补铁制剂的制备方法以及补铁制剂与流程

1.本发明涉及医药领域，更具体地讲，涉及一种补铁制剂的制备方法以及补铁制剂。


背景技术：

2.缺铁性贫血是指缺铁引起的小细胞低色素性贫血及其他异常，是全球最常见的营养障碍性疾病。据统计，在2016年，全球超过12亿人口患有缺铁性贫血，并且缺铁性贫血在学龄前儿童(小于5岁)、育龄妇女和孕妇中的发病率分别高达41.7％、32.8％和40.1％。缺铁性贫血的病因主要包括：
①
铁摄入不足，常见于幼儿、青少年、妊娠和哺乳期妇女；
②
铁丢失过多，主要由终末期肾病患者血液透析和慢性胃肠道失血等引起，多见于中老年人；
③
吸收障碍，常见于肠道功能紊乱患者和胃大部切除术患者等。
3.目前，临床上治疗缺铁性贫血的药物主要包括口服补铁制剂、静脉补铁制剂和促红细胞生成素。静脉补铁制剂包括右旋糖酐铁、葡萄糖酸铁钠、蔗糖铁和羧基麦芽糖等，其生物利用率高，胃肠道反应小，但安全性存在较大争议。欧洲药品管理局人用药品委员会认为，所有的静脉补铁制剂均可能出现过敏反应，存在铁过载、感染和静脉血栓等风险。促红细胞生成素治疗缺铁性贫血具有较大的局限性，在有些情况下依然需要进行铁补充治疗。促红细胞生成素还可能会导致血压升高，心血管疾病发作的风险增加，促进肿瘤生长和转移等。因此，静脉补铁制剂和促红细胞生成素都需要在具备急救设施的环境下使用，以确保可以紧急处理过敏反应等。
4.口服补铁制剂是目前临床上应用最广泛的补铁方式。口服补铁制剂的主要成分为二价铁，包括硫酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁和琥珀酸亚铁等，具有使用方便、效果直接、成本低和患者顺应性好等优点。但是，口服补铁制剂存在消化道不良反应发生率高和铁元素生物利用率较低的缺点，只有5％～20％的铁在十二指肠被吸收，而其余部分到达结肠，会引起肠道菌群紊乱，引发全身炎症和肠道感染。炎症会进一步导致致病菌比例增加和铁调素水平升高，减缓缺铁性贫血的治疗进程。
5.肠道菌群具有维护宿主免疫功能和稳定肠道机能的作用，是宿主重要的生物屏障，健康的肠道菌群维持着宿主与外部环境的动态平衡。口服补铁制剂在短时间内增加肠道内的铁含量，导致肠道菌群向致病性方向转变。口服补铁制剂对肠道菌群的影响主要包括：
①
改变肠道菌群组成，铁依赖细菌会通过铁载体吸收自由铁，并且能利用血红蛋白和转铁蛋白中的铁，促进自身增殖，其中致病菌增加尤为显著；
②
影响肠道菌群代谢，导致肠道细菌蛋白质发酵产生的有毒物质(如氨、h2s、支链脂肪酸、吲哚和酚类化合物等)增加；
③
增强致病菌的毒力，加快致病菌毒力因子的表达，提高致病菌在肠道内膜黏附和定植，抑制益生菌的增殖，增大侵入肠道上皮细胞并穿过肠道屏障的能力，引发炎症。
6.为了抑制口服补铁过程引发的病原菌过度增殖，临床上常用的方法是使用抗生素，如诺氟沙星、左氧氟沙星等。但抗生素的使用会对铁元素的吸收和肠道菌群带来严重的副作用。抗生素可能与补铁制剂形成不溶性金属螯合物，影响肠道对铁元素的吸收。抗生素会导致机体产生抗生素类药物性抗体，其与吸附药物的红细胞作用造成红细胞溶解而溶
血，进一步加重贫血。抗生素(尤其是广谱抗生素)会破坏肠道黏膜，损害肠道正常菌群的定植，不利于肠道稳态环境的维持。妊娠和哺乳期妇女服用抗生素还会影响新生儿的肠道菌群。过度使用抗生素，会使细菌产生耐药性，降低治疗效果，导致患病率和死亡率增加。
7.目前临床口服补铁治疗过程中迫切需要一种抗生素替代物进行肠道菌群调控，实现更加高效安全的口服补铁。因此，开发一种新型补铁制剂来治疗缺铁性贫血至关重要。
8.需要说明的是，以上背景技术部分所公开的信息仅用于增强对本发明背景的理解，因此其可能包含不构成对本领域技术人员已知的现有技术的信息。


技术实现要素：

9.为了解决现有技术中存在的上述问题中的一个或多个，本发明提供一种补铁制剂的制备方法以及补铁制剂。
10.本发明的补铁制剂的制备方法包括：步骤(i)，制备金纳米颗粒的浓度为200～1000μg/ml的金纳米颗粒溶液以及铁剂的浓度为3～50mg/ml的铁剂溶液；以及步骤(ii)，将上述金纳米颗粒溶液与上述铁剂溶液按照体积比为1～10:10～30的比例混合。
11.根据本发明一实施例，在上述步骤(i)中，上述金纳米颗粒溶液的浓度可以为200～800μg/ml，上述铁剂溶液的浓度可以为3～20mg/ml，在上述步骤(ii)中，上述金纳米颗粒溶液与上述铁剂溶液可以按照体积比为1～5:10～20的比例混合。
12.根据本发明一实施例，在上述步骤(i)中，可以在冰浴条件下，将还原剂、小分子配体和稳定剂溶于第一溶剂中，进行第一次混合，加入四水合氯金酸，进行第二次混合，用截留分子量为5000da的透析袋进行透析后，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，得到上述金纳米颗粒溶液，其中，上述第一溶剂可以为超纯水、甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇中的任意一种或多种，上述还原剂可以为柠檬酸钠、硼氢化钠、谷胱甘肽、水合肼、抗坏血酸中的任意一种或多种，上述小分子配体可以为4,6-二氨基-2巯基嘧啶、2,4-二氨基-6巯基嘧啶、4-巯基吡啶、2-巯基吡啶、4-巯基苯硼酸、5-(吡啶-3-基)-1,3,4-二唑-2-硫醇、5-(吡啶-4-基)-1,3,4-恶二唑-2-硫醇、喹啉-4-硫醇、3-巯基喹啉、4-氨基苯酚、5-氨基吲哚、色氨酸、4-氨基苯硼酸、6-氨基青霉烷酸、7-氨基头孢烷酸中的任意一种或多种，上述稳定剂可以为吐温20、吐温40、吐温80、平均分子量为8000的聚乙烯吡咯烷酮、平均分子量为10000的聚乙烯吡咯烷酮、平均分子量为24000的聚乙烯吡咯烷酮中的任意一种或多种。
