一种清热化毒丸HPLC指纹图谱的构建方法及应用

一种清热化毒丸hplc指纹图谱的构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及采用高效液相色谱法建立清热化毒丸的指纹图谱用于控制清热化毒丸的质量。


背景技术：

2.所谓热证，是指感受热邪或阳盛阴虚，人体的机能活动亢进所表现的证候。中医所说的“热”“火”“毒”都指的是热证的表现，而火甚于热，毒又甚于火，所以热毒是热证发展的最严重阶段。目前市场上用于清热解毒、消肿止痛的药物主要由清热化毒丸、化毒丸、五福化毒丸、牛黄解毒片、上清丸、银黄滴丸等。清热化毒类药物通过不仅能抗菌消炎，还能调理脏腑与内分泌，增强人体免疫功能达到快速康复的目的，该类药物具有见效快、疗程短、愈后不复发等优点。清热解毒用药是中医针对实热证的治疗药方。
3.清热化毒丸收载于部颁标准中药成方制剂第二册，具有清火化毒，消肿止痛的功效，用于小儿身热烦燥，咽喉肿痛，口舌生疮，皮肤疮疖，口臭便秘，疹后余毒末尽。方中连翘、黄连、黄芩、玄参等能清热解毒，消肿活血；青黛、水牛角凉血定惊，清热除湿，龙胆能泻肝胆实火，除下焦湿热，天花粉泻火清热，生津止渴，排脓消肿，大黄泻下攻积，清热泻火，茯苓利水渗湿，健脾宁心，菊花祛风除湿，桔梗止咳祛痰，冰片主散郁火，朱砂安神定惊，甘草调和诸药，护胃解毒，诸药合用，共奏清火化毒，消肿止痛之效。
4.清热化毒丸临床疗效良好，市场需求量大，但是质量控制标准较低，部颁标准中只收载了2项薄层鉴别，无含量测定项。只是有文献报道对其中单一成分进行了含量测定研究，如于远洋等研究了利用高效液相色谱法测定清热化毒丸丸中连翘酯苷a、黄芩苷的含量(于远洋，清热化毒丸含量测定研究，临床医药文献电子杂志，2020年，第45期，178-179页)；李铁纯等研究了利用高效液相色谱法同时测定了大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚4种蒽醌类成分的含量(李铁纯，高效液相色谱法同时测定清热化毒丸中4种蒽醌类化合物的含量，鞍山师范学院学报，2017年，第4期，34-37页)；郑琰等研究了利用高效液相色谱法测定清热化毒丸中连翘苷的含量(郑琰，高效液相色谱法测定清热化毒丸中连翘苷的含量，中国当代医药，2014年，第12期，61-62页)；袁启华研究了利用高效液相色谱法测定清热化毒丸中黄芩苷的含量(袁启华，清热化毒丸中黄芩苷含量的hplc法测定，临床合理用药杂志，2013年，第2期，66页)；刘汇等研究了利用高效液相色谱法测定清热化毒丸中黄芩苷和汉黄芩素的含量(刘汇，反相高效液相色谱法同时测定清热化毒丸中黄芩苷和汉黄芩素含量，中国药业，2013年，第1期，17-18页)；赵斐研究了利用高效液相色谱法测定清热化毒丸中黄芩苷的含量(赵斐，hplc法测定清热化毒丸中黄芩苷的含量，中国名族民间医药，2012年，第10期，48-49页)；赵斐研究了利用高效液相色谱法测定清热化毒丸中盐酸小檗碱的含量(赵斐，hplc法测定清热化毒丸中盐酸小檗碱的含量，齐鲁药事，2011年，第11期，646-647页)；王景涛等研究了利用高效液相色谱法测定清热化毒丸中牛蒡苷的含量(王景涛，高效液相色谱法测定清热化毒丸中牛蒡苷的含量，辽宁中医杂志，2006年，第12期，1624页)。目前为止，还未有利用指纹图谱的方法对清热化毒丸进行质量控制。
5.目前清热化毒丸含量测定方法都是用一种两种成分来控制清热化毒丸的内在质量，具有一定的片面性。要严格控制清热化毒丸的质量，只针对其中一两个化学成分进行表征和控制是不够的，必须对它的物质群整体予以控制。所以，建立清热化毒丸指纹图谱的检测方法及其应用就显得尤为重要，需要对其物质群体进行控制，有效表征质量标准。在本发明完成前，以清热化毒丸的含有的化成分为指标建立指纹图谱的方法未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于，提供一种清热化毒丸的指纹图谱检测方法及其应用，采用该方法构建的指纹图谱能够全面地反映清热化毒丸整体化学成分，为清热化毒丸的整体质量控制及评价提供了有效手段，从而更好地保证清热化毒丸的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保清热化毒丸的安全性和有效性。
7.本发明目的之二在于，经过系统的成分指认和药品不同批次共有峰的单味药材归属，较全面的反应清热化毒丸中各成分的现状，能够为清热化毒丸质量提供参考依据。
8.本发明中所述的清热化毒丸是由连翘300g、青黛150g、黄连30g、黄芩150g、大黄75g、菊花300g、龙胆150g、天花粉150g、玄参150g、茯苓300g
