一种检测高危型人乳头瘤病毒的引物、引物探针组合物及试剂盒的制作方法

1.本发明涉及核酸检测技术领域，具体地，涉及一种检测高危型人乳头瘤病毒的引物、引物探针组合物及试剂盒。


背景技术：

2.宫颈癌是仅次于乳腺癌的人类第二大妇科恶性肿瘤，全球每年有超过51万名妇女被确诊，并且其发病呈年轻化趋势。宫颈癌主要由高危型人乳头瘤病毒持续感染所致，在99.7％的子宫颈癌中都可检测到高危型人乳头瘤病毒。
3.人乳头瘤状病毒(human papillomavirus,hpv)是一种约含有8000个碱基对的双链dna病毒。目前已经鉴定的hpv型别超过200种。大量的科学研究发现，依据不同hpv型别的致癌潜力，将hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68列为高危型别，hpv26、53、66、73、82列为潜在高危型；hpv6、11、40、42、43、44、54、61等为低危型别。低危型与性传播疣或尖锐湿疣有关，一般不诱发癌变。据报道，约有70％的宫颈癌是由hpv16、18型病毒感染导致的，其致癌风险远高于其它高危型hpv，因此指南及全球专家共识均明确若检出hpv16/18型阳性，则直接进行阴道镜转诊，若检出其他高危型hpv阳性，则通过细胞学分流再进行风险分层管理。
4.hpv的检测方法可分为测序法、反向点杂交法、流式荧光杂交法、基因芯片杂交法、pcr法(电泳鉴定结果)以及荧光定量pcr检测方法等。测序法的结果准确，但因其灵敏度低且操作较复杂，限制了其在临床上的大规模应用；反向点杂交法的市场认可度高，但存在操作繁琐、耗时久、假阳性率高、交叉污染等的缺点；流式荧光杂交法具有良好的特异性，但耗时久、费用昂贵、且对操作者的要求高；基因芯片杂交法的特异性高且结果直观可靠，但芯片的制作和使用成本均较高，所以尚难普及使用。传统的pcr法(电泳鉴定结果)扩增后的产物暴露容易造成交叉污染，步骤繁琐、假阳性率偏高。而上世纪90年代中期，在传统的pcr基础上发展起来的实时荧光pcr技术，不但灵敏度高、特异性强，且自动化程度高，几乎不会造成污染，可以进行hpv分型，这些优点给人乳头瘤病毒的早期诊断带来了福音。
5.对高危型hpv进行检测，可以及早发现hpv感染并及时治疗，进而极大的降低宫颈癌的发生率；可以预测受检者的发病风险度，决定其筛查间隔；用于手术后的追踪指导hpv疫苗的研究及使用。因此，建立针对高危型hpv的检测方法，同时区分hpv16、18型，对宫颈癌的预防、诊断和治疗具有重要意义。目前，hpv部分分型的试剂盒仍存在检测型别少、灵敏度低、对操作人员、仪器和环境要求高等的缺点。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中检测灵敏度低、特异性差、检测型别少、不能分型、耗时长、成本高、费用高和操作复杂的问题，本发明提供了一种检测高危型人乳头瘤病毒的引物、引物探针组合物及试剂盒。
7.本发明的第一个目的是提供一组检测高危型人乳头瘤病毒的引物。
8.本发明的第二个目的是提供一种检测高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合物。
9.本发明的第三个目的是提供所述引物或任一所述的引物探针组合物在制备检测人乳头瘤病毒的试剂盒中的应用。
10.本发明的第四个目的是提供一种检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒。
11.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
12.本发明采用实时荧光定量pcr法，对18种高危型人乳头瘤病毒的l1基因设计特异性引物和探针，配以热启动dna聚合酶等成分组成核酸扩增试剂，使用荧光pcr仪进行对待测样本的dna进行扩增检测，hpv16、hpv18与其余16个型别使用不同的荧光通道，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(ct值)实现对未知样本的定性检测。本方法可实现hpv16和hpv18的分型检测。
13.一组检测高危型人乳头瘤病毒的引物，所述高危型人乳头瘤病毒为hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82，所述引物的核苷酸序列如seq id no：19～54所示。
14.所述核苷酸序列如seq id no：19～20所示的引物，检测hpv16；
15.所述核苷酸序列如seq id no：21～22所示的引物，检测hpv18；
16.所述核苷酸序列如seq id no：23～24所示的引物，检测hpv26；
17.所述核苷酸序列如seq id no：25～26所示的引物，检测hpv31；
18.所述核苷酸序列如seq id no：27～28所示的引物，检测hpv33；