13.根据本发明一实施例，在上述步骤(i)中，上述第一溶剂可以为超纯水，上述还原剂可以为硼氢化钠和/或谷胱甘肽，上述小分子配体可以为4,6-二氨基-2巯基嘧啶和/或5-氨基吲哚，上述稳定剂可以为吐温80。
14.根据本发明一实施例，在上述步骤(i)中，上述稳定剂的添加比例可以为：每20ml的上述第一溶剂中添加100～500μl的上述稳定剂，上述四水合氯金酸、上述还原剂与上述小分子配体的摩尔比可以为1～3：1～5：1～10。
15.根据本发明一实施例，在上述步骤(i)中，上述第一次混合可以是以200～500rpm的搅拌速率搅拌10～30分钟，上述第二次混合可以是以800～1200rpm的搅拌速率搅拌30～60分钟。
16.根据本发明一实施例，在上述步骤(i)中，可以通过将铁剂溶解于第二溶剂中后，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤来得到上述铁剂溶液，其中，上述铁剂可以为硫酸
亚铁、富马酸亚铁、右旋糖酐铁、葡萄糖酸铁、琥珀酸亚铁、乳酸亚铁中的任意一种或多种，上述第二溶剂可以是去离子水、磷酸盐缓冲液、质量分数为0.9％的氯化钠水溶液中的任意一种。
17.根据本发明一实施例，在上述步骤(i)中，上述铁剂可以为硫酸亚铁和/或葡萄糖酸铁，上述第二溶剂可以是去离子水。
18.本发明还提供一种补铁制剂，该补铁制剂是通过上述补铁制剂的制备方法制备而成。
19.根据本发明一实施例，上述补铁制剂可以是口服补铁制剂。
20.根据本发明提供的一种补铁制剂的制备方法以及补铁制剂，能够克服现有口服补铁制剂对肠道菌群的副作用，降低炎症，实现更加高效安全的补铁。
具体实施方式
21.以下通过具体实施例对本发明进行详细描述，以使本领域普通技术人员能够容易地根据本说明书公开的内容实施本发明。以下所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而非全部。基于本说明书所描述的实施例，本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不发生冲突的情况下，本说明书中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
22.本发明的发明人发现，如果在补铁制剂中采用金纳米颗粒来替代以往的抗生素，那么就能够有效调控肠道菌群，促进有益菌的增殖，减少有害菌的定植，降低肠道感染的发生，降低传统的口服补铁制剂对肠道菌群的影响。据此完成了本发明。
23.具体来说，本发明的补铁制剂的制备方法包括：制备金纳米颗粒浓度为200～1000μg/ml的金纳米颗粒溶液和铁剂的浓度为3～50mg/ml的铁剂溶液的步骤，以及将金纳米颗粒溶液与铁剂溶液按照体积比为1～10:10～30的比例混合的步骤。
24.通过该方法制备出补铁制剂，能够克服现有口服补铁制剂对肠道菌群的副作用，降低炎症，实现更加高效安全的补铁。
25.其中，金纳米颗粒溶液的浓度优选为200～800μg/ml，这是由于，如果金纳米颗粒的浓度低于200μg/ml，则无法实现对肠道菌群的正向调控，如果金纳米颗粒的浓度超过800μg/ml，则代谢时间增加，对肝脏和肾脏的负担加重，因此不优选。
26.另外，铁剂溶液的浓度优选为3～20mg/ml，这是由于，如果铁剂浓度低于3mg/ml，则不利于缺铁性贫血的恢复，补铁效果不佳，如果铁剂的浓度大于20mg/ml，过量的补铁制剂会导致可能会导致严重的副作用出现(肠道感染、炎症等)，不利于后续的治疗，因此不优选。
27.另外，由于如果口服过量的金纳米颗粒和少量铁剂，那么缺铁性贫血恢复缓慢，金颗粒代谢时间延长；而口服少量的金纳米颗粒和大量补铁制剂，会导致肠道补铁制剂积累过剩，导致肠道菌群紊乱、肠道炎症发生，太少的金纳米颗粒无法实现肠道微生态的正向调节。只有金纳米颗粒和补铁制剂口服比例恰当，才可以实现高效补铁的同时维持肠道微环境的稳态。金纳米颗粒溶液与铁剂溶液混合的体积比1～10:10～30即可，优选为1～5:10～20。
28.进一步来说，本发明的发明人进一步首次发现，如果金纳米颗粒是特定的小分子
修饰的金纳米颗粒，将其与铁剂联合使用制成补铁制剂，那么不仅能够有效调控肠道菌群，促进有益菌的增殖，减少有害菌的定植，降低肠道感染的发生，降低传统的口服补铁制剂对肠道菌群的影响，还能够进一步促进提高铁元素的吸收率，加速缺铁性贫血的恢复。
29.具体来说，本发明的金纳米颗粒溶液可以通过以下方法来制备：将还原剂、小分子配体和稳定剂溶于第一溶剂中，温和搅拌一段时间(以下也称为第一次混合)，然后加入四水合氯金酸，剧烈搅拌一段时间(以下也称为第二次混合)，收集溶液，用截留分子量为5000da的透析袋进行透析，最后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，得到金纳米颗粒溶液。
30.其中，第一溶剂可以是超纯水、甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇中的任意一种或多种。优选第一溶剂为超纯水，这是因为，后续制备的金颗粒需要透析和口服，用超纯水做溶剂更容易透析彻底，除掉未反应的配体，也更适用于口服治疗。