9.、桔梗300g、甘草150g、朱砂45g、冰片4.5g、水牛角浓缩粉9g等十五味中药制备而成。具体的制备方法为：以以上十五味，除水牛角浓缩粉外，朱砂水飞成极细粉，冰片研细；其余连翘等十二味粉碎成细粉，过筛，混匀；与上述水牛角浓缩粉等三味细粉配研，过筛，混匀；每100g粉末加炼蜜130～140g制成大蜜丸，即得。
10.本发明采用如下的技术方案：一种清热化毒丸的指纹图谱检测方法，采用高效液相色谱法测定其指纹图谱。具体的，所述的清热化毒丸的指纹图谱检测方法包括以下步骤：
11.a.供试品溶液的制备：取清热化毒丸，剪碎，取约0.5～2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25～100ml，称取重量，回流提取30～90分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
12.b.对照品溶液的制备：分别精密称取绿原酸、龙胆苦苷、甘草苷、连翘酯苷a、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成质量浓度分别为0.006、0.02、0.02、0.04、0.04、0.01、0.01、0.005mg/ml的混合对照品溶液，作为对照品溶液；
13.c.测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～15μl，注入高效液相色谱仪，记录125分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得清热化毒丸的指纹图谱。
14.上述方法中，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.02-0.3％甲酸溶液为流动相b，梯度洗脱，流速0.5～1.5ml/min，柱温25-45℃，检测波长210～360nm；理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。
15.优选的，所述的清热化毒丸的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
16.a.供试品溶液的制备：取清热化毒丸，剪碎，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称取重量，回流提取60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
17.b.对照品溶液的制备：分别精密称取绿原酸、龙胆苦苷、甘草苷、连翘酯苷a、黄芩
苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，精密称定，置10ml量瓶中，以甲醇为溶剂，分别配制成质量浓度分别为0.5980、0.4228、0.4056、0.4001、0.4141、0.5025、0.5003、0.5060mg/ml的对照品储备液溶液；再分别精密吸取对照品储备液0.1、0.5、0.5、1、1、0.2、0.2、0.1ml置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.00598、0.02114、0.02028、0.004001、0.04141、0.01005、0.01001、0.00506mg/ml的混合对照品溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为混合对照品溶液。
18.c.测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录125分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得清热化毒丸的指纹图谱。
19.所述高效液相色谱测定的色谱条件为：所述高效液相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为：intersil c18 250
×
4.60mm；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长280nm，理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。
20.前述的清热化毒丸的指纹图谱检测方法中，梯度洗脱过程中，流动相a、b的比例变化为：0-10min，8％a；10-20min，8～15％a；20-40min，15％a；40-55min，15～20％a；55-70min，20～25％a；70-80min，25％a；80-100min，25～45％a；100-110min，45～58％a；110-125min，58～70％a。