19.所述核苷酸序列如seq id no：29～30所示的引物，检测hpv35；
20.所述核苷酸序列如seq id no：31～32所示的引物，检测hpv39；
21.所述核苷酸序列如seq id no：33～34所示的引物，检测hpv45；
22.所述核苷酸序列如seq id no：35～36所示的引物，检测hpv51；
23.所述核苷酸序列如seq id no：37～38所示的引物，检测hpv52；
24.所述核苷酸序列如seq id no：39～40所示的引物，检测hpv53；
25.所述核苷酸序列如seq id no：41～42所示的引物，检测hpv56；
26.所述核苷酸序列如seq id no：43～44所示的引物，检测hpv58；
27.所述核苷酸序列如seq id no：45～46所示的引物，检测hpv59；
28.所述核苷酸序列如seq id no：47～48所示的引物，检测hpv66；
29.所述核苷酸序列如seq id no：49～50所示的引物，检测hpv68；
30.所述核苷酸序列如seq id no：51～52所示的引物，检测hpv73；
31.所述核苷酸序列如seq id no：53～54所示的引物，检测hpv82。
32.一种检测高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合物，包含核苷酸序列如seq id no：1～18所示的探针和上述的引物。
33.所述核苷酸序列如seq id no：1所示的探针，检测hpv16；
34.所述核苷酸序列如seq id no：2所示的探针，检测hpv18；
35.所述核苷酸序列如seq id no：3所示的探针，检测hpv26；
36.所述核苷酸序列如seq id no：4所示的探针，检测hpv31；
37.所述核苷酸序列如seq id no：5所示的探针，检测hpv33；
no：49～50所示的引物工作浓度各为0.22μm；
82.核苷酸序列如seq id no：17所示的探针工作浓度为0.12μm，核苷酸序列如seq id no：51～52所示的引物工作浓度各为0.26μm；
83.核苷酸序列如seq id no：18所示的探针工作浓度为0.14μm，核苷酸序列如seq id no：53～54所示的引物工作浓度各为0.26μm。
84.优选地，所述引物探针组合物还包含引物探针组4，所述引物探针组4包含检测内参基因的引物和探针。本发明对检测上述18种型别hpv所用的内参基因不做特殊限定，如gapdh、β-actin、β-globin等常规的内参基因，均可作为检测上述18种型别hpv所用的内参基因。
85.更优选地，所述内参基因为gapdh基因。
86.进一步优选地，引物探针组4包含检测gapdh基因的核苷酸序列如seq id no：55所示的探针和核苷酸序列如seq id no：56～57所示的引物。
87.更进一步优选地，引物探针组4中，所述核苷酸序列如seq id no：56～57所示的引物的工作浓度为0.20μm～0.22μm。
88.最优选地，引物探针组4中，所述核苷酸序列如seq id no：56～57所示的引物的工作浓度各为0.21μm。
89.更进一步优选地，引物探针组4中，所述核苷酸序列如seq id no：55所示的探针的5’端设有荧光报告基团cy5，3’端标记有荧光淬灭基团eclipse和3*zip。
90.再进一步优选地，引物探针组4中，所述核苷酸序列如seq id no：55所示的探针的工作浓度为0.18μm～0.22μm。
91.最优选地，引物探针组4中，所述核苷酸序列如seq id no：55所示的探针的工作浓度为0.20μm。
92.优选地，所述试剂盒还包含阳性质控品，所述阳性质控品为假病毒，所述假病毒的基因组包含核苷酸序列如seq id no：58、seq id no：59和seq id no：67所示的序列。
93.更优选地，所述假病毒的基因组还包含核苷酸序列如seq id no：76所示的序列。
94.优选地，所述试剂盒还包含阴性质控品，所述阴性质控品为生理盐水。
95.优选地，所述试剂盒还包含荧光定量pcr试剂。
96.更优选地，所述荧光定量pcr反应试剂包含pcr buffer和pcr反应酶。
97.进一步优选地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
98.s1.获得待测样本的基因组dna；
99.s2.以待测样本的dna作为模板，使用上述引物探针组合物和荧光定量pcr试剂制备反应体系，进行荧光定量pcr扩增，判定待测样本中是否含有高危型人乳头瘤病毒；
100.所述判定的方法如下：
101.texas red通道、vic通道、fam通道和cy5通道均为ct值＞38或无ct值，则结果无效，需重新检测；
102.texas red通道、vic通道和fam通道均为ct值＞38或无ct值，cy5通道ct值≤38，则判定待测样本为hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82阴性；