31.另外，还原剂可以为柠檬酸钠、硼氢化钠、谷胱甘肽、水合肼、抗坏血酸中的任意一种或多种。优选还原剂为硼氢化钠和/或谷胱甘肽，这是因为，硼氢化钠和谷胱甘肽的还原性更强，有利于制备尺寸较小的金纳米颗粒(5-30nm)。
32.另外，小分子配体可以为4,6-二氨基-2巯基嘧啶(dapt)、2,4-二氨基-6巯基嘧啶(ldapt)、4-巯基吡啶(4-p)、2-巯基吡啶(2-p)、4-巯基苯硼酸(4-mba)、5-(吡啶-3-基)-1,3,4-二唑-2-硫醇(5-3-po)、5-(吡啶-4-基)-1,3,4-恶二唑-2-硫醇(5-4-po)、喹啉-4-硫醇(q4t)、3-巯基喹啉(3-q)、4-氨基苯酚(4-ap)、5-氨基吲哚(5-ai)、色氨酸(w)、4-氨基苯硼酸(4-aba)、6-氨基青霉烷酸(6-apa)、7-氨基头孢烷酸(7-aca)中的任意一种或多种。优选小分子配体为4,6-二氨基-2巯基嘧啶(dapt)和/或5-氨基吲哚(5-ai)，这是因为，dapt和5-ai修饰的金纳米颗粒带正电荷，有利于肠道菌群的正向调控，有利于降低肠道炎症。
33.另外，稳定剂可以为吐温20、吐温40、吐温80、聚乙烯吡咯烷酮(average mw＝8000)、聚乙烯吡咯烷酮(average mw＝10000)、聚乙烯吡咯烷酮(average mw＝24000)中的任意一种或多种。由于吐温80 的生物安全性好，溶血率低，还可以使金纳米颗粒更长时间地稳定分散，因此优选稳定剂为吐温80。
34.另外，在制备金纳米颗粒溶液时，稳定剂的添加比例可以为：每20ml的第一溶剂中添加100～500μl的稳定剂。但是，由于如果每20ml的第一溶剂中添加的稳定剂超过200μl，则乳化效果太强，泡沫增多，而且不利于透析；而稳定剂的用量低于100μl，则稳定效果不明显，容易出现颗粒团聚的现象，因此，优选每20ml的第一溶剂中添加100～200μl的稳定剂。
35.另外，在第一溶剂中添加的四水合氯金酸、还原剂与小分子配体的摩尔比可以为1～3：1～5：1～10。
36.另外，在制备金纳米颗粒溶液时，第一次混合可以是以200～500rpm的搅拌速率搅拌10～30分钟。考虑到如果第一混合的搅拌时间少于15min，则可能导致溶质混合不均匀，溶解不充分，如果搅拌时间大于25min，因稳定剂的存在可能导致稳定剂产生大量泡沫。而且，如果第一混合的搅拌速率低于300rpm，则溶质溶解缓慢，大于400rpm则很容易出现大量泡沫。因此，优选第一次混合为以300～400rpm的搅拌速率搅拌15～25分钟。
37.在制备金纳米颗粒溶液时，第二次混合可以是以800～1200rpm的搅拌速率搅拌30～60分钟。考虑到如果第二次混合的搅拌时间低于30分钟，搅拌速率低于1000rpm，则金纳米颗粒分散不均匀，容易团聚；如果搅拌时间大于40min，搅拌速率高于1200rpm，耗能增加，
且不利于金纳米颗粒的生长。因此，优选第二次混合为以1000～1200rpm的搅拌速率搅拌30～40分钟。
38.本发明的铁剂溶液可以通过以下方法来制备：将铁剂溶解于第二溶剂中后，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤来得到铁剂溶液。
39.其中，铁剂可以为硫酸亚铁、富马酸亚铁、右旋糖酐铁、葡萄糖酸铁、琥珀酸亚铁、乳酸亚铁中的任意一种或多种。考虑到硫酸亚铁是典型的无机酸亚铁盐，葡萄糖酸铁是典型的有机酸亚铁盐，并且，硫酸亚铁适用范围更广，是临床上口服补铁的首要选择，而且铁含量高；而葡萄糖酸铁的铁含量较低，易于吸收，且对胃肠道刺激较小。因此，优选铁剂为硫酸亚铁和/或葡萄糖酸铁。
40.另外，第二溶剂可以是去离子水、磷酸盐缓冲液(pbs)、质量分数为0.9％的氯化钠水溶液中的任意一种。第二溶剂优选为去离子水，如此能够避免其他离子的干扰。
41.应予说明，在本发明中，金纳米颗粒溶液和铁剂溶液在混合制备成补铁制剂前，优选均分别用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，这是因为，0.22微米的微孔滤膜过滤器可以达到药典规定的除菌99.99％的要求。如果孔径大于0.22微米，存在微生物过滤不完全的风险，不适用于口服；如果孔径过小，则过滤的阻力也会变大，因此采用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，完全可以满足无菌及口服的要求。
42.另外，优选制备好的金纳米颗粒溶液在低温下保存备用，具体来说，优选在4℃下保存备用。这是因为，此时溶液中的金纳米颗粒的浓度较高，将其保存低温下，可以防止金纳米颗粒聚集沉降，使金纳米颗粒溶液更加稳定。当将金纳米颗粒溶液与铁剂溶液混合后，金纳米颗粒的浓度相对降低，因此制备好的补铁制剂无需低温保存。
43.下面通过实施例1～8，对本发明的技术方案和技术效果进行更加详细地说明。
44.应予说明，本发明中所采用的sd大鼠缺铁性贫血模型的建立主要是以铁缺乏模型饲料喂养30-40天使sd雌性大鼠形成贫血。优选造模时间为35天，优选大鼠为21天断乳sd雌性大鼠。另外，在对sd大鼠缺铁性贫血模型进行灌胃处理时，灌胃时间为7～21天，优选灌胃时间为7～14天。
45.实施例1
