一种单胺氧化酶B抑制剂及其在抗神经退行性疾病药物中的应用

一种单胺氧化酶b抑制剂及其在抗神经退行性疾病药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及天然产物活性筛选及神经退行性疾病医药领域，具体为一种单胺氧化酶b抑制剂及其在抗神经退行性疾病药物中的应用。


背景技术：

2.帕金森病(parkinson’s disease，pd)，又名震颤麻痹，是世界上第二大常见的进行性神经退行性疾病，为中老年人最常见的锥体外系疾病。在我国，65岁以上人群pd的患病率大约是1.7％，总人数300万，约占全球总患病人数的50％。病理基础主要为中脑黑质致密部多巴胺能神经元的变性死亡。
3.单胺氧化酶-b(monoamine oxidase b，mao-b)是一种广泛分布在中枢和外周组织的细胞线粒体外膜上，调控单胺类神经递质类代谢和分布的含黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)酶。mao-b作为体内降解多巴胺的关键酶，其辅酶fad的活性中心的半胱氨酸残基可以与多巴胺产生反应最终产生氨、醛类和过氧化氢。mao-b的过表达或活性增加是pd发病的重要因素，脑组织中所含mao-b活性增加是脑功能衰退指标之一。mao-b抑制剂的神经保护作用尤为突出，通过降低脑内自由基生成，发挥对中枢神经系统的保护作用，可改善患者的运动症状，长期使用不会产生精神障碍、运动并发症、异动症等不良反应，特别适用于pd、阿尔茨海默症等中枢神经系统退化性疾病的治疗。但商业化mao-b抑制剂主要为司来吉兰、雷沙吉兰及沙芬酰胺，临床可选择性较少，雷沙吉兰在我国使用最为普遍，但由于其属于不可逆抑制剂，存在一定的副作用及耐药性。
4.天然产物提取物是针对这种神经退行性疾病药物研发的丰富来源。从传统中药中发现有mao-b抑制效果的生物活性成分在神经退行性疾病的药物研发中至关重要。目前，从天然产物中筛选mao-b抑制剂主要有活性追踪分离法、磁珠配体垂钓法、亲和超滤法及在线的柱后生物活性测定法，但均存在通量低及化合物的分离与活性评价不同步的技术缺陷，本发明基于mao-b抑制性的微流分活性筛选技术，从中药川芎中发现单苯酞类化合物-瑟丹酸内酯、新蛇床内酯，据相关文献报道，其具有抗炎、镇静、抗心血管疾病等丰富的生物活性，但其抑制mao-b的活性尚未报道。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种单胺氧化酶b抑制剂。所述单胺氧化酶b抑制剂的有效成分为瑟丹酸内酯和新蛇床内酯，通过从天然产物川芎提取物中提取得到。经生物活性检测发现瑟丹酸内酯和新蛇床内酯具有极好的mao-b抑制活性，是一类高活性的mao-b抑制剂，可以实现对重组人单胺氧化酶b的抑制作用，其经过sh-sy5y神经细胞活性检测均表现出良好的神经保护作用，有望作为一种新的单胺氧化酶b抑制剂类抗神经退行性疾病治疗药物推广和使用。
6.本发明的第二目的在于提供一种单胺氧化酶b抑制剂及其在抗神经退行性疾病药
物中的应用。
7.本发明的首要目的通过如下技术方案可以实现：
8.一种单胺氧化酶b抑制剂，含有式ⅰ和/或式ⅱ的单苯酞类化合物，
[0009][0010]
优选地，所述式ⅰ为瑟丹酸内酯(sedanolide，又名3-丁基-3a,4,5,6-四氢-1(3h)-异苯并呋喃酮，cas：6415-59-4)；所述式ⅱ为新蛇床内酯(neocnidilide，又名(3s,3ar)-3-丁基-3a,4,5,6-四氢-1(3h)-异苯并呋喃酮或(3s,3ar)-(-)-瑟丹酸内酯，cas：4567-33-3)；所述式ⅰ和式ⅱ为苯酞类同分异构体。