103.texas red通道、vic通道和fam通道中至少一个通道的ct值≤38，cy5通道有或无
ct值均不影响结果的判读；texas red通道ct值≤38，则判定待测样本为hpv16阳性；vic通道ct值≤38，则判定待测样本为hpv18阳性；fam通道ct值≤38，则判定待测样本为其余16种hpv阳性。
104.所述其余16种hpv阳性即为hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82中至少有一种型别的hpv阳性。
105.更优选地，所述判定的方法如下：
106.texas red通道、vic通道、fam通道和cy5通道均为ct值＞38或无ct值，则结果无效，需重新检测；
107.texas red通道、vic通道和fam通道均为ct值＞38或无ct值，cy5通道ct值≤38，则判定待测样本为hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82阴性；
108.texas red通道ct值≤38，vic通道ct值＞38或无ct值，fam通道ct值＞38或无ct值，则判定待测样本为hpv16阳性，hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82阴性；
109.texas red通道ct值＞38或无ct值，vic通道ct值≤38，fam通道ct值＞38或无ct值，则判定待测样本为hpv18阳性，hpv16、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82阴性；
110.texas red通道ct值＞38或无ct值，vic通道ct值＞38或无ct值，fam通道ct值≤38，则判定待测样本为hpv16和hpv18阴性，其余16种hpv阳性；
111.texas red通道ct值≤38，vic通道ct值≤38，fam通道ct值＞38或无ct值，则判定待测样本为hpv16阳性，hpv18阳性，hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82阴性；
112.texas red通道ct值≤38，vic通道ct值＞38或无ct值，fam通道ct值≤38，则判定待测样本为hpv16阳性，hpv18阴性，其余16种hpv阳性；
113.texas red通道ct值＞38或无ct值，vic通道ct值≤38，fam通道ct值≤38，则判定待测样本为hpv16阴性，hpv18阳性，其余16种hpv阳性；
114.texas red通道ct值≤38，vic通道ct值≤38，fam通道ct值≤38，则判定待测样本为hpv16阳性，hpv18阳性，其余16种hpv阳性。
115.本发明对待测样本基因组dna的提取方法没有特殊限定，一般可用常规方法，或用核酸提取试剂盒提取待测样本的基因组dna。
116.更优选地，步骤s1中，提取所得到的待测样本的基因组dna，并使用相同的提取方法处理阴性质控品和阳性质控品。
117.更优选地，步骤s2中，所述反应体系中，模板、引物探针组合物、pcr buffer和pcr酶的体积比为(28～32)：(6～9)：(6～9)：(4～6)，所述模板为待测样本的基因组dna、处理后的阴性质控品或处理后的阳性质控品。
118.进一步优选地，步骤s2中，所述反应体系中，模板、引物探针组合物、pcr buffer和pcr酶的体积比为30：7.5：7.5：5。
119.更优选地，步骤s2中，所述荧光定量pcr扩增的程序为：48～52℃，2分钟；93～97
℃，15分钟；92～96℃，15秒，48～52℃，45秒，43～47个循环。
120.进一步优选地，步骤s2中，所述荧光定量pcr扩增的程序为：50℃，2分钟；95℃，15分钟；94℃，15秒，50℃，45秒，45个循环，收集荧光。
121.更优选地，步骤s2中，所述荧光定量pcr扩增的荧光通道选择texas red通道、vic通道、fam通道和cy5通道收集荧光。
122.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
123.本发明提供了检测hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82的引物、引物探针组合物与试剂盒，同时设计内控基因检测系统，实现了单管一次检测18种高危型人乳头瘤病毒，并可对hpv16和hpv18进行分型检测。本发明克服了传统hpv检测试剂盒检测灵敏度低、特异性差、检测型别少、不能分型、耗时长、费用高和操作复杂的缺点，可以高灵敏度、高特异性、高通量、低成本、简便且快速地检测样本中是否存在18种高危型人乳头瘤病毒，同时可区分hpv16和hpv18两种型别，为hpv的预防和治疗提供新的技术选择。