46.将0.06mmol的硼氢化钠、0.06mmol dapt和100μl的吐温80溶于20ml超纯水中，并加入到50ml圆底烧瓶，置于冰浴中，以300rpm的速率搅拌15min，然后加入0.06mmol四水合氯金酸，以1000rpm的速率搅拌30min，收集溶液，并用截留分子量为5000da的透析袋进行透析，最后用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，将收集得到dapt修饰的金纳米颗粒(dapt-au nps)溶液保存于4℃备用。对实施例1制备的小分子配体修饰的金纳米颗粒的粒径、浓度分别使用纳米粒度仪、电感耦合等离子质谱仪进行表征，结果为制备得到的dapt-au nps的水合粒径为15
±
1.2nm，dapt-au nps溶液的浓度为650μg/ml。
47.将5mg的硫酸亚铁溶解于1ml去离子水中，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤得到补铁制剂溶液。将dapt-au nps溶液与硫酸亚铁溶液按照体积比1:10的比例混合。得到本发明实施例1的补铁制剂。
48.取1.1ml实施例1的补铁制剂(应予说明，此处的1.1ml是指100μl的dapt-au nps溶液与1ml的硫酸亚铁溶液混合得到的量，为了便于描述，统称为“1.1ml”，但是实际操作中，因两种溶液混合会导致混合后的溶液体积有些许偏差。下面的实施例2～8与此情况相同，
在后文中不再赘述)对35天的缺铁性贫血断乳sd雌性大鼠进行7天灌胃治疗并设置为联合治疗组，另外分别设置正常大鼠、缺铁性贫血大鼠、单独口服100μl的dapt-au nps溶液的缺铁性贫血大鼠、单独口服1ml的硫酸亚铁溶液的缺铁性贫血大鼠为对照组，治疗结束后采集血液和新鲜粪便，分别用于血常规、炎症因子和肠道菌群的检测。
49.采集到的全血、离心得到的血清和新鲜粪便分别使用动物血常规检测仪、elisa试剂盒和16s rrna测序进行表征，其中，红细胞数目的正常范围为6.36～9.42
×
10
12
/l，血红蛋白正常范围为110～143g/l，得到如下测试结果。
50.表1：实施例1的动物实验结果
[0051][0052]
由表1可知，相比于单独治疗，利用实施例1的补铁制剂显著地提高了血液中rbc和hgb的含量，有效的促进了缺铁性贫血的恢复；同时利用实施例1的补铁制剂降低了血清中促炎因子tnf-α的含量，增加了抗炎因子il-10的含量，有效的降低了炎症的发生；其次，利用实施例1的补铁制剂减少了条件致病菌escherichia-shigella和enterococcus的丰度，促进了butyricicoccus和lactobacillus的定植，有利于维持肠道微生态，减少了细菌对铁元素的竞争，促进宿主对铁元素的吸收。
[0053]
实施例2
[0054]
将0.18mmol的硼氢化钠、0.06mmol dapt和200μl的吐温80溶于20ml超纯水中，并加入到50ml圆底烧瓶，置于冰浴中，以400rpm的速率搅拌20min，然后加入0.12mmol四水合氯金酸，以1200rpm的速率搅拌30min，收集溶液，并用截留分子量为5000da的透析袋进行透析，最后用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，将收集得到dapt修饰的金纳米颗粒(dapt-au nps)溶液保存于4℃备用。对实施例2制备的小分子配体修饰的金纳米颗粒的粒径、浓度分别使用纳米粒度仪、电感耦合等离子质谱仪进行表征，结果为制备得到的dapt-au nps的水合粒径为10
±
2.3nm，收集得到的溶液浓度为700μg/ml。
[0055]
将10mg的硫酸亚铁溶解于1ml去离子水中，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤得到补铁制剂溶液。将dapt-au nps溶液与硫酸亚铁溶液按照体积比1:20的比例混合。得到本发明实施例2的补铁制剂。
[0056]
取1.05ml实施例2的补铁制剂对35天的断乳sd雌性大鼠缺铁性贫血模型进行14天灌胃治疗，并分别设置正常大鼠、缺铁性贫血大鼠、单独口服50μl的dapt-au nps溶液的缺铁性贫血大鼠、单独口服1ml的硫酸亚铁溶液的缺铁性贫血大鼠为对照组，治疗结束后采集血液和新鲜粪便，分别用于血常规、炎症因子和肠道菌群的检测。
[0057]
采集到的全血、离心得到的血清和新鲜粪便分别使用动物血常规检测仪、elisa试剂盒和16s rrna测序进行表征，其中，红细胞数目的正常范围为6.36～9.42
×
10
12
/l，血红蛋白正常范围为110～143g/l，得到如下测试结果。
[0058]
表2：实施例2的动物实验结果
[0059][0060]
由表2可知，相比于单独治疗，利用实施例2的补铁制剂显著地提高了血液中rbc和hgb的含量，有效的促进了缺铁性贫血的恢复；同时利用实施例2的补铁制剂降低了血清中促炎因子tnf-α的含量，增加了抗炎因子il-10的含量，有效的降低了炎症的发生；其次，利用实施例2的补铁制剂减少了条件致病菌escherichia-shigella和enterococcus的丰度，促进了butyricicoccus和lactobacillus的定植，有利于维持肠道微生态，减少了细菌对铁元素的竞争，促进宿主对铁元素的吸收。
[0061]
实施例3
[0062]
