一种耐酸载营养素纳米胶束及其制备方法

1.本发明涉及生物与新医药技术领域，特别是涉及一种耐酸载营养素纳米胶束及其制备方法。


背景技术：

2.自然界中存在多种不同来源的脂溶性食源活性成分，如植物源的姜黄素、动物源的虾青素等。这些天然活性成分通常都具备良好的抗炎、抗氧化活性，具备改善消化道炎症的潜力。然而，水溶性差和稳定性差(胃肠道的复杂环境)的特点极大地限制了食源性活性成分在生物医药领域的应用。
3.目前，对于这类脂溶性食源活性成分，通常采用口服作为给药途径。现已有报道研究者通过不同的策略以提高脂溶性食源活性成分的肠细胞生物利用度，取得了显著进展，如酯化策略、微胶囊装载策略、纳米载体等。酯化策略，是利用多不饱和脂肪酸修饰虾青素两端酮环形成前体酯，并通过体内酶代谢途径恢复虾青素结构，从而改善虾青素生物利用度。zhou等人通过模拟不同的酯化结构，考察了单/双酯、接枝链长度及不饱和度等因素的影响，显著提升了虾青素的稳定性，在分子结构修饰的角度提出新思路(food hydrocolloid.2020,110)。微胶囊装载策略则是利用微胶囊内的疏水结构装载脂溶性活性成分，通过微囊化包覆实现保护、缓释等目的，提高脂溶性活性成分的肠细胞生物利用度。zhang等人将叶黄素均匀的分散在改性淀粉和蔗糖的基质中，用玉米淀粉包裹，使用喷雾干燥技术制备叶黄素微胶囊，制备出的叶黄素微胶囊可以使叶黄素直接溶于水中形成均匀的液体，使得叶黄素溶解性和贮藏稳定性得到了提高，并且增加了叶黄素的生物利用度，相对生物利用度也达到139.1％(food science and technology research,2015,21(4):503-507)。纳米载体递送则进一步开拓了脂溶性活性成分的递送方式。hu等人通过酰化修饰和热诱导自组装来制备酰化卵清蛋白(aova)纳米凝胶，相对于没有化学酰化的天然卵清蛋白(nova)纳米凝胶，包封在aova纳米凝胶的姜黄素表现出更高的包封效率(93.64％)且在模拟胃肠道状况下缓释更慢(food chemistry,2021,355,129635)。
4.综上所述，已报道的脂溶性食源活性成分递送策略主要以改善其水分散性、稳定性为主。其中，虾青素酯化策略重在分子修饰，缺乏体内外胃肠环境消化代谢的研究；微胶囊装载叶黄素的体内药代动力学显示装载前后血液中检测到的叶黄素含量无明显差异，且微囊化制备的尺寸往往在微米级别，不利于肠上皮细胞的吸收；而纳米乳液、纳米胶束显著改善了递送系统的尺寸，但仍无法克服口服后生物利用度较低的问题。
5.胃肠生理屏障的主要特征之一是具备多变的ph环境：胃部为强酸性(ph＝1～2)，而小肠内呈弱酸性至中性(ph＝6.5～7.5)。胃部的强酸性环境直接影响纳米递送系统的稳定性，造成营养素过早释放、分解(分子结构被破坏)。目前公开的口服递送载体中，还未能兼顾亲脂性营养素的水溶性和强酸性环境下纳米递送系统结构不稳定的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于填补脂溶性营养素载运技术的不足，提供一种耐胃肠屏障、炎症响应性粘附的耐酸载营养素纳米胶束及其制备方法，制得的纳米胶束可耐受胃液消化，并通过延长肠道滞留时间在小鼠肠炎区域凝胶化聚集。
7.本发明通过以下技术方案实现：
8.本发明所述耐酸载营养素纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)将乌索酸(ursolic acid,uc)、1-羟基苯并三唑(hobt)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl)充分溶解于二甲基甲酰亚胺(dmf)中，搅拌使其充分反应，得到活化酯的溶液；
10.(2)将含胺基阳离子聚合物充分溶解于含有0.1％～5％(v/v)醋酸的dmf溶液，与上述步骤(1)得到活化酯的溶液混合搅拌，进行充分的酰胺反应，经乙醚洗涤和负压旋蒸后，制得两亲阳离高聚分子；
11.(3)将两亲阳离高聚分子在良溶剂中充分溶解，加入脂溶性活性物质混匀，避光旋蒸回流充分去除良溶剂，复溶于超纯水或其他缓冲溶液，得到载营养素纳米胶束溶液；
12.(4)将聚阴离子聚合物水溶液与上述步骤(3)得到的载营养素纳米胶束溶液在冰浴下搅拌，制得耐酸载营养素纳米胶束。
13.进一步地，步骤(1)中，所述乌索酸与1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:(1～6):(1～6)。
14.进一步地，步骤(2)中，所述含胺基阳离子聚合物为壳聚糖、ε-聚赖氨酸、
