐贮藏性试验。
52.1、包埋率和存活率试验方法：
53.包埋率和存活率试验：将湿(干)益生菌微胶囊加入至3％柠檬酸钠溶液中，混合均匀后放置在恒温摇床中，速度和温度设置为180r/min，37
±
1℃，震荡60min，使益生菌微胶囊裂解，裂解后进行活菌计数，计算公式如下：
54.包埋率/％＝p1/p0
×
100
55.冻干存活率/％＝p2/p1
×
100
56.活菌率/％＝p2/p0
×
100
57.式中：p0为益生菌菌悬液总活菌数(cfu)；p1为湿胶囊总活菌数(cfu)；p2为干胶囊总活菌数(cfu)。
58.2、体外耐胃酸试验：
59.人工胃液制备：首先制备50ml 0.1mlo/l的盐酸溶液，取5g胃蛋白酶加入至8.2ml 0.1mlo/l的盐酸溶液中，加适量去离子水搅拌均匀，并定容至500ml容量瓶中，调节ph至2.0，最后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存，备用。
60.耐胃酸测试：分别称取1.0g实施例1-3和对比例1-3制备得到的微胶囊置于100ml锥形瓶中，加入50ml人工胃液，混合均匀后放置在恒温摇床中，速度和温度设置为180r/min，37
±
1℃，震荡100min，在测试进行至0、20、30、35、40、45、50、55、60min时分别取样测试各样品中的活菌数，确定益生菌完全释放时间及耐胃酸性能。
61.3、耐胆盐试验测定方法：
62.胆盐溶液制备：用灭菌生理盐水制备浓度为0.5％的胆盐溶液。耐胆盐测试：以0.5％的胆盐溶液为溶剂，称取适量实施例1-3和对比例1-3制备得到的微胶囊配置浓度为10％的微胶囊溶液，并置于37℃恒温培养箱培养4h，取出培养液测定活菌数，确定耐胆盐性能。
63.4、耐贮藏性试验：
64.将实施例1-3和对比例1-3制备得到的微胶囊分别置于37℃恒温培养箱中，放置30天，在第30天时取出适量样品，测定活菌数，并计算37℃贮存条件下的益生菌存活率。乳酸菌总数测定方法参考食品安全国家标准gb 4789.35-2016。
65.表1实施例1-3以及对比例1-3得到的益生菌微胶囊测试结果汇总
[0066][0067][0068]
由上表1的数据可以看出：添加冻干保护剂的益生菌微胶囊包埋率、冻干存活率、活菌率、耐酸和耐胆盐能力、贮藏稳定性更高。首先，37℃贮存30天后，添加冻干保护剂的益生菌微胶囊活菌数出现增长现象，原因是冻干保护剂中的麦绿素和菊粉能够促进益生菌的增殖；其次，海藻酸钠、果胶和壳聚糖协同作用，更好地包裹保护菌体，且麦绿素、菊粉和海藻糖作为冻干保护剂可以提高活菌载率，显著改善由于冷冻干燥造成的菌体死亡；最后，由海藻酸钠、果胶和壳聚糖制成的壳壁，能更好地延缓微胶囊在胃酸中的释放，同时，复配冻干保护剂能够提高益生菌耐胃酸、耐胆盐的能力，有效保护活菌顺利到达肠道。
[0069]
值得注意的是，冻干保护剂中麦绿素起到非常重要的作用，相比于未加麦绿素的微胶囊如对比例1和对比例3，益生菌冻干存活率和活菌率分别最高相差30％和35％，由此可见，加入麦绿素的益生菌微胶囊具有降低尿酸的功效，另外，益生菌微胶囊的冻干存活率、活菌率、耐酸和耐胆盐能力以及贮藏稳定性更高。
[0070]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种益生菌微胶囊，其特征在于，微胶囊包括由益生菌制成的芯材、由冻干保护剂制成的冻干保护层和由多糖制成的壁材，其中，冻干保护层介于芯材和壁材之间。2.根据权利要求1所述的一种益生菌微胶囊，其特征在于，所述微胶囊的直径为4-300μm。3.根据权利要求1所述的一种益生菌微胶囊，其特征在于，所述冻干保护层由麦绿素、菊粉、海藻糖三种冻干保护剂制成，所述壁材由海藻酸钠、果胶、壳聚糖三种多糖组成。4.根据权利要求3所述的一种益生菌微胶囊，其特征在于，所述麦绿素、菊粉、海藻糖的质量用量比为(2-6):2:1。5.根据权利要求3所述的一种益生菌微胶囊，其特征在于，海藻酸钠和果胶的质量用量比为(9-30):1。6.根据权利要求1所述的一种益生菌微胶囊，其特征在于，所述益生菌为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或多种。7.一种益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，将活菌浓度达到108cfu/g的益生菌菌悬液与冻干保护剂溶液按1:(1-2)的质量比例进行混合得到混合液a，混合液a与海藻酸钠果胶混合液按1:2的质量比例进行混合得到混合液b，将混合液b逐滴加入到壳聚糖溶液中，室温下搅拌30-50分钟，再静置1-2h后进行离心得到湿胶囊，将湿胶囊进行干燥即得益生菌微胶囊。8.根据权利要求7所述的一种益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，冻干保护剂溶液的制备过程包括：将麦绿素、菊粉、海藻糖按(2-6):2:1的质量用量比混合，加入9-10倍去离子水，搅拌均匀制成冻干保护剂溶液。9.根据权利要求7所述的一种益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠果胶混合液的制备过程包括：将海藻酸钠、果胶按(9-30):1的质量用量比混合，加入50-100倍去离子水，在35-45℃下搅拌20-40min得到海藻酸钠果胶混合溶液。10.根据权利要求7所述的一种益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，壳聚糖溶液制备过程包括：以1％的冰醋酸为溶剂，加入壳聚糖，制成质量百分比为0.8-1.2％的壳聚糖溶液，在18-25℃的条件下，搅拌20-40min。

技术总结
本发明提供一种益生菌微胶囊及其制备方法。一种益生菌微胶囊，所述微胶囊包括由益生菌制成的芯材、由冻干保护剂制成的冻干保护层和由多糖制成的壁材，其中，冻干保护层介于芯材和壁材之间。本发明的益生菌微胶囊所用冻干保护剂可通过协同作用减少菌体在冷冻和干燥过程中受到的损伤；所用壁材则可在菌体外形成对酸稳定、致密而坚硬的外壳，极大提升益生菌在生产、贮藏和消化等过程中的抗逆性和稳定性。本发明的益生菌微胶囊可用于制备食品、化妆品、药品、饲料。饲料。


技术研发人员：徐新月 刘坤 曾军英 张锦钰
受保护的技术使用者：杭州博可生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/20