将0.06mmol的硼氢化钠、0.06mmol dapt和100μl的吐温80溶于20ml超纯水中，并加入到50ml圆底烧瓶，置于冰浴中，以300rpm的速率搅拌15min，然后加入0.12mmol四水合氯金酸，以1000rpm的速率搅拌30min，收集溶液，并用截留分子量为5000da的透析袋进行透析，最后用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，将收集得到dapt修饰的金纳米颗粒(dapt-au nps)溶液保存于4℃备用。对实施例3制备的小分子配体修饰的金纳米颗粒的粒径、浓度分别使用纳米粒度仪、电感耦合等离子质谱仪进行表征，结果为制备得到的dapt-au nps的水合粒径为19
±
1.8nm，收集得到的溶液浓度为600μg/ml。
[0063]
将5mg的葡萄糖酸铁溶解于1ml去离子水中，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤得到补铁制剂溶液。将dapt-au nps溶液与硫酸亚铁溶液按照体积比2:10的比例混合。得到本发明实施例3的补铁制剂。
[0064]
取1.2ml实施例3的补铁制剂对35天的断乳sd雌性大鼠缺铁性贫血模型进行7天灌胃治疗，并分别设置正常大鼠、缺铁性贫血大鼠、单独口服200μl的dapt-au nps溶液的缺铁性贫血大鼠、单独口服1ml的葡萄糖酸铁溶液的缺铁性贫血大鼠为对照组，治疗结束后采集血液和新鲜粪便，分别用于血常规、炎症因子和肠道菌群的检测。
[0065]
采集到的全血、离心得到的血清和新鲜粪便分别使用动物血常规检测仪、elisa试剂盒和16s rrna测序进行表征，其中红细胞数目的正常范围为6.36～9.42
×
10
12
/l，血红蛋白正常范围为110～143g/l，得到如下测试结果。
[0066]
表3：实施例3的动物实验结果
[0067][0068]
由表3可知，相比于单独治疗，利用实施例3的补铁制剂提高了血液中rbc和hgb的含量，有效的促进了缺铁性贫血的恢复；同时利用实施例3的补铁制剂降低了血清中促炎因子tnf-α的含量，增加了抗炎因子il-10的含量，有效的降低了炎症的发生；其次，利用实施例3的补铁制剂减少了条件致病菌escherichia-shigella和enterococcus的丰度，促进了butyricicoccus和lactobacillus的定植，有利于维持肠道微生态，减少了细菌对铁元素的竞争，促进宿主对铁元素的吸收。
[0069]
实施例4
[0070]
将0.18mmol的硼氢化钠、0.06mmol dapt和100μl的吐温80溶于20ml超纯水中，并加入到50ml圆底烧瓶，置于冰浴中，以400rpm的速率搅拌25min，然后加入0.12mmol四水合氯金酸，以1200rpm的速率搅拌40min，收集溶液，并用截留分子量为5000da的透析袋进行透析，最后用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，将收集得到dapt修饰的金纳米颗粒(dapt-au nps)溶液保存于4℃备用。对实施例4制备的小分子配体修饰的金纳米颗粒的粒径、浓度分别使用纳米粒度仪、电感耦合等离子质谱仪进行表征，结果为制备得到的dapt-au nps的水合粒径为8
±
0.9nm，收集得到的溶液浓度为500μg/ml。
[0071]
将10mg的葡萄糖酸铁溶解于1ml去离子水中，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤得到补铁制剂溶液。将dapt-au nps溶液与葡萄糖酸铁溶液按照体积比2:15的比例混合。得到本发明实施例4的补铁制剂。
[0072]
取1.7ml实施例4的补铁制剂对35天的断乳sd雌性大鼠缺铁性贫血模型进行14天灌胃治疗，并分别设置正常大鼠、缺铁性贫血大鼠、单独口服200μl的dapt-au nps溶液的缺铁性贫血大鼠、单独口服1.5ml的葡萄糖酸铁溶液的缺铁性贫血大鼠为对照组，治疗结束后采集血液和新鲜粪便，分别用于血常规、炎症因子和肠道菌群的检测。
[0073]
采集到的全血、离心得到的血清和新鲜粪便分别使用动物血常规检测仪、elisa试剂盒和16s rrna测序进行表征，其中红细胞数目的正常范围为6.36～9.42
×
10
12
/l，血红蛋白正常范围为110～143g/l，得到如下测试结果。
[0074]
表4：实施例4的动物实验结果
[0075][0076]
由表4可知，相比于单独治疗，利用实施例4的补铁制剂提高了血液中rbc和hgb的含量，有效的促进了缺铁性贫血的恢复；同时利用实施例4的补铁制剂降低了血清中促炎因子tnf-α的含量，增加了抗炎因子il-10的含量，有效的降低了炎症的发生；其次，利用实施例4的补铁制剂减少了条件致病菌escherichia-shigella和enterococcus的丰度，促进了butyricicoccus和lactobacillus的定植，有利于维持肠道微生态，减少了细菌对铁元素的竞争，促进宿主对铁元素的吸收。
[0077]
实施例5
[0078]
将0.06mmol的硼氢化钠、0.06mmol 5-ai和100μl的吐温80溶于20ml超纯水中，并加入到50ml圆底烧瓶，置于冰浴中，以300rpm的速率搅拌15min，然后加入0.06mmol四水合氯金酸，以1000rpm的速率搅拌30min，收集溶液，并用截留分子量为5000da的透析袋进行透析，最后用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，将收集得到5-ai修饰的金纳米颗粒(5-ai-au nps)溶液保存于4℃备用。对实施例5制备的小分子配体修饰的金纳米颗粒的粒径、浓度分别使用纳米粒度仪、电感耦合等离子质谱仪进行表征，结果为制备得到的5-ai-au nps的水合粒径为25