[0011]
优选地，所述单胺氧化酶b抑制剂为人源单胺氧化酶b抑制剂。
[0012]
优选地，所述式ⅰ和/或式ⅱ的单苯酞类化合物来源于川芎提取物。
[0013]
优选地，所述式ⅰ和/或式ⅱ的单苯酞类化合物通过基于mao-b抑制性的微流分活性筛选技术，从川芎中发现和筛选出。
[0014]
优选地，所述式ⅰ和/或式ⅱ的单苯酞类化合物具体的筛选步骤如下，
[0015]
将20μl川芎半制备分段样品经微流分活性筛选平台采用接板液相条件分离分析，收集于384黑色微孔板中，采用384微孔板活性检测条件经过酶标仪活性检测得到川芎半制备样品的单胺氧化酶b抑制活性谱图，进而采用质谱液相条件和质谱条件对川芎半制备样品进行液质联用分析，依据活性谱图及液质联用数据进而从川芎中筛选出了瑟丹酸内酯和/或新蛇床内酯。
[0016]
优选地，所述接板液相条件：岛津lc-20at高效液相系统，色谱柱：中谱rd-c18(5μm，4.6
×
250mm)，流速：0.5ml/min；检测波长：220nm，254nm，280nm；流动相：a相—0.1％甲酸-水，b相—0.1％甲酸-甲醇；进样量：20μl；柱温：30℃；洗脱条件：0-30min，55％-70％ b，30-60min，70％-80％ b，60-61min，80-100％ b。
[0017]
优选地，所述384微孔板活性检测条件：向干燥的样品板的各孔中排枪加入25μl的16μg/mlmao-b酶溶液，2000rpm离心5min，加入25μl初始浓度为92μm的犬尿胺二氢溴酸盐(kynuramine,kyn)底物溶液，2000rpm离心2min，转移至biotek synergy h2酶标仪中，37℃孵育10min，设置荧光激发波长310nm，发射波长370nm的条件下进行1小时动力学检测，得到动力学曲线，计算信号增长斜率，利用origin 9.0软件根据斜率-液相数据构建生物活性谱图，以上实验重复2次。
[0018]
优选地，所述质谱液相条件：thermo scientific sii高效液相系统，色谱柱：中谱rd-c18(5μm，4.6
×
250mm)；流速：0.5ml/min；pda检测器(190-800nm)，检测波长：280、254、220nm；流动相：a相—0.1％甲酸-水，b相—0.1％甲酸-甲醇，进样量：2μl；柱温：30℃；洗脱条件：0-30min，55％-70％ b，30-60min，70％-80％ b，60-61min，80-100％ b。
[0019]
优选地，所述质谱条件：thermo scientific orbitrap exploris 120质谱系统，应用模式：小分子，离子类型：h-esi；喷涂电压：静态；正离子：3500v；负离子：3000v；气体模
式：静态；鞘气：50arb；辅助气体：10arb；扫气：1arb；离子传输管温度：320℃，蒸发器温度400℃，以亮氨酸脑啡肽为内标校正质量精度。
[0020]
一级扫描：全扫描；orbitrap分辨率：60000；扫描范围(m/z)：100-1000；射频透镜(％)：70；正离子与负离子均扫描；二级扫描：隔离窗口(m/z)：1.5；碰撞能量类型：归一化；hcd碰撞能量(％)：20、50、80；orbitrap分辨率：15000；扫描范围模式：自动。
[0021]
本发明的第二目的通过如下技术方案可以实现：
[0022]
一种单胺氧化酶b抑制剂在抗神经退行性疾病药物中的应用。
[0023]
优选地，所述抗神经退行性疾病药物为片剂、滴丸、舌下含片、注射液、颗粒剂、胶囊剂、口服液、微囊微球制剂、喷雾剂、靶向制剂、粉针剂或气雾剂中的至少一种。