附图说明
124.图1为本发明检测阴性质控品的pcr结果。
125.图2为本发明检测阳性质控品的pcr结果。
具体实施方式
126.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
127.实施例1 18种型别人乳头瘤病毒的核酸检测探针及引物
128.一、探针及引物的设计合成
129.根据hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82的l1基因序列(ncbi号依次为：km058666.1、mh057749.1、kf444058.1、ku163584.1、gq479019.1、gq479039.1、mk344673.1、mw052843.1、mw888944.1、ky077863.1、ku951266.1、lr862083.1、on355256.1、mt934364.1、mk648148.1、lr861959.1、lr862011.1、ab027021.1)设计并合成，设计得到18种型别人乳头瘤病毒的核酸检测探针及引物，具体序列如表1和表2所示。
130.表1 18种型别人乳头瘤病毒的核酸检测探针的序列
131.[0132][0133]
上述核苷酸序列如seq id no：1～18所示的探针均为taqman探针，其中hpv16型的探针(seq id no：1)的5’端标记有荧光报告基团texas red，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2；所述hpv18型的探针(seq id no：2)的5’端标记有荧光报告基团vic，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82的探针(seq id no：3～seq id no：18)的5’端标记有荧光报告基团fam，3’端均设有荧光淬灭基团bhq1。
[0134]
表2 18种型别人乳头瘤病毒的核酸检测引物的序列
[0135]
[0136][0137]
上述pcr引物和标有不同类型荧光的探针可分别用于对18种高危型人乳头瘤病毒进行检测，根据pcr反应管呈现的荧光信号结果，可以判断待测样本中高危型人乳头瘤病毒的型别数和hpv16和hpv18型别的感染情况，以达到检测18种高危型人乳头瘤病毒并同时鉴别出hpv16和hpv18的型别。
[0138]
本发明对检测上述18种型别hpv所用的内参基因不做特殊限定，如gapdh、β-actin、β-globin等常规的内参基因，均可作为检测上述18种型别hpv所用的内参基因。
[0139]
本实施例以gapdh为例，提供检测内参基因的taqman探针及引物，具体序列如下：
[0140]
检测gapdh的探针(5’～3’)：cctcccacaccagctttg(seq id no：55)，5’端标记有荧光报告基团cy5，3’端标记有荧光淬灭基团eclipse和3*zip。
[0141]
检测gapdh的引物(5’～3’)：上游：gatattgttgccatcaatgac(seq id no：56)；下游：gggaatacgtgagggtatga(seq id no：57)。
[0142]
二、探针及引物的工作浓度确定
[0143]
分别以含hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82 dna片段的18种质粒(seq id no：58～75)为模板，质粒的浓度各为50000copies/ml、5000copies/ml、500copies/ml，使用上述引物及探针进行实时荧光定量pcr扩增。
[0144]
实时荧光定量pcr反应程序如表3所示。
[0145]
表3实时荧光定量pcr反应程序
[0146][0147]
实时荧光定量pcr反应体系如表4所示。
[0148]
表4实时荧光定量pcr反应体系
[0149]
[0150][0151]
调整表4中hpv16、hpv18和hpv52的检测引物及探针的用量，扩增结果如表5所示。
[0152]
表5 hpv16、hpv18和hpv52的检测引物及探针浓度优化测试结果
[0153]
[0154][0155]
结果表明调整hpv16、hpv18和hpv52的引物及探针用量，不仅对hpv16、hpv18和hpv52这3个型别hpv的检测效果有影响，对其它型别hpv的检测也会产生影响，所以在同一体系中平衡调节各型别引物及探针的用量具有重要意义。最终确定hpv16型探针的浓度为0.12μm，引物的浓度为0.23μm；或调节18型探针的浓度为0.08μm，引物的浓度为0.2μm；或调节52型探针的浓度为0.4μm，引物的浓度为0.6μm，进行扩增。
[0156]
实施例2一种快速检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒
[0157]
