一种改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法与流程

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法。


背景技术：

2.心血管疾病(cvd)是循环系统疾病的统称，主要包括心脏、动脉、静脉、毛细管等部位的疾病，一般与动脉粥样硬化密切相关。目前，cvd患病率及死亡率仍处于上升阶段，并居各种疾病死亡率的首位。因此，对cvd高危人群进行干预可降低cvd发生率。血脂异常是cvd的重要风险因素之一，因而开展血脂检测及测量结果的标准化对于防治cvd具有重要的作用。
3.人体血液中的脂类基本上会与蛋白质结合成脂蛋白，脂蛋白根据其密度不同可分为极低密度脂蛋白(vldl)、低密度脂蛋白(ldl)、中密度脂蛋白(idl)、高密度脂蛋白(hdl)和乳糜微粒(cm)。低密度脂蛋白(ldl)具有异质性，由一系列大小、密度和化学组成各异的颗粒组成，根据ldl颗粒的直径和密度，可以将其分为至多7种亚型，分别被命名为ldl-1、ldl-2、ldl-3、ldl-4、ldl-5、ldl-6和ldl-7。其中，大而轻的ldl(lbldl)由颗粒直径》27nm，密度《1.03g/ml的ldl-1和ldl-2组成，被定义为a型；小而密的ldl(sdldl)由颗粒直径《26nm，密度》1.04g/ml的ldl-3～ldl-7组成，被定义为b型。经实验表明，sdldl的水平可作为预测和评估心血管疾病风险的指标，ldl及其各亚组分水平的能够全面、准确地反映心血管疾病患者体内脂蛋白的真实水平，为早期干预和降低心血管疾病的患病率提供可能。因此，脂蛋白压型分析在疾病的临床诊断具有重要意义。但低密度脂蛋白亚型的异质性使得其分离检测中存在诸多困难。
4.目前血浆脂蛋白检测有多种方法，其中的电泳法具有高效性和实用性的优点，被广泛应用于脂蛋白的分离和检测分析，尤其是聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中含有的聚丙烯酰胺凝胶兼有分子筛和电荷分离的双重效应，分辨率较高，能够将血清脂蛋白分离出多条区带，具有透明度强、分离时间快、操作简便等诸多优点。然而，传统的凝胶系统对血浆脂蛋白的分辨率较低，分离效果较差。其原因是其中的聚丙烯酰胺凝胶容易水解，保存时间较短，导致凝胶体系容易丧失分离效果，水解缩短了蛋白质的迁移距离，降低了蛋白质条带的分辨率。为保证实验效果，大多使用现配的凝胶，虽检测效果较好，但是工作效率低，时间和人力成本高。
5.因此，需研发出一种分离效果好、检测准确性和检测效率高的凝胶电泳体系，使其能够对低密度脂蛋白中各亚型进行精确分离和检测，能够全面、准确地反映出脂蛋白的真实水平。


技术实现要素：

6.针对以上问题，本发明提供一种分离效果好、检测准确性和检测效率高的改良凝胶电泳体系，能够对血清中的低密度脂蛋白的各亚型进行精确分离和检测。
7.本发明通过以下技术方案实现：
8.一种改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，包括以下步骤：
9.(1)血清染色：取血清样品，加入染色液，混合均匀，然后进行恒温水浴，经离心后取上清液，得到染色后的血清；
10.(2)凝胶管制备：将玻璃管固定在支架上，然后将第二层分离胶、第一层分离胶和浓缩胶依次加入玻璃管中，每次加入胶液需待胶液表面聚合平整后再加入下一胶液，最后整体浸没于保存液中，得到凝胶管；所述第二层分离胶、第一层分离胶和浓缩胶均包括：聚丙烯酰胺、h2o、tris-hcl、蔗糖、甘油、四甲基乙二胺和过硫酸铵；
11.(3)电泳：将凝胶管去除表面和管中的保存液后，垂直固定在电泳槽中，其中的第一层分离胶和浓缩胶位于电泳槽的负极端，第二层分离胶位于电泳槽的正极端，然后分别在电泳槽中加入电泳缓冲液，将染色后的血清缓慢加入凝胶管中，覆盖在浓缩胶的表面，待体系中的溶液稳定后，接通稳压电源进行电泳；
12.(4)定量检测：电泳结束后，取下凝胶管，用扫描仪扫描凝胶管的第一层分离胶和第二层分离胶中不同位置的吸光度变化，根据不同亚型的低密度脂蛋白的吸光度随位置变化得到的曲线，定量检测出不同亚型的低密度脂蛋白占整体血清脂蛋白的百分含量。
13.作为技术方案的优选，步骤(2)中，所述凝胶管中第二层分离胶、第一层分离胶和浓缩胶的体积比为5～7:1～2:1。
14.作为技术方案的优选，步骤(2)中，所述第二层分离胶中聚丙烯酰胺、h2o、tris-hcl、蔗糖、甘油、四甲基乙二胺和过硫酸铵的体积比为28～35:150～300:7～9:9～11:1～2:0.1～0.2:1；所述第二层分离胶的凝胶浓度t＝3～4％(凝胶浓度t是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺质量总和除以总体积)、ph值为8.5～9。