[0024]
优选地，所述抗神经退行性疾病为中枢神经系统病症、精神病学病症、神经退行性病症和疼痛病症，如神经退行性疾病、心血管疾病、脑卒中及中风。
[0025]
优选地，所述单胺氧化酶b抑制剂通过抑制单胺氧化酶b的活性提升体内多巴胺的含量，实现对神经退行性疾病的治疗作用。
[0026]
具体地，所述单胺氧化酶b抑制剂通过抑制人神经瘤细胞母细胞中的单胺氧化酶b发挥神经保护作用达到抗神经退行性疾病效果，式ⅱ的单苯酞类化合物与第二代单胺氧化酶b抑制剂药物雷沙吉兰的神经保护作用一致。
[0027]
优选地，所述抗神经退行性疾病药物为预防和/或治疗帕金森病及其并发症的药物组合物。
[0028]
进一步地，通过帕金森细胞活性检测，考察瑟丹酸内酯及新蛇床内酯作为mao-b抑制剂，在神经细胞sh-sy5y中，起到对抗6-ohda神经毒性引起的细胞凋亡，发挥神经保护作用。
[0029]
本发明所公开的单胺氧化酶抑制剂，包括单苯酞类化合物，所述单苯酞类化合物为瑟丹酸内酯和新蛇床内酯，是来源于中药川芎提取物的一对同分异构体化合物。在之前的研究中，仅发现瑟丹酸内酯和新蛇床内酯的抗炎、镇静等活性，并得以应用，但是没有针对神经退行性靶点单胺氧化酶b抑制活性相关的具体研究，而本技术经过大量的实验发现，化合物瑟丹酸内酯和新蛇床内酯对人源单胺氧化酶b具有明显的抑制作用。经实验发现，化合物瑟丹酸内酯和新蛇床内酯对单胺氧化酶b的抑制活性分别为103nmol/l和405nmol/l，且对人源单胺氧化酶b表现为可逆抑制。另外，化合物瑟丹酸内酯和新蛇床内酯均对帕金森sh-sy5y细胞表现出剂量依赖的神经保护作用，且化合物瑟丹酸内酯的神经保护作用与雷沙吉兰相当。因此，本发明提供的化合物瑟丹酸内酯和新蛇床内酯可以作为一种安全有效的天然产物成分，为制备治疗神经退行性疾病方面药物提供理论基础，有望作为一种新的单胺氧化酶b抑制剂类抗神经退行性疾病药物进行推广和使用。
[0030]
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果如下：
[0031]
(1)本发明所述的化合物瑟丹酸内酯或新蛇床内酯作为单胺氧化酶抑制剂的结构类型新颖；
[0032]
(2)本发明所述的化合物瑟丹酸内酯或新蛇床内酯对单胺氧化酶具有良好的抑制活性及可逆抑制性，作用于帕金森细胞模型后表现出与第二代商业化药物雷沙吉兰相当的神经保护作用；
[0033]
(3)本发明可对筛选得到的较优化合物结构进一步优化，从而提高其对单胺氧化
酶b的抑制活性及选择性；
[0034]
(4)本发明制备的单胺氧化酶b抑制剂，在治疗中枢神经系统退化性疾病的药物等方面有良好的应用前景。
附图说明
[0035]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0036]
图1为本发明实施例1单胺氧化酶b抑制剂的微流分活性筛选平台图；
[0037]
图2为本发明实施例3川芎半制备样品的单胺氧化酶b抑制剂筛选活性轮廓图；
[0038]
图3为本发明实施例4从川芎半制备样品中鉴定化合物ⅰ、ⅱ的质谱图；
[0039]
图4为本发明实施例5化合物ⅰ、ⅱ的液相峰与川芎半制备样品活性峰对比图；
[0040]
图5为本发明实施例6化合物ⅰ、ⅱ及雷沙吉兰对单胺氧化酶b半数抑制浓度拟合图；
[0041]
图6为本发明实施例7化合物ⅰ、ⅱ抑制mao-b的可逆性研究结果图；
[0042]
图7为本发明实施例8化合物ⅰ、ⅱ对sh-sy5y细胞神经保护作用结果图。
具体实施方式