21.所述指纹图谱具有29个共有峰，将对照品所测得的色谱图与样品指纹图谱进行对比，在与各对照品相同保留时间处的色谱峰即得到了指认，对照品色谱图见图1。结果显示，其中2、4、6、8、19、21、26、27号色谱峰分别被指认为绿原酸、龙胆苦苷、甘草苷、连翘酯苷a、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素。
22.本发明的有益效果是：
23.1、本发明建立了10批清热化毒丸的hplc指纹图谱，相似度均大于0.90，可以更加全面的反应清热化毒丸所含有的化学信息，更好的表征其质量。
24.2、标定了29个共有峰，共有峰中2、4、6、8、19、21、26、27号色谱峰分别被指认为绿原酸、龙胆苦苷、甘草苷、连翘酯苷a、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素。
25.3、由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息，因此，本发明选择在280nm波长处进行测定，其出峰较多，反映的信息较完全；各个峰吸收值良好，基线平稳，也避免了近紫外杂质峰较大吸收情况。
26.4、本发明建立的高效液相指纹图谱方法首次实现了对清热化毒丸全方的质量控制，不是对单一化合物或药材进行鉴别，能更有效地指导投料、严格规范生产操作，确保临床用药安全、有效。
27.5、按照标准指纹图谱条件进行色谱峰归属，29个共有峰分别归属于大黄、菊花、龙胆、连翘、甘草、黄芩、黄连、青黛等八味药材；其中1号峰归属于大黄，2号峰归属于菊花，3号峰归属于龙胆，4号峰归属于龙胆，5号峰归属于连翘，6号峰归属于甘草，7号峰归属于黄芩，8号峰归属于连翘，9号峰归属于菊花，10号峰归属于黄芩，11号峰归属于黄芩、连翘，12号峰归属于菊花、连翘，13号峰归属于菊花，14号峰归属于菊花，15号峰归属于黄连，16号峰归属于菊花，17号峰归属于菊花，18号峰归属于黄芩，19号峰归属于黄芩，20号峰归属于黄芩、连翘，21号峰归属于黄连，22号峰归属于甘草，23号峰归属于黄芩，24号峰归属于大黄、菊花，25号峰归属于黄芩，26号峰归属于黄芩，27号峰归属于黄芩，28号峰归属于青黛，29号峰归
属于青黛。
附图说明
28.图1混合对照品溶液hplc色谱图
29.图2清热化毒丸共有模式图谱
30.图3 10个批次清热化毒丸指纹图谱叠加图
31.图4样品指纹图谱与各药材色谱图对比归属图
32.图5 360nm检测波长条件下清热化毒丸图谱
33.图6 320nm检测波长条件下清热化毒丸图谱
34.图7 280nm检测波长条件下清热化毒丸图谱
35.图8 230nm检测波长条件下清热化毒丸图谱
36.图9 210nm检测波长条件下清热化毒丸图谱
37.图10 203nm检测波长条件下清热化毒丸图谱
具体实施方式
38.为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明清热化毒丸的hplc指纹图谱建立及其指纹图谱作进一步的说明。
39.实施例1：检测不同批次的清热化毒丸的指纹图谱
40.1、仪器与试药
41.1.1agilent 1220型高效液相色谱仪(美国安捷伦)；kq-250b型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；bsa 124s电子天平(赛多利斯)；quintix35-1cn(赛多利斯)。
42.1.2纯净水(娃哈哈)，乙腈(色谱纯)，其他试剂均为分析纯。绿原酸、龙胆苦苷、甘草苷、连翘酯苷a、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素对照品(批号分别为110753-202119、110770-202219、111610-202209、111810-202209、110715-202223、110713-202015、111595-201808、111514-202207，纯度分别为96.3％、98.1％、95.2％、96.4％、97.2％、85.9％、97.9％、100.0％)。清热化毒丸(批号：20220401、20220402、20220403、20220601、20220602、20221101、20221102、20230101、20230102、20230201，吉林吉春制药股份有限公司)。
43.2、指纹图谱测定