15.作为技术方案的优选，步骤(2)中，所述第一层分离胶中聚丙烯酰胺、h2o、tris-hcl、蔗糖、甘油、四甲基乙二胺和过硫酸铵的体积比为45～50:200～300:7～9:9～11:1～2:0.1～0.2:1；所述第一层分离胶的凝胶浓度t＝4.5～6％、ph值为8.5～9。
16.作为技术方案的优选，步骤(2)中，所述浓缩胶中聚丙烯酰胺、h2o、tris-hcl、蔗糖、甘油、四甲基乙二胺和过硫酸铵的体积比为20～25:150～250:4.5～6:55～65:1～2:0.1～0.2:1；所述浓缩胶的凝胶浓度t＝2～3％、ph值为6.5～7。
17.作为技术方案的优选，步骤(2)中，所述保存液由蔗糖、tris-hcl、甘油和proclin 300按照质体比9～11g:38～45ml:1ml:0.1～0.2ml混合配制而成。
18.作为技术方案的优选，步骤(2)中，所述每次加入胶液后立即在液面上加入蒸馏水，静置30～40min，待胶液表面聚合平整后去掉水层，然后再加入下一胶液。
19.作为技术方案的优选，步骤(1)中，所述血清样品与染色液的体积比为8～10:1。
20.作为技术方案的优选，步骤(1)中，所述染色液由苏丹黑b、无水乙醇、二甲基亚砜和乙二醇配制而成，染色液中苏丹黑b的浓度为2～3g/l，无水乙醇、二甲基亚砜和乙二醇的体积比为1～2:1:1～2。
21.作为技术方案的优选，步骤(3)中，所述缓冲液由三羟甲基氨基甲烷和硼酸按照质量比2～3:1混合配制而成。
22.与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
23.1、本发明的凝胶电泳体系分离效果好、检测准确性和检测效率高，通过调节分离
胶与浓缩胶的比例、以及胶液中聚丙烯酰胺的含量，并调节染色液的配置，使得低密度脂蛋白总量以及其中各个亚型能够精确分离和定量分析，能够全面、准确地反映出脂蛋白的真实水平，且检测过程简单易行，检测时间短，检测过程只需75min左右，对于更好地判断出心脑血管疾病风险具有重要意义。
24.2、本发明的凝胶分离柱分为第二层分离胶、第一层分离胶和浓缩胶，其中各个胶液含有的聚丙烯酰胺的含量均不同，以三种不同含量的聚丙烯酰胺作为电泳载体，使之与不同颗粒、密度的脂蛋白相匹配，从而使得脂蛋白的各个亚型的定量和定性分析更加准确。其中，第二层分离胶和第一层分离胶的主要作用是对脂蛋白的各个亚型进行分离，浓缩胶的作用是起到堆积作用，将脂蛋白所有亚型压缩在狭窄的区带中，从而提高电泳的灵敏度。
25.3、本发明中第二层分离胶的浓度设置的原则是根据凝胶的孔径，因分离的脂蛋白颗粒直径比较大(15nm以上)，因此凝胶浓度t需设置在4％以下，凝胶浓度低可使凝胶的孔径的大，以使得更好地分离脂蛋白颗粒，从而提高检测效果。
26.4、本发明的染色液由苏丹黑b、无水乙醇、二甲基亚砜和乙二醇配制而成，溶解性、分散性、稳定性好且保质期长达1年。其中的二甲亚砜作为溶剂，主要起到溶解作用；无水乙醇作为分散剂，可以使血清中脂蛋白有良好的分散性，提高电泳检测的分辨率；乙二醇作为增密剂，能够增加染色液的密度，电泳检测时能使染色的血清样本聚集且下沉，避免电泳过程中样本分散至缓冲液中。通过染色液中各成分的共同作用，能够促使苏丹黑b与脂蛋白的各个亚型的结合均一，染色结果均一，提高电泳检测的效果以及效率，从而能够很好地同时定性检测脂蛋白各个亚分型。
附图说明
27.图1为按照实施例1的方法对已确诊心血管病人血清进行电泳得到的凝胶电泳图谱。
28.图2为按照实施例1的方法对健康人的血清进行电泳得到的凝胶电泳图谱。
29.图3为按照对比例1的方法对已确诊心血管病人血清进行电泳得到的凝胶电泳图谱。
30.图4为按照对比例1的方法对健康人的血清进行电泳得到的凝胶电泳图谱。
具体实施方式
31.下面通过实施例对本发明做进一步地详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。
32.实施例1
33.一种改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，包括以下步骤：
34.(1)血清染色：采集空腹12h后的静脉血样品，在2h内分离出血清，取120μl血清，加入15μl染色液，混合均匀，然后在37℃下恒温水浴30min，之后以3000r/min的转速离心10min，离心后取上清液，得到染色后的血清；