[0043]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0044]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0045]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0046]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
[0047]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0048]
本发明首次基于单胺氧化酶b微流分抑制活性筛选平台从出川芎中发现两种苯酞类及其新应用，即：将两种苯酞类用于制备抗神经退行性疾病药物方面的应用。
[0049]
实施例1
[0050]
单胺氧化酶b微流分抑制活性分析分离筛选平台
[0051]
基于对岛津lc-20at高效液相系统进行管路改装，整个平台主要包括分离分析检测部分与流分收集部分，如图1所示。
[0052]
(1)分离分析检测部分，使用250μm内径的peek管连接高效液相的四元泵、手动阀、色谱柱部分，随后将柱后流过的成分利用三通、不同长度的120μm内径的peek管进行分流，通过调整三通出口处两条peek管的长度来改变管路内的压力，进而改变了管路内的流量，使柱后流分约1/3的部分流向dad、ms等检测器，约2/3的部分流向流分收集装置。
[0053]
(2)流分收集部分，将管路固定在一台ctc hts pal(液质多功能全自动进样器系统)自动进样的机械臂上，接样流分出口末端的流分收集点样器则由二通、连接头等配件连接一截约长为8cm的内径100μm的毛细管组成。采用调试过的ctc hts pal自动进样系统的软件pal cycle composer and drivers，通过执行所写的程序语言，使机械臂与固定在上面的点样器可在x、y、z轴上精准平行移动，平移距离的精确度最高可达到0.1mm，孔板单孔停留时间频率最高可实现0.1s/孔。
[0054]
(3)生物活性测试的工作流程
[0055]
样品进入微流分活性分析筛选平台，首先进入检测模块dad检测物质出峰情况，相应流分经过流分收集到微孔板中，由于孔板流动相有机溶剂的存在对酶的生物不相容性及复杂体系的梯度洗脱带来有机溶剂含量的不均一性等问题，因此需将收集有流分的微孔板放置于真空干燥箱中干燥，去除流动相中的水、有机溶剂、甲酸等干扰溶剂，而不破坏残留在微孔板中化合物的化学结构；待去除干扰溶剂后，取出干燥的黑色微孔板使用多通道电子移液器向孔板中依次加入酶和底物溶液；随后将加样完成的微孔板放置于多功能酶标仪中，进行动力学检测，从而实现活性评估。
[0056]
(4)生物活性检测的原理
[0057]
基于单胺氧化酶的氧化脱氨特性，且考虑到在复杂体系中进行高通量活性检测的需求——即操作简单、高灵敏、信噪比高，可适配微流分活性分析筛选平台等特点，本发明选择犬尿胺二氢溴酸盐(kynuramine,kyn)作为mao-b的底物，mao-b可将kyn的甲基氧化脱氨形成荧光产物4-羟基喹啉(4-hydroxy quinoline,4-hq)，产物4-hq在310nm激发波长与370nm发射波长下产生高灵敏荧光信号，用于测试mao-b的活性。
[0058]
该体系依据相同时间相同量底物被mao-b氧化脱氨生成产物，以产物的荧光信号动力学检测的速率来表示mao-b的活性，以不含有mao-b抑制剂作为对照，比较含和/或不含抑制剂的产物生成速率的荧光信号线性增长的速率(斜率)大小来判断体系中是否有抑制成分存在及抑制性强弱。
[0059]
(5)活性图谱的构建
[0060]