44.2.1色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长280nm，流动相梯度洗脱程序如下：0-10min，8％a；10-20min，8～15％a；20-40min，15％a；40-55min，15～20％a；55-70min，20～25％a；70-80min，25％a；80-100min，25～45％a；100-110min，45～58％a；110-125min，58～70％a。
45.2.2供试品溶液的制备：取清热化毒丸，剪碎，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称取重量，回流提取60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
46.2.3对照药材及对照提取物的制备：按照处方比例及制备方法，称取对照提取物或对照药材，按照供试品制备方法进行制备。
47.2.4对照品溶液的制备：分别精密称取绿原酸、龙胆苦苷、甘草苷、连翘酯苷a、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，精密称定，置10ml量瓶中，以甲醇为溶剂，分别配制成质量浓度分别为0.5980、0.4228、0.4056、0.4001、0.4141、0.5025、0.5003、0.5060mg/ml的对照品储备液溶液；再分别精密吸取对照品储备液0.1、0.5、0.5、1、1、0.2、0.2、0.1ml置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.00598、0.02114、0.02028、0.004001、0.04141、0.01005、0.01001、0.00506mg/ml的混合对照品溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为混合对照品溶液；
48.2.4测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录125分钟内的色谱图，分别见图1、图2。
49.实施例2：10批次清热化毒丸指纹图谱分析
50.1、指纹图谱相似度分析
51.取10批次清热化毒丸，按供试品制备方法制备，色谱条件进样分析，记录清热化毒丸指纹图谱，采用国家药典委员会发行的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012a版》对10批次清热化毒丸指纹图谱进行相似度分析，设定s1为参照图谱，利用中位数法，时间窗宽度设置0.1min，共标定29个共有峰，10批次清热化毒丸的相似度均大于0.90，相似度评价结果见表1。29个共有峰相对保留时间基本一致，而相对峰面积存在较大差别，标准指纹图谱数据见表2。10批次清热化毒丸指纹图谱叠加图见图3，图3中s1-s10分别对应批号20220401、20220402、20220403、20220601、20220602、20221101、20221102、20230101、20230102、20230201。
52.表1 10批清热化毒丸样品相似度评价结果
53.[0054][0055]
表2标准指纹图谱数据
[0056]
[0057][0058]
2、共有峰指认：将对照品所测得的hplc色谱图(图1，其中2号峰为绿原酸、4号峰为为龙胆苦苷、6号峰为甘草苷、8号峰为连翘酯苷a、19号峰为黄芩苷、21号峰为盐酸小檗碱、26号峰为黄芩素、27号峰为汉黄芩素))与样品指纹图谱(图3)进行对比，在与各对照品相同保留时间处的色谱峰即得到了指认。结果显示，29共有峰中2、4、6、8、19、21、26、27号色谱峰分别被指认为绿原酸、龙胆苦苷、甘草苷、连翘酯苷a、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素。
[0059]
3、药材归属：按照标准指纹图谱条件进行色谱峰归属，见图4，图4中s1-s15分别为连翘、黄芩、龙胆、茯苓、朱砂、青黛、大黄、天花粉、桔梗、冰片、黄连、菊花、玄参、甘草、水牛角浓缩粉药材，s16为样品。29个共有峰分别归属于大黄、菊花、龙胆、连翘、甘草、黄芩、黄连、青黛等八味药材；其中1号峰归属于大黄，2号峰归属于菊花，3号峰归属于龙胆，4号峰归属于龙胆，5号峰归属于连翘，6号峰归属于甘草，7号峰归属于黄芩，8号峰归属于连翘，9号峰归属于菊花，10号峰归属于黄芩，11号峰归属于黄芩、连翘，12号峰归属于菊花、连翘，13号峰归属于菊花，14号峰归属于菊花，15号峰归属于黄连，16号峰归属于菊花，17号峰归属于菊花，18号峰归属于黄芩，19号峰归属于黄芩，20号峰归属于黄芩、连翘，21号峰归属于黄连，22号峰归属于甘草，23号峰归属于黄芩，24号峰归属于大黄、菊花，25号峰归属于黄芩，26号峰归属于黄芩，27号峰归属于黄芩，28号峰归属于青黛，29号峰归属于青黛。