ɑ-聚赖氨酸和聚乙酰亚胺中的一种或几种，其中壳聚糖的分子量范围为3～200kda，ε-聚赖氨酸和
ɑ-聚赖氨酸的分子量范围均为3～20kda，聚乙酰亚胺的分子量范围为1～10kda。
15.进一步地，步骤(2)中，以氨基的摩尔量计，含胺基阳离子聚合物与步骤(1)溶液中乌索酸的摩尔比为1:(0.05～0.8)。
16.进一步地，步骤(2)中，反应温度在4～70℃，反应时间为大于4h，搅拌速度为200～800rpm。
17.进一步地，步骤(3)中，良溶剂为甲醇、二氯甲烷、乙腈、二甲基甲酰亚胺和二甲基亚砜中任一种或相互任意比例的混合溶剂。
18.进一步地，步骤(3)中，脂溶性活性物质为虾青素(ast)、姜黄素(cur)、叶黄素(lut)、叶黄素酯(lute)或亚油酸(la)。
19.进一步地，步骤(3)中，两亲阳离高聚分子与脂溶性活性物质的质量比为1:(0.01～0.2)。
20.进一步地，步骤(3)中，避光回流时间为30min～3h。
21.进一步地，步骤(4)中，聚阴离子聚合物的溶剂包括水和生理盐水，聚阴离子聚合物与载营养素纳米胶束的质量比为(0.01～0.2):1。
22.进一步地，步骤(4)中，聚阴离子聚合物为玻璃酸钠(ha)、海藻酸钠(sa)或羧甲基纤维素钠(cmc)。
23.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
24.本发明首次以乌索酸、含胺基阳离子聚合物及聚阴离子聚合物为原材料，探索并开发了一种可耐胃液消化型载营养素纳米胶束，含胺基阳离子聚合物经乌索酸修饰后形成
表面带正电荷的两亲性纳米胶束，带负电荷的聚阴离子聚合物通过静电自主装反应与其结合。该纳米胶束转运到胃时，胃液的强酸性环境(ph≈1-2)无法影响该纳米结构，进一步地，该纳米胶束转运到肠道时，由于肠环境ph≈5.5-6.0，含胺基阳离子聚合物的等电点落在此范围内，逐步发生结构解离，黏附于肠炎区域形成凝胶。对比不耐受胃液型纳米递送系统，该纳米胶束可在口服后转运到胃的过程中保护其包载的营养素，直到转运至肠环境中由于环境ph的改变，纳米胶束结构解离，释放出营养素，使其生物活性得以发挥。本发明实施例通过负载能够有效改善炎症环境的天然营养素—虾青素为例，干预小鼠溃疡性结肠炎模型，结果表明其显著改善小鼠溃结模型的炎症状况，凸显出其较之不耐受胃液型纳米递送系统，拥有更高的递送效率，能够保护营养素不被胃液分解，延长其肠道滞留时间并在炎症区域凝胶化聚集，极大提升营养素生物利用度，具有良好的生物相容性。本发明在医疗领域具有巨大的市场潜力，并有着向其他新方向应用和发展的广阔前景。
附图说明
25.图1是本发明中改性壳聚糖纳米胶束的合成路线图。
26.图2是改性壳聚糖纳米胶束的高分辨透射电子显微镜(tem)图像。
27.图3是改性壳聚糖纳米胶束的动态光散射(dls)结果。
28.图4是改性壳聚糖纳米胶束在胃液(ph＝1)条件下的粒径变化结果。
29.图5是改性壳聚糖纳米胶束的ph稳定性结果。
30.图6是治疗后溃疡性结肠炎(uc)小鼠模型的肠损伤系数影响。
31.图7是治疗后uc小鼠模型的结肠长度变化。
32.图8是治疗后uc小鼠模型的脾脏系数变化。
33.图9是改性壳聚糖纳米胶束的炎症响应性粘附性能评价。
34.图10是改性壳聚糖纳米胶束对肠上皮细胞活性的影响。
具体实施方式
35.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。
36.本发明中，该耐胃液消化型耐酸载营养素纳米胶束由一种两亲阳离高聚分子与脂溶性活性物质自组装后通过与聚阴离子聚合物产生非共价键得到。
37.以壳聚糖、虾青素、玻璃酸钠为例，说明本发明的反应流程，如图1所示。改性壳聚糖由壳聚糖与乌索酸在1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的作用下形成酰胺键制得；将改性壳聚糖在丙酮中充分溶解，以一定比例与虾青素混匀，避光回流一段时间后除掉有机溶剂丙酮，复溶于水，即得载虾青素的壳聚糖纳米粒(csu@ast)；在冰浴条件下，将该载虾青素壳聚糖纳米粒与玻璃酸钠以一定比例充分混匀，即得最终的载虾青素纳米胶束(ha-csu@ast)。
38.该纳米胶束经口服后，虾青素在递送至胃液中处于强酸性环境时受到保护，直至递送至肠道时由于ph环境的改变，刺激纳米胶束结构解离，从而被释放，发挥其生物活性。
39.下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
40.实施例1
41.(1)改性壳聚糖纳米粒(csu)的合成