根据微孔板上流分收集的先后顺序对板上的每个孔进行编号排序，根据日志计算出每个孔对应的流分收集时间。在收集有样品的微孔板中，对板上每个孔的荧光增长动力学曲线的斜率值按上述已编号的顺序进行排列。以孔板在酶标仪中检测时间点为x轴，以单孔不同时间所得的信号为y轴，利用excel表格斜率公式计算出微孔板中每个孔所检测到的信号增长斜率，将微孔板每个孔的斜率按照接板时间顺序排列。再求出所有斜率值的中位数，然后用所有的斜率值除以所求得的中位数，对所有的增长斜率进行标准化以便于多次实验测试结果间的平行比较。最后以流分收集时间为x轴，以相应标准化的斜率值为y轴，使
60min，70％-80％ b，60-61min，80-100％b。
[0076]
(3)柱后微流分收集：将20μl样品注入微流分筛选系统，样品经过液相系统分离分析后，从进样开始柱后流分以8s/孔的频率ctc自动装置收集，此外在样品收集之前向384微孔板的中加入10μl 10％ dmso水溶液，收集完成后记录根据单孔收集日志计算每孔时间；收集样品后的384微孔板置于真空干燥箱中，35℃下真空干燥24h，除去流动相；
[0077]
(4)384微孔板活性检测：向干燥的样品板的各孔中排枪加入25μl的16μg/mlmao-b酶溶液，2000rpm离心5min，加入25μl初始浓度为92μmol/l的kyn底物溶液，2000rpm离心2min，转移至biotek synergy h2酶标仪中，37℃孵育10min，设置荧光激发波长310nm，发射波长370nm的条件下进行1小时动力学检测，得到动力学曲线，计算信号增长斜率，利用origin 9.0软件根据斜率-液相数据构建生物活性谱图，以上实验重复两次。
[0078]
如图2所示，单胺氧化酶b的活性峰与川芎半制备样品的进样浓度成正相关，42min的液相洗脱峰下对应较大的单胺氧化酶b的活性峰，即该峰对应的化合物具有较高的单胺氧化酶b抑制活性。
[0079]
实施例4
[0080]
质谱鉴定川芎半制备分段中天然单胺氧化酶b抑制剂
[0081]
已过0.22μm有机系微孔滤膜的川芎液相半制备分段样品续滤液，注入超高效液相色谱-静电轨道离子阱质谱仪进行色谱分析及结构鉴定。
[0082]
(1)样品配制：取构建活性谱图的川芎半制备液相高浓度进样溶液100μl，置于含内插管的棕色进样小瓶中，加入100μl 0.22μm有机系微孔滤膜过滤的70％甲醇(meoh)稀释样品作为质谱进样溶液。
[0083]
超高效液相色谱-静电轨道离子阱质谱联用技术中各参数的设置条件如下：
[0084]
(2)质谱条件：thermo scientific orbitrap exploris 120质谱系统，应用模式：小分子，离子类型：h-esi；喷涂电压：静态；正离子：3500v；负离子：3000v；气体模式：静态；鞘气：50arb；辅助气体：10arb；扫气：1arb；离子传输管温度：320℃，蒸发器温度400℃，以亮氨酸脑啡肽为内标校正质量精度。
[0085]
一级扫描：全扫描；orbitrap分辨率：60000；扫描范围(m/z)：100-1000；射频透镜(％)：70；正离子与负离子均扫描。二级扫描：隔离窗口(m/z)：1.5；碰撞能量类型：归一化；hcd碰撞能量(％)：20、50、80；orbitrap分辨率：15000；扫描范围模式：自动。
[0086]
(3)液相条件：thermo scientific sii高效液相系统，色谱柱：中谱rd-c18(5μm，4.6
×
250mm)；流速：0.5ml/min；pda检测器(190-800nm)，检测波长：280、254、220nm；流动相：a相—0.1％甲酸-水，b相—0.1％甲酸-甲醇，进样量：2μl；柱温：30℃。洗脱条件：0-30min，55％-70％ b，30-60min，70％-80％b，60-61min，80-100％ b。