[0060]
实施例3、波长的选择
[0061]
取20220401批样品进行试验，分别考察了360、320、280、230、210、203等不同波长下的色谱图的整体效果，其它色谱条件与实施例1相同，见图5、6、7、8、9、10。由所测色谱图知，波长为360nm时，峰值很小，响应值低且峰的数量很少(图5)；波长为320nm时，响应值低且峰的数量相对较少(图6)；波长为280nm时，色谱图基线较平，峰形较佳，峰数量较多、响应值为最高，为最佳条件(图7)；波长为230nm时，色谱图基线不平，色谱图基线没有处于标准位置，峰数量较少(图8)。波长为210时，色谱图基线不平，色谱图基线没有处于标准位置，色谱峰的波动巨大(图9)；波长为203nm时，色谱图基线没有处于标准位置(图10)。综合选择，以280nm为检测波长的指纹图谱最能全面反映制剂的成分，而且峰形最好，所以优选280nm为最佳检测波长。
[0062]
实施例4、方法学考察
[0063]
取20220401批样品进行试验，色谱条件及供试品制备方法与实施例1相同。
[0064]
(1)精密度试验
[0065]
取清热化毒丸，制备供试品溶液，连续进样6次，记录29个主要色谱峰保留时间和各峰面积。以黄芩苷为参照峰，相对峰面积rsd＜3.0％(n＝6)，相对保留时间rsd＜1.0％(n＝6)，证明仪器精密度良好。实验结果见表3。
[0066]
(2)稳定性试验
[0067]
取清热化毒丸，制备供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24h进行测试，记录29个主要色谱峰保留时间和各峰面积。以黄芩苷为参照峰，相对峰面积rsd＜3.0％(n＝6)，相对保留时间rsd＜1.0％(n＝6)，证明样品在24h内稳定性良好。实验结果见表3。
[0068]
(3)重复性试验
[0069]
取清热化毒丸，制备供试品溶液6份，进行测试，记录29个主要色谱峰保留时间和各峰面积。以黄芩苷为参照峰，相对峰面积rsd＜3.0％(n＝6)，相对保留时间rsd＜1.0％(n＝6)，证明稳定性良好。实验结果见表3。
[0070]
表3方法学考察实验结果
[0071]
[0072]

技术特征：
1.一种清热化毒丸hplc指纹图谱构建方法，其特征在于：包括以下步骤：a.供试品溶液的制备：取清热化毒丸，剪碎，取约0.5～2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25～100ml，称取重量，回流提取30～90分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；b.对照品溶液的制备：分别精密称取绿原酸、龙胆苦苷、甘草苷、连翘酯苷a、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成质量浓度分别为0.006、0.02、0.02、0.04、0.04、0.01、0.01、0.005mg/ml的混合对照品溶液，作为对照品溶液；c.测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～15μl，注入高效液相色谱仪，记录125分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得清热化毒丸的指纹图谱。2.根据权利要求1所述的一种清热化毒丸hplc指纹图谱构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.02-0.3％甲酸溶液为流动相b，梯度洗脱，流速0.5～1.5ml/min，柱温25-45℃，检测波长210～360nm；理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。3.根据权利要求1所述的一种清热化毒丸hplc指纹图谱构建方法，其特征在于：包括以下步骤：a.供试品溶液的制备：取清热化毒丸，剪碎，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称取重量，回流提取60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；b.