35.所述染色液的配制为：取苏丹黑b配制成3g/l，再加入无水乙醇10ml、二甲基亚砜10ml和乙二醇10ml，混合均匀，然后40℃下加热10min，加热期间不断搅拌，之后使用孔径为0.22μm的滤膜趁热过滤，待冷却之后再过滤一次，得到染色液；
36.(2)凝胶管制备：将玻璃管固定在支架上，然后将1050μl第二层分离胶、270μl第一层分离胶和160μl浓缩胶依次加入玻璃管中，每次加入胶液后立即在液面上加入50μl蒸馏水，静置30min，以隔绝空气和使胶液表面平整，待胶液表面聚合平整后去掉水层，然后再加入下一胶液，最后整体浸没于500ml保存液中，得到凝胶管；
37.所述第二层分离胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)1.480ml、h2o 12.3592ml、1mol/l tris-hcl(ph为8.9)380μl、25％蔗糖480μl、25％甘油48μl、四甲基乙二胺4.8μl和10％过硫酸铵48μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝3.0％、ph为8.6、14.8ml体系的第二层分离胶；
38.所述第一层分离胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)3.420ml、h2o 16.558ml、1mol/l tris-hcl(ph为8.9)550μl、25％蔗糖700μl、25％甘油70μl、四甲基乙二胺7.0μl和10％过硫酸铵70μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝4.8％、ph为8.6、21.375ml体系的第一层分离胶；
39.所述浓缩胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)445.0μl、h2o 4127.2μl、1mol/l tris-hcl(ph为6.8)90μl、25％蔗糖1100μl、25％甘油18μl、四甲基乙二胺1.8μl和10％过硫酸铵18μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝2.3％、ph为6.9、5.8ml体系的浓缩胶；
40.所述保存液的配制为：取1.5mol/l tris-hcl(ph为6.7)90ml、蔗糖22g、甘油2.0ml和proclin 300 280μl溶于水，混合均匀，定容至1000ml，使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到保存液；
41.(3)电泳：将凝胶管去除表面和管中的保存液后，垂直固定在电泳槽中，其中的第一层分离胶和浓缩胶位于电泳槽的负极端，第二层分离胶位于电泳槽的正极端，然后分别在电泳槽中加入600ml电泳缓冲液，取40μl染色后的血清缓慢加入凝胶管中，覆盖在浓缩胶的表面，待体系中的溶液稳定后，接通稳压电源，电流为2ma/管，电泳时间为80min；
42.所述电泳缓冲液的配制为：取三羟甲基氨基甲烷12.025g和硼酸5.8g溶于水，混合均匀，定容至1000ml，使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到电泳缓冲液；
43.(4)定量检测：电泳结束后，取下凝胶管，用扫描仪扫描凝胶管的第一层分离胶和第二层分离胶中不同位置的吸光度变化，根据不同亚型的低密度脂蛋白的吸光度随位置变化得到的曲线，定量检测出不同亚型的低密度脂蛋白占整体血清脂蛋白的百分含量。
44.实施例2
45.一种改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，包括以下步骤：
46.(1)血清染色：采集空腹12h后的静脉血样品，在2h内分离出血清，取150μl血清，加入18μl染色液，混合均匀，然后在37℃下恒温水浴30min，之后以3000r/min的转速离心10min，离心后取上清液，得到染色后的血清；
47.所述染色液的配制为：取苏丹黑b配制成2g/l，再加入无水乙醇15ml、二甲基亚砜12ml和乙二醇15ml，混合均匀，然后40℃下加热12min，加热期间不断搅拌，之后使用孔径为0.22μm的滤膜趁热过滤，待冷却之后再过滤一次，得到染色液；
48.(2)凝胶管制备：将玻璃管固定在支架上，然后将1065μl第二层分离胶、280μl第一层分离胶和175μl浓缩胶依次加入玻璃管中，每次加入胶液后立即在液面上加入50μl蒸馏水，静置30min，以隔绝空气和使胶液表面平整，待胶液表面聚合平整后去掉水层，然后再加入下一胶液，最后整体浸没于500ml保存液中，得到凝胶管；