±
1.2nm，收集得到的溶液浓度为400μg/ml。
[0079]
将5mg的硫酸亚铁溶解于1ml去离子水中，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤得到补铁制剂溶液。将5-ai-au nps溶液与硫酸亚铁溶液按照体积比1:10的比例混合。得到本发明实施例5的补铁制剂。
[0080]
取1.1ml实施例5的补铁制剂对35天的断乳sd雌性大鼠缺铁性贫血模型进行7天灌胃治疗，并分别设置正常大鼠、缺铁性贫血大鼠、单独口服100μl的5-ai-au nps溶液的缺铁性贫血大鼠、单独口服1ml的硫酸亚铁溶液的缺铁性贫血大鼠为对照组，治疗结束后采集血液和新鲜粪便，分别用于血常规、炎症因子和肠道菌群的检测。
[0081]
采集到的全血、离心得到的血清和新鲜粪便分别使用动物血常规检测仪、elisa试剂盒和16s rrna测序进行表征，其中红细胞数目的正常范围为6.36～9.42
×
10
12
/l，血红蛋白正常范围为110～143g/l，得到如下测试结果。
[0082]
表5：实施例5的动物实验结果
[0083][0084]
由表5可知，相比于单独治疗，利用实施例5的补铁制剂显著地提高了血液中rbc和hgb的含量，有效的促进了缺铁性贫血的恢复；同时利用实施例5的补铁制剂降低了血清中促炎因子tnf-α的含量，增加了抗炎因子il-10的含量，有效的降低了炎症的发生；其次，利用实施例5的补铁制剂减少了条件致病菌escherichia-shigella和enterococcus的丰度，促进了butyricicoccus和lactobacillus的定植，有利于维持肠道微生态，减少了细菌对铁元素的竞争，促进宿主对铁元素的吸收。
[0085]
实施例6
[0086]
将0.18mmol的谷胱甘肽、0.06mmol 5-ai和200μl的吐温80溶于20ml超纯水中，并加入到50ml圆底烧瓶，置于冰浴中，以400rpm的速率搅拌20min，然后加入0.12mmol四水合氯金酸，以1200rpm的速率搅拌30min，收集溶液，并用截留分子量为5000da的透析袋进行透析，最后用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，将收集得到5-ai修饰的金纳米颗粒(5-ai-au nps)溶液保存于4℃备用。对实施例6制备的小分子配体修饰的金纳米颗粒的粒径、浓度分别使用纳米粒度仪、电感耦合等离子质谱仪进行表征，结果为制备得到的5-ai-au nps的水合粒径为12
±
0.8nm，收集得到的溶液浓度为750μg/ml。
[0087]
将10mg的硫酸亚铁溶解于1ml去离子水中，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤得到补铁制剂溶液。将5-ai-au nps溶液与硫酸亚铁溶液按照体积比1:20的比例混合。得到本发明实施例6的补铁制剂。
[0088]
取1.05ml实施例6的补铁制剂对35天的断乳sd雌性大鼠缺铁性贫血模型进行14天灌胃治疗，并分别设置正常大鼠、缺铁性贫血大鼠、单独口服50μl的5-ai-au nps溶液的缺铁性贫血大鼠、单独口服1ml的硫酸亚铁溶液的缺铁性贫血大鼠为对照组，治疗结束后采集血液和新鲜粪便，分别用于血常规、炎症因子和肠道菌群的检测。
[0089]
采集到的全血、离心得到的血清和新鲜粪便分别使用动物血常规检测仪、elisa试剂盒和16s rrna测序进行表征，其中红细胞数目的正常范围为6.36～9.42
×
10
12
/l，血红蛋白正常范围为110～143g/l，得到如下测试结果。
[0090]
表6：实施例6的动物实验结果
[0091][0092]
由表6可知，相比于单独治疗，利用实施例6的补铁制剂显著地提高了血液中rbc和hgb的含量，有效的促进了缺铁性贫血的恢复；同时利用实施例6的补铁制剂降低了血清中促炎因子tnf-α的含量，增加了抗炎因子il-10的含量，有效的降低了炎症的发生；其次，利用实施例6的补铁制剂减少了条件致病菌escherichia-shigella和enterococcus的丰度，促进了butyricicoccus和lactobacillus的定植，有利于维持肠道微生态，减少了细菌对铁元素的竞争，促进宿主对铁元素的吸收。
[0093]
实施例7
[0094]
将0.06mmol的硼氢化钠、0.06mmol 5-ai和100μl的吐温80溶于20ml超纯水中，并加入到50ml圆底烧瓶，置于冰浴中，以300rpm的速率搅拌15min，然后加入0.12mmol四水合氯金酸，以1000rpm的速率搅拌30min，收集溶液，并用截留分子量为5000da的透析袋进行透析，最后用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，将收集得到5-ai修饰的金纳米颗粒(5-ai-au nps)溶液保存于4℃备用。对实施例7制备的小分子配体修饰的金纳米颗粒的粒径、浓度分别使用纳米粒度仪、电感耦合等离子质谱仪进行表征，结果为制备得到的5-ai-au nps的水合粒径为25
±
2.4nm，收集得到的溶液浓度为700μg/ml。
[0095]