42.乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(0.54g,2mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.767g,2mmol)溶于dmf中，4℃搅拌12h，搅拌速度为400rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入10kda分子量壳聚糖(以壳聚糖链上氨基的摩尔量为参考，壳聚糖与乌索酸的摩尔比为1:0.6)，室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到csu。
[0043][0044]
(2)载虾青素改性壳聚糖纳米胶束(csu@ast)的合成
[0045]
取1g csu在甲醇中充分溶解，按csu与虾青素的质量比为1:0.1投入虾青素，避光回流0.5h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得csu@ast。其水溶液色泽较csu水溶液发生变化，前者为透亮的橘红色，后者为柠黄色。
[0046]
(3)耐酸载虾青素改性壳聚糖纳米胶束(ha-csu@ast)的制备
[0047]
冰浴条件下，取1.1mg ast@csu和100μg玻璃酸钠溶解在纯水中，搅拌30min，即得ha-csu@ast胶束。
[0048]
实施例2
[0049]
(1)改性壳聚糖纳米粒(csu)的合成
[0050]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(2.16g,8mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(3.068g,8mmol)溶于dmf中，37℃搅拌10h，搅拌速度为800rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入200kda壳聚糖(以壳聚糖链上氨基的摩尔量为参考，壳聚糖与乌索酸的摩尔比为1:0.8,室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到csu。
[0051]
(2)载虾青素改性壳聚糖纳米胶束(csu@ast)
[0052]
取1g csu在甲醇中充分溶解，按csu与虾青素的质量比为1:0.2投入虾青素，避光回流3h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得csu@ast。其水溶液色泽较csu水溶液发生变化，前者为透亮的橘红色，后者为柠黄色。
[0053]
(3)耐酸载虾青素改性壳聚糖纳米胶束(ha-csu@ast)的制备
[0054]
冰浴条件下，取1mg csu@ast和200μg玻璃酸钠溶解在生理盐水中，搅拌30min，即得ha-csu@ast胶束。
[0055]
实施例3
[0056]
(1)改性壳聚糖纳米粒(csu)的合成
[0057]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(3.24g,12mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(6.136g,12mmol)溶于dmf中，70℃搅拌5h，搅拌速度为200rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入3kda壳聚糖(以壳聚糖链上氨
基的摩尔量为参考，壳聚糖与乌索酸的摩尔比为1:0.05,室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到csu。
[0058]
(2)载虾青素改性壳聚糖纳米胶束(csu@ast)
[0059]
取1g csu在甲醇中充分溶解，按csu与虾青素的质量比为1:0.01投入虾青素，避光回流1h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得csu@ast。其水溶液色泽较csu水溶液发生变化，前者为透亮的橘红色，后者为柠黄色。
[0060]
(3)耐酸载虾青素改性壳聚糖纳米胶束(ha-csu@ast)的制备
[0061]
冰浴条件下，取1mg csu@ast和10μg玻璃酸钠溶解在纯水中，搅拌30min，即得ha-csu@ast胶束。
[0062]
实施例4
[0063]
(1)改性ε-聚赖氨酸纳米粒(ε-plu)的合成