49.所述第二层分离胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)1.455ml、h2o 11.624ml、1mol/l tris-hcl(ph为8.9)400μl、25％蔗糖500μl、25％甘油50μl、四甲基乙二胺5μl和10％过硫酸铵46μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝3.1％、ph为8.8、14.08ml体系的第二层分离胶；
50.所述第一层分离胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)3.460ml、h2o 17.613ml、1mol/l tris-hcl(ph为8.9)580μl、25％蔗糖750μl、25％甘油80μl、四甲基乙二胺7.0μl和10％过硫酸铵70μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝4.6％、ph为8.7、22.56ml体系的第一层分离胶；
51.所述浓缩胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)465.2μl、h2o 3871.8μl、1mol/l tris-hcl(ph为6.8)95μl、25％蔗糖1120μl、25％甘油25μl、四甲基乙二胺3.0μl和10％过硫酸铵20μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝2.5％、ph为6.7、5.6ml体系的浓缩胶；
52.所述保存液的配制为：取1.5mol/l tris-hcl(ph为6.7)65ml、蔗糖15g、甘油1.5ml和proclin 300 250μl溶于水，混合均匀，定容至1000ml，使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到保存液；
53.(3)电泳：将凝胶管去除表面和管中的保存液后，垂直固定在电泳槽中，其中的第一层分离胶和浓缩胶位于电泳槽的负极端，第二层分离胶位于电泳槽的正极端，然后分别在电泳槽中加入600ml电泳缓冲液，取40μl染色后的血清缓慢加入凝胶管中，覆盖在浓缩胶的表面，待体系中的溶液稳定后，接通稳压电源，电流为2ma/管，电泳时间为80min；
54.所述电泳缓冲液的配制为：取三羟甲基氨基甲烷14.120g和硼酸6.0g溶于水，混合均匀，定容至1000ml，使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到电泳缓冲液；
55.(4)定量检测：电泳结束后，取下凝胶管，用扫描仪扫描凝胶管的第一层分离胶和第二层分离胶中不同位置的吸光度变化，根据不同亚型的低密度脂蛋白的吸光度随位置变化得到的曲线，定量检测出不同亚型的低密度脂蛋白占整体血清脂蛋白的百分含量。
56.实施例3
57.一种改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，包括以下步骤：
58.(1)血清染色：采集空腹12h后的静脉血样品，在2h内分离出血清，取180μl血清，加入20μl染色液，混合均匀，然后在37℃下恒温水浴30min，之后以3000r/min的转速离心10min，离心后取上清液，得到染色后的血清；
59.所述染色液的配制为：取苏丹黑b配制成3g/l，再加入无水乙醇15ml、二甲基亚砜10ml和乙二醇15ml，混合均匀，然后40℃下加热10min，加热期间不断搅拌，之后使用孔径为0.22μm的滤膜趁热过滤，待冷却之后再过滤一次，得到染色液；
60.(2)凝胶管制备：将玻璃管固定在支架上，然后将1250μl第二层分离胶、300μl第一层分离胶和220μl浓缩胶依次加入玻璃管中，每次加入胶液后立即在液面上加入50μl蒸馏水，静置30min，以隔绝空气和使胶液表面平整，待胶液表面聚合平整后去掉水层，然后再加入下一胶液，最后整体浸没于500ml保存液中，得到凝胶管；
61.所述第二层分离胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)1.510ml、h2o 9.749ml、1mol/l tris-hcl(ph为8.9)400μl、25％蔗糖470μl、25％甘油60μl、四甲基乙二胺6.0μl和10％过硫酸铵45μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝3.7％、ph为8.9、12.24ml体系的第二层分离胶；