一、组成
[0158]
试剂盒(48反应/盒)包括反应液a(450μl/管)、反应液b(175μl/管)、阴性质控品(900μl/管)和阳性质控品(900μl/管)，反应液a的主要成分如表6所示，反应液b的主要成分如表7所示，阴性质控品和阳性质控品的主要成分如表8所示。
[0159]
表6反应液a的主要成分
[0160]
[0161][0162]
在进行实时荧光定量pcr反应时，根据探针上标记的荧光报告基团，设置相应的荧光检测通道：检测hpv16设置texas red通道，检测hpv18设置vic通道；检测hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82设置fam通道；检测gapdh基因设置cy5通道。
[0163]
表7反应液b的主要成分
[0164][0165]
表8阴性质控品和阳性质控品的主要成分
[0166][0167]
上表中所述假病毒，分别以含hpv16 dna片段的质粒(seq id no：58)、含hpv18 dna片段的质粒(seq id no：59)、含hpv52 dna片段的质粒(seq id no：67)和含gapdh基因片段的质粒(seq id no：76)，通过本领域的常规技术手段制备得到。
[0168]
二、使用方法
[0169]
1、待测样本基因组dna的提取
[0170]
本试剂盒以宫颈脱落细胞样本作为待测样本。
[0171]
待测样本基因组dna的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)，或用合格的核酸提取试剂盒提取待测样本基因组dna。
[0172]
采用相同的方法对本试剂盒的阴性质控品和阳性质控品进行相同的提取处理。
[0173]
提取所得到的待测样本基因组dna以及提取处理后的阴性质控品和阳性质控品，可立即用于本试剂盒检测，或可置于-20℃保存备用。
[0174]
2、实时荧光定量pcr反应体系的制备
[0175]
(1)配制前准备
[0176]
取出本试剂盒中的反应液a和反应液b，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒。
[0177]
(2)实时荧光定量pcr反应体系配制
[0178]
按照如表9所示的信息，在pcr反应管中配制实时荧光定量pcr反应体系(总体积为50μl)，充分混匀，高速离心10秒。
[0179]
表9实时荧光定量pcr反应体系
[0180][0181]
3、实时荧光定量pcr扩增
[0182]
(1)上机
[0183]
将pcr反应管放入实时荧光定量pcr仪的样品槽内，并记录放置顺序。
[0184]
(2)荧光通道选择
[0185]
选择texas red通道检测hpv16型。
[0186]
选择vic通道检测hpv18型。
[0187]
选择fam通道检测另外16种型别，分别为hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82。
[0188]
选择cy5通道检测内参基因gapdh基因。
[0189]
实时荧光定量pcr仪如需设置参比荧光(passive reference)，如荧光定量pcr仪abi750，则选择参比荧光为none。
[0190]
(3)反应程序设置
[0191]
按照如实施例2中表3所示的信息，设置实时荧光定量pcr反应程序。
[0192]
设置完成pcr反应程序后，保存文件，运行程序。
[0193]
4、结果读取及分析
[0194]
反应结束后，获得texas red通道、vic通道、fam通道和cy5通道的ct值。
[0195]
根据各通道ct值进行分析判断，方法如下：
[0196]
(1)texas red通道、vic通道、fam通道和cy5通道均为ct值＞38或无ct值，则结果无效，需重新检测；
[0197]
(2)texas red通道、vic通道和fam通道均为ct值＞38或无ct值，cy5通道ct值≤38，则判定待测样本为18种hpv型别(hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82)均为阴性；
[0198]
(3)texas red通道、vic通道和fam通道中至少一个通道的ct值≤38，cy5通道有或无ct值均不影响结果的判读；texas red通道ct值≤38，则判定待测样本是hpv16阳性；vic通道ct值≤38，则判定待测样本是hpv18阳性；fam通道ct值≤38，则判定待测样本是其余16种hpv阳性，即hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82中至少有一种型别为阳性。
[0199]
根据上述分析判断的方法，结合如表10所示的标准进行结果判定。
[0200]
表10结果判定的标准
[0201]
[0202]
实施例3试剂盒的准确性
[0203]