[0087]
(4)化合物ⅰ和ⅱ的质谱鉴定
[0088]
根据静电轨道离子阱高分辨质谱得到的色谱图、一级质谱图、二级质谱图提取离子流图数据进行化合物ⅰ和ⅱ的定性解析。图3为本发明实施例4在正离子模式下，川芎半制备样品溶液的254nm色谱图、总离子流质谱图及提取离子流图及化合物ⅰ、ⅱ的裂解碎片图；其中，图a为川芎半制备样品溶液在254nm波长下的色谱图，图b为正离子模式下川芎半制备样品溶液的总离子流图，图c为正离子模式下分子离子峰为195的提取离子流图，图d为本发明实施例1中筛选所得化合物ⅰ、ⅱ的二级质谱裂解碎片图。如图3的a、b、c所示，化合物ⅰ和
ⅱ
的保留时间均为37.12min，其准分子离子峰为m/z＝195.1380[m+h]+，推测分子式为c
12h18
o2。该离子进一步得到碎片离子177.1273[m+h-h2o]+，149.1322[m+h-h2o-co]+，125.0597[m+h-c5h
10
]+，121.1010[m+h-h2o-co-c2h4]+，107.0855[m+h-h2o-co-c3h6]+，93.0698[m+h-h2o-co-c4h8]+。因此，该化合物i、ⅱ作为共洗脱的苯酞类同分异构体，被鉴定为瑟丹酸内酯、新蛇床内酯。
[0089]
实施例5
[0090]
化合物ⅰ和ⅱ的液相峰及活性峰定位
[0091]
称取一定量的标准品化合物ⅰ和ⅱ，加入dmso溶解成高浓度的母液，超声10min，采用70％甲醇配制为较高浓度溶液，0.22μm有机系微孔滤膜过滤，收集续滤液，取滤液以70％甲醇稀释制成200μmol/l的液相进样溶液。液相条件同实施例3中一样。
[0092]
如图4所示，化合物ⅰ和ⅱ的色谱峰同川芎半制备分段中42min的色谱峰、质谱解析的色谱峰洗脱时间一致，均对应同一个活性倒峰，即质谱解析与色谱峰定位均解析了同一活性峰下的化合物ⅰ、ⅱ分别为瑟丹酸内酯、新蛇床内酯。
[0093]
实施例6
[0094]
化合物ⅰ和ⅱ对单胺氧化酶b的抑制活性
[0095]
使用dmso溶解化合物ⅰ、ⅱ配制高浓度母液，分别以初始浓度为92μmol/l的kyn底物溶液稀释配制终浓度为78.125、39.063、19.531、9.766、1.953、0.391、0.195、0.049、0.024、0.005、0.001、1.953e-04、9.766e-05μmol/l的含底物的抑制剂溶液(控制dmso含量低于1％)，并以底物溶液作为对照，商业化药物雷沙吉兰作为阳性对照。
[0096]
mao-b活性测定在384黑色微孔板中进行。对于评估待测样品的抑制活性，依据上述配制好的溶液进行。分别向384黑色微孔板中加入上述25μl的溶液，并以排枪加入25μl的16μg/ml酶溶液，2000rpm离心两分钟，然后于biotek synergy h2酶标仪中，设置在37℃与激发波长310nm，发射波长370nm的条件下进行动力学检测，每组测试平行测定3次，得到动力学曲线，计算信号增长斜率，计算抑制率。荧光强度变化为反应速率，抑制率计算公式为：
[0097][0098]
利用origin 9.0软件作图分析抑制情况，结果如图5所示，化合物ⅰ及ⅱ对人源单胺氧化酶b的半数抑制浓度ic
50
分别为103nmol/l和405nmol/l。商业化抑制剂雷沙吉兰为131nmol/l。化合物ⅰ对人源mao-b的抑制性优于雷沙吉兰。
[0099]
实施例7
[0100]
化合物ⅰ和ⅱ对单胺氧化酶b可逆抑制的动力学实验