对照品溶液的制备：分别精密称取绿原酸、龙胆苦苷、甘草苷、连翘酯苷a、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，精密称定，置10ml量瓶中，以甲醇为溶剂，分别配制成质量浓度分别为0.5980、0.4228、0.4056、0.4001、0.4141、0.5025、0.5003、0.5060mg/ml的对照品储备液溶液；再分别精密吸取对照品储备液0.1、0.5、0.5、1、1、0.2、0.2、0.1ml置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.00598、0.02114、0.02028、0.004001、0.04141、0.01005、0.01001、0.00506mg/ml的混合对照品溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为混合对照品溶液；c.测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录125分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得清热化毒丸的指纹图谱。4.根据权利要求3所述的一种清热化毒丸hplc指纹图谱构建方法，其特征在于：所述高效液相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为：intersil c
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4.60mm；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长280nm，理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。5.根据权利要求2或4所述的一种清热化毒丸hplc指纹图谱构建方法，其特征在于：梯度洗脱过程中，流动相a、b的比例变化为：0-10min，8％a；10-20min，8～15％a；20-40min，15％a；40-55min，15～20％a；55-70min，20～25％a；70-80min，25％a；80-100min，25～45％a；100-110min，45～58％a；110-125min，58～70％a。6.如权利要求1-5所述清热化毒丸hplc指纹图谱构建方法，其特征在于：所述指纹图谱共有29个共有峰，其中2、4、6、8、19、21、26、27号色谱峰分别被指认为绿原酸、龙胆苦苷、甘草苷、连翘酯苷a、黄芩苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素；按照标准指纹图谱条件进行色谱
峰归属，29个共有峰分别归属于大黄、菊花、龙胆、连翘、甘草、黄芩、黄连、青黛等八味药材；其中1号峰归属于大黄，2号峰归属于菊花，3号峰归属于龙胆，4号峰归属于龙胆，5号峰归属于连翘，6号峰归属于甘草，7号峰归属于黄芩，8号峰归属于连翘，9号峰归属于菊花，10号峰归属于黄芩，11号峰归属于黄芩、连翘，12号峰归属于菊花、连翘，13号峰归属于菊花，14号峰归属于菊花，15号峰归属于黄连，16号峰归属于菊花，17号峰归属于菊花，18号峰归属于黄芩，19号峰归属于黄芩，20号峰归属于黄芩、连翘，21号峰归属于黄连，22号峰归属于甘草，23号峰归属于黄芩，24号峰归属于大黄、菊花，25号峰归属于黄芩，26号峰归属于黄芩，27号峰归属于黄芩，28号峰归属于青黛，29号峰归属于青黛。7.权利要求1～6任一项所述清热化毒丸指纹图谱的构建方法得到的清热化毒丸指纹图谱。8.权利要求7所述清热化毒丸指纹图谱在清热化毒丸质量控制中的应用。

技术总结
本发明涉及一种清热化毒丸的指纹图谱构建和检测方法，构建方法包括如下步骤：取对照品和清热化毒丸样品，分别制备对照品溶液和供试品溶液；采用高效液相色谱法对对照品溶液和供试品溶液进行检测，获得相应对照品图谱和样品图谱；将样品图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，获得具有标识性的清热化毒丸的指纹图谱，共获得29个共有峰，并且指认了其中的7个成分，并对29个共有峰进行了成分归属。本发明构建得到清热化毒丸的指纹图谱，色谱峰丰富，且包含归属于连翘、龙胆、黄芩、黄连、菊花、大黄、甘草、青黛等多味药材的有效成分，能够更全面地反应清热化毒丸的整体化学成分，为清热化毒丸的整体质量控制及评价提供了有效手段，克服了原质量控制方法的单一性和片面性，更好的监控和评价本品质量，指导规范化生产，具有较高的应用价值。具有较高的应用价值。


技术研发人员：南敏伦 杨振 林艳玲 房云鹏 赵宏宇 赵昱玮 赫玉芳 李锦锦 龚本义 张瀚水
受保护的技术使用者：吉林省中医药科学院（吉林省中医药科学院第一临床医院）
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/9/20