[0064]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(0.54g,2mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.767g,2mmol)溶于dmf中，4℃搅拌12h,搅拌速度为400rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入10kdaε-聚赖氨酸(以ε-聚赖氨酸上氨基的摩尔量为参考，ε-聚赖氨酸与乌索酸的摩尔比为1:0.6,室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到ε-plu。
[0065]
(2)载姜黄素改性ε-聚赖氨酸纳米胶束(ε-plu@cur)
[0066]
取1gε-plu在二氯甲烷中充分溶解，按ε-plu与姜黄素的质量比为1:0.1投入姜黄素，避光回流0.5h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得ε-plu@cur。其水溶液色泽较ε-plu水溶液发生变化，前者为无色透明溶液，后者为透亮的橙黄色。
[0067]
(3)耐酸载姜黄素改性ε-聚赖氨酸纳米胶束(sa-ε-plu@cur)的制备
[0068]
冰浴条件下，取1.1mgε-plu@cur和100μg海藻酸钠溶解在生理盐水中，搅拌30min，即得sa-ε-plu@cur胶束。
[0069]
实施例5
[0070]
(1)改性ε-聚赖氨酸纳米粒(ε-plu)的合成
[0071]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(2.16g,8mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(3.068g,8mmol)溶于dmf中，37℃搅拌10h,搅拌速度为800rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入20kdaε-聚赖氨酸(以ε-聚赖氨酸上氨基的摩尔量为参考，ε-聚赖氨酸与乌索酸的摩尔比为1:0.8,室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到ε-plu。
[0072]
(2)载姜黄素改性ε-聚赖氨酸纳米胶束(ε-plu@cur)
[0073]
取1gε-plu在二氯甲烷中充分溶解，按ε-plu与姜黄素的质量比为1:0.2投入姜黄素，避光回流3h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得ε-plu@cur。其水溶液色泽较ε-plu水溶液发生变化，前者为无色透明溶液，后者为透亮的橙黄色。
[0074]
(3)耐酸载姜黄素改性ε-聚赖氨酸纳米胶束(sa-ε-plu@cur)的制备
[0075]
冰浴条件下，取1mgε-plu@cur和200μg海藻酸钠溶解在纯水中，搅拌30min，即得sa-ε-plu@cur胶束。
[0076]
实施例6
[0077]
(1)改性ε-聚赖氨酸纳米粒(ε-plu)的合成
[0078]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(3.24g,12mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(6.136g,12mmol)溶于dmf中，70℃搅拌5h,搅拌速度为200rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入3kdaε-聚赖氨酸(以ε-聚赖氨酸上氨基的摩尔量为参考，ε-聚赖氨酸与乌索酸的摩尔比为1:0.05,室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到ε-plu。
[0079]
(2)载姜黄素改性ε-聚赖氨酸纳米胶束(ε-plu@cur)
[0080]
取1gε-plu在二氯甲烷中充分溶解，按ε-plu与姜黄素的质量比为1:0.01投入姜黄素，避光回流1h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得ε-plu@cur。其水溶液色泽较ε-plu水溶液发生变化，前者为无色透明溶液，后者为透亮的橙黄色。
[0081]
(3)耐酸载姜黄素改性ε-聚赖氨酸纳米胶束(sa-ε-plu@cur)的制备