62.所述第一层分离胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)3.230ml、h2o 15.646ml、1mol/l tris-hcl(ph为8.9)500μl、25％蔗糖650μl、25％甘油80μl、四甲基乙二胺9.0μl和10％过硫酸铵65μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝4.8％、ph为8.5、20.18ml体系的第一层分离胶；
63.所述浓缩胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)445.0μl、h2o 3977μl、1mol/l tris-hcl(ph为6.8)100μl、25％蔗糖1230μl、25％甘油25μl、四甲基乙二胺3.0μl和10％过硫酸铵20μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝2.3％、ph为6.9、5.8ml体系的浓缩胶；
64.所述保存液的配制为：取1.5mol/l tris-hcl(ph为6.7)100ml、蔗糖25g、甘油2.3ml和proclin 300 320μl溶于水，混合均匀，定容至1000ml，使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到保存液；
65.(3)电泳：将凝胶管去除表面和管中的保存液后，垂直固定在电泳槽中，其中的第一层分离胶和浓缩胶位于电泳槽的负极端，第二层分离胶位于电泳槽的正极端，然后分别在电泳槽中加入600ml电泳缓冲液，取40μl染色后的血清缓慢加入凝胶管中，覆盖在浓缩胶的表面，待体系中的溶液稳定后，接通稳压电源，电流为2ma/管，电泳时间为80min；
66.所述电泳缓冲液的配制为：取三羟甲基氨基甲烷13.224g和硼酸5.5g溶于水，混合均匀，定容至1000ml，使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到电泳缓冲液；
67.(4)定量检测：电泳结束后，取下凝胶管，用扫描仪扫描凝胶管的第一层分离胶和第二层分离胶中不同位置的吸光度变化，根据不同亚型的低密度脂蛋白的吸光度随位置变化得到的曲线，定量检测出不同亚型的低密度脂蛋白占整体血清脂蛋白的百分含量。
68.对比例1
69.对比例1与实施例1的区别在于，对比例1中的分离胶、浓缩胶和电泳缓冲液与实施例1的不同，其余检测方法均与实施例1的相同。对比例1中分离胶、浓缩胶和电泳缓冲液的配制如下：
70.分离胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)0.667ml、h2o 4.078ml、1mol/ltris-hcl(ph为8.9)200μl、四甲基乙二胺5.0μl和10％过硫酸铵50μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝4.0％、ph为8.9、5.0ml体系的分离胶；
71.浓缩胶的配制为：取30％聚丙烯酰胺(acr:bis＝29:1)300.0μl、h2o 2.567ml、1mol/ltris-hcl(ph为6.8)100μl、四甲基乙二胺3.0μl和10％过硫酸铵30μl，混合均匀，配制成凝胶浓度t＝3.0％、ph为6.9、3.0ml体系的浓缩胶；
72.电泳缓冲液的配制为：取三羟甲基氨基甲烷3.3g和甘氨酸14.4g溶于水，混合均匀，定容至1000ml，使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到电泳缓冲液。
73.检测效果评价
74.取临床上已确认心血管病人的血清和健康人的血清，对每种血清均按照实施例1和对比例1中的方法进行电泳，电泳后使用光密度扫描仪进行扫描，得到的电泳图谱如图1-4所示。其中图1、2分别为按照实施例1的方法对已确诊心血管病人血清和健康人的血清进行电泳得到的凝胶电泳图谱，图3、4分别为按照对比例1的方法对已确诊心血管病人血清和健康人的血清进行电泳得到的凝胶电泳图谱。
75.由图1和2可知，图1和2的凝胶电泳图谱的清晰度和分辨率高，说明实施例1的方法能够将低密度脂蛋白的各亚型进行清晰地分离，检测准确性高。而由图3和4可知，图3和图4
的凝胶电泳图谱的清晰度和分辨率较低，说明对比例1的方法分离效果较差。