将5mg的葡萄糖酸铁溶解于1ml去离子水中，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤得到补铁制剂溶液。将5-ai-au nps溶液与葡萄糖酸铁溶液按照体积比2:10的比例混合。得到本发明实施例7的补铁制剂。
[0096]
取1.2ml实施例7的补铁制剂对35天的断乳sd雌性大鼠缺铁性贫血模型进行7天灌胃治疗，并分别设置正常大鼠、缺铁性贫血大鼠、单独口服200μl的5-ai-au nps溶液的缺铁性贫血大鼠、单独口服1ml的葡萄糖酸铁溶液的缺铁性贫血大鼠为对照组，治疗结束后采集血液和新鲜粪便，分别用于血常规、炎症因子和肠道菌群的检测。
[0097]
采集到的全血、离心得到的血清和新鲜粪便分别使用动物血常规检测仪、elisa试剂盒和16s rrna测序进行表征，得到如下测试结果。
[0098]
表7：实施例7的动物实验结果
[0099][0100]
由表7可知，相比于单独治疗，利用实施例7的补铁制剂提高了血液中rbc和hgb的含量，有效的促进了缺铁性贫血的恢复；同时利用实施例7的补铁制剂降低了血清中促炎因子tnf-α的含量，增加了抗炎因子il-10的含量，有效的降低了炎症的发生；其次，利用实施例7的补铁制剂减少了条件致病菌escherichia-shigella和enterococcus的丰度，促进了butyricicoccus和lactobacillus的定植，有利于维持肠道微生态，减少了细菌对铁元素的竞争，促进宿主对铁元素的吸收。
[0101]
实施例8
[0102]
将0.18mmol的谷胱甘肽、0.06mmol 5-ai和100μl的吐温80溶于20ml超纯水中，并加入到50ml圆底烧瓶，置于冰浴中，以400rpm的速率搅拌25min，然后加入0.12mmol四水合氯金酸，以1200rpm的速率搅拌40min，收集溶液，并用截留分子量为5000da的透析袋进行透析，最后用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，将收集得到5-ai修饰的金纳米颗粒(5-ai-au nps)溶液保存于4℃备用。对实施例8制备的小分子配体修饰的金纳米颗粒的粒径、浓度分别使用纳米粒度仪、电感耦合等离子质谱仪进行表征，制备得到的5-ai-au nps的水合粒径为5
±
1.2nm，收集得到的溶液浓度为500μg/ml。
[0103]
将10mg的葡萄糖酸铁溶解于1ml去离子水中，用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤得到补铁制剂溶液。将5-ai-au nps溶液与葡萄糖酸铁溶液按照体积比2:15的比例混合。得到本发明实施例8的补铁制剂。
[0104]
取1.7ml实施例8的补铁制剂对35天的断乳sd雌性大鼠缺铁性贫血模型进行14天
灌胃治疗，并分别设置正常大鼠、缺铁性贫血大鼠、单独口服200μl的5-ai-au nps溶液的缺铁性贫血大鼠、单独口服1.5ml的硫酸亚铁溶液的缺铁性贫血大鼠为对照组，治疗结束后采集血液和新鲜粪便，分别用于血常规、炎症因子和肠道菌群的检测。
[0105]
采集到的全血、离心得到的血清和新鲜粪便分别使用动物血常规检测仪、elisa试剂盒和16s rrna测序进行表征，其中红细胞数目的正常范围为6.36～9.42
×
10
12
/l，血红蛋白正常范围为110～143g/l，得到如下测试结果。
[0106]
表8：实施例8的动物实验结果
[0107][0108]
由表8可知，相比于单独治疗，利用实施例8的补铁制剂提高了血液中rbc和hgb的含量，有效的促进了缺铁性贫血的恢复；同时利用实施例8的补铁制剂降低了血清中促炎因子tnf-α的含量，增加了抗炎因子il-10的含量，有效的降低了炎症的发生；其次，利用实施例8的补铁制剂减少了条件致病菌escherichia-shigella和enterococcus的丰度，促进了butyricicoccus和lactobacillus的定植，有利于维持肠道微生态，减少了细菌对铁元素的竞争，促进宿主对铁元素的吸收。
[0109]
综上所述，本发明以克服现有口服补铁制剂对肠道菌群的副作用、降低炎症、提高铁元素吸收率为目标，首次将金纳米颗粒的高抗菌效果和口服补铁制剂的患者顺应性好等优点相结合，实现更加高效安全的口服补铁，为缺铁性贫血患者的治疗提供新的途径。本发明的重点在于将金属纳米颗粒与铁剂混合制备得到补铁制剂，其中小分子修饰的金纳米颗粒可以大大降低单纯口服补铁制剂带来的副作用，同时提高补铁效率。
[0110]
根据本发明的技术方案，主要具有如下技术效果：
[0111]
(1)本发明将通过小分子配体修饰的金纳米颗粒与铁剂联合使用得到补铁制剂，可以促进铁元素的吸收，加速缺铁性贫血的恢复。
[0112]
(2)本发明将通过小分子配体修饰的金纳米颗粒与铁剂联合使用得到补铁制剂，可以有效调控肠道菌群，促进有益菌的增殖，减少有害菌的定植，降低肠道感染的发生。
[0113]
(3)本发明将通过小分子配体修饰的金纳米颗粒与铁剂联合使用得到补铁制剂，可以有效降低肠道炎症，有利于促进十二指肠对铁元素的吸收。
[0114]
(4)本发明首次将功能性金属纳米颗粒与铁剂联合使用得到补铁制剂，将其用于缺铁性贫血的治疗，为缺铁性贫血的治疗提供新的途径，为其他金属元素的缺乏症的治疗提供一种新思路。
[0115]
上述实施例，特别是任何“优选”实施例是实施方式的可能示例，并且仅仅为了清楚理解本发明的原理而提出。在基本上不脱离本文描述的技术的精神和原理的情况下，可以对上述实施例做出许多变化和修改。所有修改旨在被包括在本公开的范围内。