[0082]
冰浴条件下，取1mgε-plu@cur和10μg海藻酸钠溶解在纯水中，搅拌30min，即得sa-ε-plu@cur胶束。
[0083]
实施例7
[0084]
(1)改性α-聚赖氨酸纳米粒(α-plu)的合成
[0085]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(0.54g,2mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.767g,2mmol)溶于dmf中，4℃搅拌12h,搅拌速度为400rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入10kdaα-聚赖氨酸(以α-聚赖氨酸上氨基的摩尔量为参考，α-聚赖氨酸与乌索酸的摩尔比为1:0.6,室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到α-plu。
[0086]
(2)载叶黄素改性α-聚赖氨酸纳米胶束(α-plu@lut)
[0087]
取1gα-plu在二甲基甲酰亚胺中充分溶解，按α-plu与姜黄素的质量比为1:0.1投入姜黄素，避光回流0.5h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得α-plu@lut。其水溶液色泽较α-plu水溶液发生变化，前者为无色透明溶液，后者为透亮的浅黄色。
[0088]
(3)耐酸载叶黄素改性α-聚赖氨酸纳米胶束(cmc-α-plu@lut)的制备
[0089]
冰浴条件下，取1.1mgα-plu@cur和100μg羧甲基纤维素钠溶解在生理盐水中，搅拌30min，即得cmc-α-plu@lut胶束。
[0090]
实施例8
[0091]
(1)改性α-聚赖氨酸纳米粒(α-plu)的合成
[0092]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(2.16g,8mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(3.068g,8mmol)溶于dmf中，37℃搅拌10h,搅拌速度为800rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入20kdaα-聚赖氨酸(以α-聚赖氨酸上氨基的摩尔量为参考，α-聚赖氨酸与乌索酸的摩尔比为1:0.8,室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到α-plu。
[0093]
(2)载叶黄素酯改性α-聚赖氨酸纳米胶束(α-plu@lute)
[0094]
取1gα-plu在二甲基甲酰亚胺中充分溶解，按α-plu与叶黄素酯的质量比为1:0.2投入叶黄素酯，避光回流3h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得α-plu@lute。其水溶液色
泽较α-plu水溶液发生变化，前者为无色透明溶液，后者为透亮的浅黄色。
[0095]
(3)耐酸载叶黄素酯改性α-聚赖氨酸纳米胶束(cmc-α-plu@lute)的制备
[0096]
冰浴条件下，取1mgα-plu@lute和200μg羧甲基纤维素钠溶解在纯水中，搅拌30min，即得cmc-α-plu@lute胶束。
[0097]
实施例9
[0098]
(1)改性α-聚赖氨酸纳米粒(α-plu)的合成
[0099]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(3.24g,12mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(6.136g,12mmol)溶于dmf中，70℃搅拌5h,搅拌速度为200rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入3kdaα-聚赖氨酸(以α-聚赖氨酸上氨基的摩尔量为参考，α-聚赖氨酸与乌索酸的摩尔比为1:0.05,室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到α-plu。
[0100]
(2)载叶黄素酯改性α-聚赖氨酸纳米胶束(α-plu@lute)
[0101]