76.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)血清染色：取血清样品，加入染色液，混合均匀，然后进行恒温水浴，经离心后取上清液，得到染色后的血清；(2)凝胶管制备：将玻璃管固定在支架上，然后将第二层分离胶、第一层分离胶和浓缩胶依次加入玻璃管中，每次加入胶液需待胶液表面聚合平整后再加入下一胶液，最后整体浸没于保存液中，得到凝胶管；所述第二层分离胶、第一层分离胶和浓缩胶均包括：聚丙烯酰胺、h2o、tris-hcl、蔗糖、甘油、四甲基乙二胺和过硫酸铵；(3)电泳：将凝胶管去除表面和管中的保存液后，垂直固定在电泳槽中，其中的第一层分离胶和浓缩胶位于电泳槽的负极端，第二层分离胶位于电泳槽的正极端，然后分别在电泳槽中加入电泳缓冲液，将染色后的血清缓慢加入凝胶管中，覆盖在浓缩胶的表面，待体系中的溶液稳定后，接通稳压电源进行电泳；(4)定量检测：电泳结束后，取下凝胶管，用扫描仪扫描凝胶管的第一层分离胶和第二层分离胶中不同位置的吸光度变化，根据不同亚型的低密度脂蛋白的吸光度随位置变化得到的曲线，定量检测出不同亚型的低密度脂蛋白占整体血清脂蛋白的百分含量。2.根据权利要求1所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述凝胶管中第二层分离胶、第一层分离胶和浓缩胶的体积比为5～7:1～2:1。3.根据权利要求2所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第二层分离胶中聚丙烯酰胺、h2o、tris-hcl、蔗糖、甘油、四甲基乙二胺和过硫酸铵的体积比为28～35:150～300:7～9:9～11:1～2:0.1～0.2:1；所述第二层分离胶的凝胶浓度t＝3～4％、ph值为8.5～9。4.根据权利要求2所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第一层分离胶中聚丙烯酰胺、h2o、tris-hcl、蔗糖、甘油、四甲基乙二胺和过硫酸铵的体积比为45～50:200～300:7～9:9～11:1～2:0.1～0.2:1；所述第一层分离胶的凝胶浓度t＝4.5～6％、ph值为8.5～9。5.根据权利要求2所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述浓缩胶中聚丙烯酰胺、h2o、tris-hcl、蔗糖、甘油、四甲基乙二胺和过硫酸铵的体积比为20～25:150～250:4.5～6:55～65:1～2:0.1～0.2:1；所述浓缩胶的凝胶浓度t＝2～3％、ph值为6.5～7。6.根据权利要求1所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述保存液由蔗糖、tris-hcl、甘油和proclin 300按照质体比9～11g:38～45ml:1ml:0.1～0.2ml混合配制而成。7.根据权利要求1所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述每次加入胶液后立即在液面上加入蒸馏水，静置30～40min，待胶液表面聚合平整后去掉水层，然后再加入下一胶液。8.根据权利要求1所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述血清样品与染色液的体积比为8～10:1。9.根据权利要求8所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述染色液由苏丹黑b、无水乙醇、二甲基亚砜和乙二醇配制而成，染色液中苏丹黑b的浓度为2～3g/l，无水乙醇、二甲基亚砜和乙二醇的体积比为1～2:1:1～2。
10.根据权利要求1所述的改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述缓冲液由三羟甲基氨基甲烷和硼酸按照质量比2～3:1混合配制而成。

技术总结
本发明公开一种改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，属于生物检测技术领域。该方法包括以下步骤：(1)血清染色；(2)凝胶管制备；(3)电泳；(4)定量检测。本发明的凝胶电泳体系分离效果好、检测准确性和检测效率高，通过调节分离胶与浓缩胶的比例、以及胶液中聚丙烯酰胺的含量，并调节染色液的配置，使得低密度脂蛋白总量以及其中各个亚型能够精确分离和定量分析，能够全面、准确地反映出脂蛋白的真实水平，且检测过程简单易行，检测时间短，对于更好地判断出心脑血管疾病风险具有重要意义。义。义。


技术研发人员：李名星 黄多全 余思柳 杨添源 王晶晶 方运清
受保护的技术使用者：广西康柏莱科技有限公司
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/20