[0101]
根据实施例6中化合物ⅰ和ⅱ的ic
50
配置一系列不同梯度(终浓度为：5/4、1、3/4、1/2及1/4倍ic
50
)含抑制剂的pbs缓冲液，以18μl/孔的形式加到384黑色微孔板中，不含抑制剂的pbs缓冲液作对照，加入16μl/孔终浓度为6、8、10、12、14μg/ml的mao-b酶溶液，离心2min混匀，37℃孵育10min，统一加入16μl/孔终浓度为46μm的底物，离心2min混匀，置于biotek酶标仪中，37℃，激发波长与发射波长分别为315nm、370nm动力学检测1h。以反应速率对酶浓度作图。平行测定3次。
[0102]
分别在不同浓度的mao-b酶溶液下测量了不同浓度化合物ⅰ和ⅱ的催化速率，分别
对化合物拟合纵坐标为反应速率，横坐标为mao-b酶浓度曲线。如图6所示，拟合得到不同浓度的化合物ⅰ(图6-a)和ⅱ(图6-b)下对不同浓度mao-b反应速率作用曲线均相交于原点，该模式表明化合物i和ⅱ均是单胺氧化酶b可逆抑制剂。
[0103]
实施例8
[0104]
化合物ⅰ和ⅱ对sh-sy5y细胞神经保护作用的体外研究
[0105]
本实验的目的是检测发明化合物对神经细胞的体外保护活性，进一步证明本发明化合物的医用用途。本实验采用6-羟基多巴胺(6-ohda)诱导经典帕金森细胞模型，所用细胞株为人神经瘤细胞母细胞(sh-sy5y)，测试发明化合物ⅰ、ⅱ的保护活性。
[0106]
sh-sy5y细胞以dmem培养液(含血清、100u/ml青霉素以及100u/ml链霉素)培养，以1
×
104个/ml的密度、100μl/孔细胞均匀接种于96孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养16小时。当细胞密度达到80％左右时，设置造模组、给药组(化合物ⅰ、化合物ⅱ和阳性药物雷沙吉兰)及基质组，基质组仅加入培养液，给药组分别加入化合物ⅰ、化合物ⅱ及阳性对照，终浓度的浓度梯度分别为100μmol/l、20μmol/l、4μmol/l、0.8μmol/l、0.16μmol/l，每4个孔一组，dmso控制在0.1％以内，孵育4小时，之后造模组和给药组更换含终浓度为200μmol/l的多巴胺神经毒性药物6-ohda的培养液，继续作用24小时。利用酶标仪测定450波长下的od值，采用cck-8法进行保护活性评价。
[0107][0108]
结果见图7，从图7可以明显看出，在0-20μmol/l范围内，化合物ⅰ及ⅱ对sh-sy5y细胞具有显著的剂量依赖的保护活性，其中化合物ⅰ与阳性药物雷沙吉兰的保护作用相当。综合以上实验表明，化合物ⅰ及ⅱ能够通过可逆抑制mao-b在体外和体内发挥很好的神经保护作用，为帕金森病的治疗提供了参考依据。
[0109]
实施例9
[0110]
片剂的制备
[0111]
处方(以1000片的处方量计)：化合物式ⅰ或ⅱ纯品100g，玉米淀粉80g，蔗糖60g，硬脂酸镁2g。制备方法：将活性成分与玉米淀粉、蔗糖混合，加水湿润，搅拌均匀，干燥，粉碎过筛，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片，即得。
[0112]
实施例10
[0113]
滴丸的制备
[0114]
处方(以1000丸的处方量计)：化合物式ⅰ或ⅱ纯品10g，聚乙二醇(分子量4000或6000)50g，液体石蜡适量。制备方法：将聚乙二醇-4000或6000加热至完全熔融，加入化合物式ⅰ或ⅱ纯品，搅拌熔化，于80-85℃保温，由上而下滴至冷却至5-8℃液体石蜡中，待滴丸冷却成型，取出滴丸沥尽并擦除表面附着的液体石蜡，装于瓶中，即得。
[0115]