取1gα-plu在二甲基甲酰亚胺中充分溶解，按α-plu与叶黄素酯的质量比为1:0.01投入叶黄素酯，避光回流1h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得α-plu@lute。其水溶液色泽较α-plu水溶液发生变化，前者为无色透明溶液，后者为透亮的浅黄色。
[0102]
(3)耐酸载叶黄素改性α-聚赖氨酸纳米胶束(cmc-α-plu@lute)的制备
[0103]
冰浴条件下，取1mgα-plu@cur和10μg羧甲基纤维素钠溶解在纯水中，搅拌30min，即得cmc-α-plu@lute胶束。
[0104]
实施例10
[0105]
(1)改性聚乙酰亚胺纳米粒(piu)的合成
[0106]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(0.54g,2mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.767g,2mmol)溶于dmf中，4℃搅拌12h,搅拌速度为400rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入5kda聚乙酰亚胺(以聚乙酰亚胺上氨基的摩尔量为参考，聚乙酰亚胺与乌索酸的摩尔比为1:0.6,室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到piu。
[0107]
(2)载亚油酸改性聚乙酰亚胺纳米粒(piu@la)
[0108]
取1g piu在二甲基亚砜中充分溶解，按piu与亚油酸的质量比为1:0.1投入亚油酸，避光回流0.5h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得piu@la。其水溶液色泽较piu水溶液无显著变化。
[0109]
(3)耐酸载亚油酸改性聚乙酰亚胺纳米胶束(cmc-piu@la)的制备
[0110]
冰浴条件下，取1.1mg piu@la和100μg羧甲基纤维素钠溶解在生理盐水中，搅拌30min，即得cmc-piu@la胶束。
[0111]
实施例11
[0112]
(1)改性聚乙酰亚胺纳米粒(piu)的合成
[0113]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(2.16g,8mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(3.068g,8mmol)溶于dmf中，37℃搅拌10h,搅拌速度为800rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入10kda聚乙酰亚胺(以聚乙酰亚胺上氨基的摩尔量为参考，聚乙酰亚胺与乌索酸的摩尔比为1:0.8,室温搅拌至无肉眼可
见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到piu。
[0114]
(2)载亚油酸改性聚乙酰亚胺纳米粒(piu@la)
[0115]
取1g piu在二甲基亚砜中充分溶解，按piu与亚油酸的质量比为1:0.2投入亚油酸，避光回流3h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得piu@la。其水溶液色泽较piu水溶液无显著变化。。
[0116]
(3)耐酸载亚油酸改性聚乙酰亚胺纳米胶束(cmc-piu@la)的制备
[0117]
冰浴条件下，取1mg piu@la和200μg羧甲基纤维素钠溶解在纯水中，搅拌30min，即得cmc-piu@la胶束。
[0118]
实施例12
[0119]
(1)改性聚乙酰亚胺纳米粒(piu)的合成
[0120]
乌索酸(1g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(3.24g,12mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(6.136g,12mmol)溶于dmf中，70℃搅拌5h,搅拌速度为200rpm。另取一定量n,n-二甲基甲酰胺，用醋酸调节溶液ph至3～5左右，投入1kda聚乙酰亚胺(以聚乙酰亚胺上氨基的摩尔量为参考，聚乙酰亚胺与乌索酸的摩尔比为1:0.05,室温搅拌至无肉眼可见固体颗粒。将前述二者充分混匀后，加入适量乙醚洗涤，经旋蒸除去有机溶剂，得到piu。
[0121]
(2)载亚油酸改性聚乙酰亚胺纳米粒(piu@la)
[0122]
取1g piu在二甲基亚砜中充分溶解，按piu与亚油酸的质量比为1:0.01投入亚油酸，避光回流1h后旋蒸除去有机溶剂，复溶于水，即得piu@la。其水溶液色泽较piu水溶液无显著变化。