[0116]
在本说明书中提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被完整引用至本说明书作为参考。
[0117]
此外应理解，在阅读了本发明的上述说明内容之后，本领域技术人员可以对本发明做出各种改动或修改，这些等同形式同样落入本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种补铁制剂的制备方法，其特征在于，所述补铁制剂的制备方法包括：步骤(i)，制备金纳米颗粒的浓度为200～1000μg/ml的金纳米颗粒溶液以及铁剂的浓度为3～50mg/ml的铁剂溶液；以及步骤(ii)，将所述金纳米颗粒溶液与所述铁剂溶液按照体积比为1～10:10～30的比例混合。2.根据权利要求1所述的补铁制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(i)中，所述金纳米颗粒溶液的浓度为200～800μg/ml，所述铁剂溶液的浓度为3～20mg/ml，在所述步骤(ii)中，所述金纳米颗粒溶液与所述铁剂溶液按照体积比为1～5:10～20的比例混合。3.根据权利要求1所述的补铁制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(i)中，在冰浴条件下，将还原剂、小分子配体和稳定剂溶于第一溶剂中，进行第一次混合，加入四水合氯金酸，进行第二次混合，用截留分子量为5000da的透析袋进行透析后，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤，得到所述金纳米颗粒溶液，其中，所述第一溶剂为超纯水、甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇中的任意一种或多种，所述还原剂为柠檬酸钠、硼氢化钠、谷胱甘肽、水合肼、抗坏血酸中的任意一种或多种，所述小分子配体为4,6-二氨基-2巯基嘧啶、2,4-二氨基-6巯基嘧啶、4-巯基吡啶、2-巯基吡啶、4-巯基苯硼酸、5-(吡啶-3-基)-1,3,4-二唑-2-硫醇、5-(吡啶-4-基)-1,3,4-恶二唑-2-硫醇、喹啉-4-硫醇、3-巯基喹啉、4-氨基苯酚、5-氨基吲哚、色氨酸、4-氨基苯硼酸、6-氨基青霉烷酸、7-氨基头孢烷酸中的任意一种或多种，所述稳定剂为吐温20、吐温40、吐温80、平均分子量为8000的聚乙烯吡咯烷酮、平均分子量为10000的聚乙烯吡咯烷酮、平均分子量为24000的聚乙烯吡咯烷酮中的任意一种或多种。4.根据权利要求3所述的补铁制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(i)中，所述第一溶剂为超纯水，所述还原剂为硼氢化钠和/或谷胱甘肽，所述小分子配体为4,6-二氨基-2巯基嘧啶和/或5-氨基吲哚，所述稳定剂为吐温80。5.根据权利要求3所述的补铁制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(i)中，所述稳定剂的添加比例为：每20ml的所述第一溶剂中添加100～500μl的所述稳定剂，所述四水合氯金酸、所述还原剂与所述小分子配体的摩尔比为1～3：1～5：1～10。6.根据权利要求3所述的补铁制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(i)中，所述第一次混合是以200～500rpm的搅拌速率搅拌10～30分钟，所述第二次混合是以800～1200rpm的搅拌速率搅拌30～60分钟。7.根据权利要求1所述的补铁制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(i)中，通过将铁剂溶解于第二溶剂中后，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤来得到所述铁剂溶液，其中，所述铁剂为硫酸亚铁、富马酸亚铁、右旋糖酐铁、葡萄糖酸铁、琥珀酸亚铁、乳酸亚铁中的任意一种或多种，所述第二溶剂是去离子水、磷酸盐缓冲液、质量分数为0.9％的氯化钠水溶液中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的补铁制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(i)中，所述铁剂为硫酸亚铁和/或葡萄糖酸铁，所述第二溶剂是去离子水。9.一种补铁制剂，其特征在于，所述补铁制剂是通过权利要求1～8中任一项所述的补铁制剂的制备方法制备而成。10.根据权利要求9所述的补铁制剂，其特征在于，所述补铁制剂是口服补铁制剂。

技术总结
本发明提供一种补铁制剂的制备方法以及补铁制剂。本发明的补铁制剂的制备方法包括步骤(i)，制备金纳米颗粒的浓度为200～1000μg/mL的金纳米颗粒溶液以及铁剂的浓度为3～50mg/mL的铁剂溶液；以及步骤(ii)，将金纳米颗粒溶液与铁剂溶液按照体积比为1～10:10～30的比例混合。根据本发明，能够克服现有口服补铁制剂对肠道菌群的副作用，降低炎症，实现更加高效安全的补铁。加高效安全的补铁。


技术研发人员：查瑞涛 张湃
受保护的技术使用者：国家纳米科学中心
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/20