1、实验方法
[0204]
(1)使用本发明实施例2的试剂盒检测阳性参考品p1～p18和阴性参考品n1～n14，各20个重复。所述阳性参考品为分别含有hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82的dna片段的18种质粒(seq id no：58～75)，质粒的浓度各为50000copies/ml。所述阴性参考品n1～n7为临床样本，分别为临床阴性样本、hpv6、hpv11、hpv42、hpv43、hpv81、hpv83；n8～n14为灭活培养物，分别为单纯疱疹病毒ⅱ型、解脲支原体、人型支原体、淋病奈瑟菌(淋球菌)、白色念珠菌、沙眼衣原体、巨细胞病毒。
[0205]
按照实施例2中所述的方法，于八联管中配制实时荧光定量pcr反应体系，其中模板为上述阳性参考品p1～p18和阴性参考品n1～n14各30μl，每管pcr反应液总体积为50μl。
[0206]
(2)按照实施例2中所述的方法，进行实时荧光定量pcr扩增和结果读取及判定。
[0207]
2、实验结果
[0208]
本发明实施例2的试剂盒的准确性检测结果如表11所示。
[0209]
表11试剂盒的准确性检测结果
[0210][0211]
根据上表所述结果，本发明试剂盒的检测结果阳性率为100％，表明本发明实施例2的试剂盒具有准确性，符合检测要求，可用于hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82的鉴定，并对hpv16型和hpv18型确定分型。
[0212]
实施例4试剂盒的灵敏度
[0213]
1、实验方法
[0214]
(1)使用本发明实施例2的试剂盒检测分别含有hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82的dna片段的18种质粒(seq id no：58～75)，质粒的浓度各为500copies/ml。
[0215]
按照实施例2中所述的方法，于八联管中配制实时荧光定量pcr反应体系，其中模板为30μl上述18种含高危型人乳头瘤病毒dna片段的质粒(浓度为500copies/ml)，或30μl经提取处理的试剂盒的阴性质控品；或30μl经提取处理的试剂盒的阳性质控品。每管中pcr反应体系总体积为50μl。
[0216]
(2)按照实施例2中所述的方法，进行实时荧光定量pcr扩增和结果读取及分析。
[0217]
2、实验结果
[0218]
本发明实施例2的试剂盒检测阴性质控品的pcr结果如图1所示，4个荧光通道均无扩增曲线；检测阳性质控品的pcr检测结果如图2所示，4个荧光通道均有平滑的扩增曲线。
[0219]
本发明实施例2的试剂盒的灵敏度检测结果如表12所示。
[0220]
表12试剂盒的灵敏度检测结果
[0221][0222][0223]
根据上表所述结果，本发明实施例2的试剂盒可以检测出浓度约为500copies/ml的18种高危型人乳头瘤病毒dna(hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、
hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82)，具有高灵敏度，可以满足临床的检测需求。
[0224]
实施例5试剂盒的应用
[0225]
1、实验方法
[0226]
(1)使用本发明实施例2的试剂盒检测200份经测序确认的临床样本(人宫颈脱落细胞样本)，其中181份临床样本含高危型人乳头瘤病毒dna，9份临床样本含低危型人乳头瘤病毒dna(hpv6和hpv11)，另外10份临床样本不含人乳头瘤病毒dna。
[0227]
按照实施例2中所述的方法，提取200份临床样本的基因组dna，于八联管中配制实时荧光定量pcr反应体系，其中模板为200份临床样本的基因组dna 30μl或经提取处理的试剂盒的阴性质控品30μl或经提取处理的试剂盒的阳性质控品30μl，每管pcr反应液总体积为50μl。
[0228]
(2)按照实施例2中所述的方法，进行实时荧光定量pcr扩增和结果读取及分析。
[0229]
2、实验结果
[0230]
本发明实施例2的试剂盒检测200份经测序确认的临床样本，检测的结果如表13所示。
[0231]
表13 试剂盒检测200份经测序确认的临床样本的结果
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237][0238]
根据上表所述结果，200例样本中，测序诊断为hpv16型阳性的样本共71例，其余129例样本为hpv16型阴性；使用本发明实施例2的试剂盒检测，有71例样本为16型阳性，129例呈hpv16型阴性。所以本发明实施例2的试剂盒检测hpv16型的阳性符合率为100％，阴性符合率为100％。
[0239]