[0123]
(3)耐酸载亚油酸改性聚乙酰亚胺纳米胶束(cmc-piu@la)的制备
[0124]
冰浴条件下，取1mg piu@la和10μg羧甲基纤维素钠溶解在纯水中，搅拌30min，即得cmc-piu@la胶束。
[0125]
实施例13(以实施例1为例)
[0126]
ha-csu@ast胶束的性质及表征
[0127]
(1)ha-csu@ast胶束的形态及大小尺寸
[0128]
图2是ha-csu@ast胶束的高分辨透射电子显微镜图像，照片显示ha-csu@ast呈近似规则的球形，均匀直径(98.74
±
15.36nm)，图3为ha-csu@ast胶束的动态光散射结果与高分辨投射电子显微镜照片一致。
[0129]
(2)ha-csu@ast胶束的稳定性能评价
[0130]
ha-csu@ast胶束水溶液能够在强酸条件(ph＝1)下保持稳定，在预定的时间间隔内测量大小，用dls连续监测流体力学尺寸。图4结果表明胶束纳米结构在ph＝1时能稳定尺寸分布6小时，该时长为健康状态下人体胃转运平均时长的两倍。
[0131]
实施例14(以实施例1为例)
[0132]
(1)ha-csu@ast胶束的ph敏感性评价
[0133]
根据人体胃肠ph特征，ha-csu@ast(ast 100mg*ml-1
)分别用不同ph(1、3.5、5.5、6.5、7.5)的pbs溶液处理1h。分别测量处理前及处理后的粒径尺寸，图5结果表明，在ph＝1和ph＝3.5时，即模拟胃环境时，纳米胶束的粒径和未用酸溶液处理时相比无显著变化；在ph＝5.5时，即模拟肠环境时，纳米胶束由于聚阴离子层的逐渐解离产生一定的团聚，体现为粒径显著增大；在ph＝6.5和ph＝7.5时，即在中性环境中，纳米胶束的粒径不发生改变。
[0134]
(2)ha-csu@ast胶束的体内治疗效果
[0135]
以dss诱导的溃疡性结肠炎模型为例，选用6-8周龄的c57bl/6小鼠，使用葡聚糖硫酸钠以2.5％(w/v)水溶液给予小鼠自由饮水7天，诱导小鼠出现拉稀血便、体重减轻等溃疡性结肠炎的典型症状，得到uc模型。进一步的，设置治疗周期为15天，其间将ha-csu@ast以灌胃的形式给药6次。小鼠一共分为6组(每组n＝7)，分别为：control组、dss组、free ast组、ha-csu组、csu@ast组、ha-csu@ast组。
[0136]
在整个治疗周期中，定期观察，给每组小鼠进行评分，图6为各组小鼠疾病活动指数评分变化。从图中可知，ha-csu@ast组和csu@ast组相较于free ast组均显著降低了uc模型的疾病活动指数；此外，ha-csu@ast组较之csu@ast组疾病活动指数评分显著降低，进一步说明ha起到使载药纳米胶束在肠炎区域长效滞留的作用。
[0137]
治疗周期结束后，将小鼠处死并解剖，取其结肠测量其长度并进行对比。结肠长度是评价uc模型炎症程度的重要指标之一。图7为各组小鼠结肠长度对比图。其次，取脾脏测量其重量并计算其脾脏指数。临床上，脾脏指数即脾脏重量与体重的比值，是反映机体炎症程度的指标之一。图8为各组小鼠脾脏指数对比。结合图7-8对比分析可以看出，ha-csu@ast组相较于free ast组显著增加了uc模型的结肠长度；且ha-csu@ast组显著改善了小鼠机体炎症情况。
[0138]
(3)ha-csu@ast胶束的炎症部位滞留效果
[0139]
以dss诱导的溃疡性结肠炎(uc)模型小鼠，口服灌胃ha-csu@cy5.5 12h后取结肠组织进行冰冻切片，hochest蓝色荧光标记细胞核(a)，炎症探针绿色荧光标记炎症区域(b)，ha-csu@ast纳米胶束装载红色荧光染料cy5.5(c)，成像结果如图9，图d中cy5.5的信号与炎症标记区域有大面积重合，表明ha-csu@ast具有高效的炎症响应性粘附性能。
[0140]
实施例15(以实施例1为例)
[0141]
ha-csu@ast胶束的生物相容性评价
[0142]
用不同浓度ha-csu@ast分别处理鼠肠上皮细胞24h后使用cck-8试剂盒检测肠上皮细胞存活率，结果如图10。可知在0-25μg/ml范围内，ha-csu@ast对鼠肠上皮细胞存活率无显著影响，具有良好的生物相容性。
[0143]
本发明中，首次以乌索酸、阳离子聚合物(以壳聚糖为例)及聚阴离子(以玻璃酸钠为例)为原材料，探索并开发了一种可耐胃液消化型耐酸载营养素纳米胶束。对比不耐受胃液型纳米递送系统，该纳米胶束可在口服后转运到胃的过程中保护其包载的营养素，直到转运至肠环境中由于环境ph的改变，纳米胶束结构解离，释放出营养素，使其生物活性得以发挥。