实施例11
[0116]
舌下含片的制备
[0117]
β-环糊精包合物的制备：化合物式ⅰ或ⅱ纯品10g，β-环糊精80g，将β-环糊精加入30℃水中，制成饱和溶液，将等量无水乙醇稀释的化合物式ⅰ或ⅱ纯品由上而下缓缓滴入β-环糊精饱和溶液中，30℃搅拌2h包合，成型取出,冷却，冷藏24h，洗涤沉淀，40℃干燥1h，既得。
[0118]
处方(以1000片的处方量计)：上述含化合物式ⅰ或ⅱ的β-环糊精包合物60g，乳糖165g，维生素c 6g，羧甲基淀粉钠15g，聚维酮20g、硬脂酸4g，按照常规工艺制成舌下含片1000片，既得。
[0119]
实施例12
[0120]
注射液的制备
[0121]
处方(以1000支的处方量计)：化合物式ⅰ或ⅱ纯品100g，丙二醇100g，注射用水1000ml。制备方法：将化合物式ⅰ或ⅱ纯品溶解于丙二醇中，加注射用水至1000ml，混合均匀，过滤，将所获得的溶液在无菌条件下分装于安瓿瓶中，制成1ml/瓶注射液，充氮密封即得。
[0122]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种单胺氧化酶b抑制剂，其特征在于，含有式ⅰ和/或式ⅱ的单苯酞类化合物，2.根据权利要求1所述的单胺氧化酶b抑制剂，其特征在于，所述式ⅰ和式ⅱ为苯酞类同分异构体。3.根据权利要求1所述的单胺氧化酶b抑制剂，其特征在于，所述单胺氧化酶b抑制剂为人源单胺氧化酶b抑制剂。4.根据权利要求1所述的单胺氧化酶b抑制剂，其特征在于，所述式ⅰ和/或式ⅱ的单苯酞类化合物通过基于mao-b抑制性的微流分活性筛选技术，从川芎中发现和筛选出。5.根据权利要求3所述的单胺氧化酶b抑制剂，其特征在于，所述式ⅰ和/或式ⅱ的单苯酞类化合物具体的筛选步骤如下，将20μl川芎半制备分段样品经微流分活性筛选平台采用接板液相条件分离分析，收集于384黑色微孔板中，采用384微孔板活性检测条件经过酶标仪活性检测得到川芎半制备样品的单胺氧化酶b抑制活性谱图，进而采用质谱液相条件和质谱条件对川芎半制备样品进行液质联用分析，依据活性谱图及液质联用数据进而从川芎中筛选出式ⅰ和/或式ⅱ。6.一种根据权利要求1至5任一项所述的单胺氧化酶b抑制剂在抗神经退行性疾病药物中的应用。7.根据权利要求6所述的单胺氧化酶b抑制剂在抗神经退行性疾病药物中的应用，其特征在于，所述抗神经退行性疾病药物为片剂、滴丸、舌下含片、注射液、颗粒剂、胶囊剂、口服液、微囊微球制剂、喷雾剂、靶向制剂、粉针剂或气雾剂中的至少一种。8.根据权利要求6所述的单胺氧化酶b抑制剂在抗神经退行性疾病药物中的应用，其特征在于，所述抗神经退行性疾病为中枢神经系统病症、精神病学病症、神经退行性病症和疼痛病症，如神经退行性疾病、心血管疾病、脑卒中及中风。9.根据权利要求6所述的单胺氧化酶b抑制剂在抗神经退行性疾病药物中的应用，其特征在于，所述单胺氧化酶b抑制剂通过抑制单胺氧化酶b的活性提升体内多巴胺的含量，实现对神经退行性疾病的治疗作用。10.根据权利要求6所述的单胺氧化酶b抑制剂在抗神经退行性疾病药物中的应用，其特征在于，所述抗神经退行性疾病药物为预防和/或治疗帕金森病及其并发症的药物组合物。

技术总结
本发明公开了一种单胺氧化酶B抑制剂及其在抗神经退行性疾病药物中的应用。所述单胺氧化酶B抑制剂包含瑟丹酸内酯和新蛇床内酯。本发明所述瑟丹酸内酯和新蛇床内酯可逆抑制人源单胺氧化酶B的活性，IC


技术研发人员：江正瑾 张婷婷 范宇 汪锦才 田浩 王启钦 徐俊
受保护的技术使用者：暨南大学
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/9/20