测序诊断为hpv18型阳性的样本共25例，其余175例样本为hpv18型阴性；使用本发明实施例2的试剂盒检测，有25例样本为hpv18型阳性，175例呈hpv18型阴性。所以本发明实施例2的试剂盒检测hpv18型的阳性符合率为100％，阴性符合率为100％。
[0240]
测序诊断为其余16型hpv阳性的样本共156例，其余44例样本为阴性；使用本发明实施例2的试剂盒检测，有153例样本为其余16型hpv阳性，47例呈其余16型阴性。所以本发明实施例2的试剂盒检测其余16型hpv的阳性符合率为98.08％，阴性符合率为100％
[0241]
测序诊断为低危型人乳头瘤病毒dna阳性的9例临床样本和不含人乳头瘤病毒dna的10例临床样本，使用本发明实施例2的试剂盒进行检测，结果均为阴性，符合率为100％。
[0242]
以上结果表明，本发明实施例2的试剂盒具有高特异性，能够特异性检测出hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82共18种高危型人乳头瘤病毒，可以满足临床检测的需要。
[0243]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一组检测高危型人乳头瘤病毒的引物，其特征在于，所述高危型人乳头瘤病毒为hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82，所述引物的核苷酸序列如seq id no：19～54所示。2.一种检测高危型人乳头瘤病毒的引物探针组合物，其特征在于，包含核苷酸序列如seq id no：1～18所示的探针和权利要求1所述引物。3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包含引物探针组1～3；所述各组间的探针的5’端设有不同的荧光报告基团，3’端设有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团为texas red、vic或fam中的任意一种；所述荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或dq1中的任意一种；所述引物探针组1包含核苷酸序列如seq id no：1所示的探针及核苷酸序列如seq id no：19～20所示的引物；所述引物探针组2包含核苷酸序列如seq id no：2所示的探针及核苷酸序列如seq id no：21～22所示的引物；所述引物探针组3包含核苷酸序列如seq id no：3～18所示的探针及核苷酸序列如seq id no：23～54所示的引物。4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组1的5’端设有荧光报告基团texasred，3’端设有荧光淬灭基团bhq2；所述引物探针组2的5’端设有荧光报告基团vic，3’端设有荧光淬灭基团bhq1；所述引物探针组3的5’端设有荧光报告基团fam，3’端均设有荧光淬灭基团bhq1。5.权利要求1所述引物或权利要求2～4任一所述的引物探针组合物在制备检测人乳头瘤病毒的试剂盒中的应用。6.一种检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2～4任一所述引物探针组合物。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述引物探针组合物。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组1～3的探针工作浓度为0.06μm～0.32μm；所述引物探针组1～3的引物工作浓度为0.20μm～0.62μm。

技术总结
本发明公开了一种检测高危型人乳头瘤病毒的引物、引物探针组合物及试剂盒。所述高危型人乳头瘤病毒为HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：19～54所示；所述引物探针组合物包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1～18所示的探针和上述引物。本申请还涉及一种检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒。本申请提供的技术方案克服了传统HPV检测试剂盒检测灵敏度低、特异性差、检测型别少、不能分型、耗时长、费用高和操作复杂的缺点，可以高灵敏度、高特异性、高通量、低成本且简便快速地检测样本中是否存在18种高危型人乳头瘤病毒，同时可区分HPV16和HPV18两种型别，为HPV的预防和治疗提供新的技术选择。为HPV的预防和治疗提供新的技术选择。为HPV的预防和治疗提供新的技术选择。


技术研发人员：蒋析文 王世东 陈书容 黄志文 杨晓雯
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/9/20