[0144]
相较于健康状态，肠道炎症环境下的胃肠环境更为苛刻。该纳米胶束通过负载能够有效改善炎症环境的天然营养素—虾青素，干预小鼠溃疡性结肠炎模型，显著改善小鼠溃结模型的炎症状况，凸显出其较之不耐受胃液型纳米递送系统，拥有更高的递送效率，能够保护营养素不被胃液分解，延长其肠道滞留时间并在炎症区域凝胶化聚集，具有良好的生物相容性。这项发明在医疗领域具有巨大的市场潜力，并有着向其他新方向应用和发展的广阔前景。

技术特征：
1.一种耐酸载营养素纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将乌索酸、1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于溶剂中，搅拌反应，得到活化酯；(2)将含胺基阳离子聚合物与步骤(1)得到的活化酯进行酰胺反应，得到两亲阳离高聚分子；(3)将两亲阳离高聚分子与脂溶性活性物质在良溶剂中混匀，避光旋蒸回流去除良溶剂，得到载营养素纳米胶束；(4)将聚阴离子聚合物溶液与载营养素纳米胶束在水中混合，制得耐酸载营养素纳米胶束。2.根据权利要求1所述的耐酸载营养素纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乌索酸与1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:(1～6):(1～6)。3.根据权利要求1所述的耐酸载营养素纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含胺基阳离子聚合物为壳聚糖、ε-聚赖氨酸、
ɑ-聚赖氨酸和聚乙酰亚胺中的一种或几种。4.根据权利要求3所述的耐酸载营养素纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖的分子量范围为3～200kda，所述ε-聚赖氨酸和
ɑ-聚赖氨酸的分子量范围均为3～20kda，所述聚乙酰亚胺的分子量范围为1～10kda。5.根据权利要求1所述的耐酸载营养素纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，以氨基的摩尔量计，含胺基阳离子聚合物与乌索酸的摩尔比为1:(0.05～0.8)。6.根据权利要求1所述的耐酸载营养素纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述脂溶性活性物质为虾青素、姜黄素、叶黄素、叶黄素酯、或亚油酸。7.根据权利要求1所述的耐酸载营养素纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述两亲阳离高聚分子与脂溶性活性物质的质量比为1:(0.01～0.2)。8.根据权利要求1所述的耐酸载营养素纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述聚阴离子聚合物为玻璃酸钠、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠。9.根据权利要求1所述的耐酸载营养素纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述聚阴离子聚合物与载营养素纳米胶束的质量比为(0.01～0.2):1。10.采用权利要求1～9任一项所述的制备方法得到的耐酸载营养素纳米胶束。

技术总结
本发明提供一种耐酸载营养素纳米胶束及其制备方法，包括：(1)将乌索酸、1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于溶剂中，搅拌反应，得到活化酯；(2)将含胺基阳离子聚合物与步骤(1)得到的活化酯进行酰胺反应，得到两亲阳离高聚分子；(3)将两亲阳离高聚分子与脂溶性活性物质在良溶剂中混匀，避光旋蒸回流去除良溶剂，得到载营养素纳米胶束；(4)将聚阴离子聚合物溶液与载营养素纳米胶束在水中混合，制得耐酸载营养素纳米胶束。本发明制得的纳米胶束可耐受胃液消化，并通过延长肠道滞留时间在小鼠肠炎区域凝胶化聚集。延长肠道滞留时间在小鼠肠炎区域凝胶化聚集。


技术研发人员：杨金帆 李正晴 商宁 王佳辰
受保护的技术使用者：陕西科技大学
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/9/20