一种原位口腔癌动物模型的构建方法和应用

1.本发明属于生物领域，具体涉及一种原位口腔癌动物模型的构建方法和应用。


背景技术：

2.口腔癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，其中鳞状细胞癌(oscc)占口腔癌发病率90％以上，且在发展中国家的病例构成比例大。口腔癌病因复杂，临床发病率较高，易发生淋巴结转移或全身转移，导致疾病预后差，患者生存率低。口腔癌的治疗方式主要包括手术治疗、放射治疗、化疗药物治疗的综合序列治疗，多数情况下手术治疗为首选治疗方式，而放疗及化疗则作为术后辅助治疗方式。
3.在研究口腔癌发生发展机理以及探索口腔癌新型术后辅助治疗方式的过程中，细胞模型和实验动物模型是必不可少的研究工具。作为重要的实验方法和手段，建立动物模型可以避免直接人体试验带来的风险、再现人类疾病的生物学特性，同时具有较好的重复性、且易于控制试验条件和施加干预措施。理想的动物模型要求在发生部位、组织学类型、生物学行为、干预方式等方面尽量与所对应的人类肿瘤相似。目前，绝大多数肿瘤研究都采用皮下肿瘤动物模型，且研究对象通常为完整的实体肿瘤，与临床治疗实际相去较远。
4.大量临床前研究表明，原位肿瘤动物模型更为接近肿瘤生长的真实情况，例如已广泛应用的原位肺癌动物模型、原位肝癌动物模型以及原位脑胶质瘤动物模型，均具有良好的应用前景。然而，稳定的原位口腔癌动物模型尚未建立，用于口腔癌术后辅助治疗研究的相关方法和流程亦无统一标准。为进一步接近临床实际，推进口腔癌术后辅助治疗的深入研究，亟需对现有口腔癌动物模型进行优化和改进，建立稳定的原位口腔癌动物模型。在此基础上，进一步确立原位肿瘤动物模型手术切除的相关标准和规范化操作流程，建立一种贴近口腔癌生物学特性、可重复性高并且符合临床治疗实际的原位口腔癌术后辅助治疗标准化动物模型，以解决上述问题。
5.现有技术中，用于口腔癌研究的动物模型主要包括肿瘤细胞系移植皮下瘤模型和人源异种移植皮下瘤模型(pdx)，即通过将肿瘤细胞系或人体肿瘤组织接种于模型动物皮下，制备过程简单，可重复性高。然而上述两种动物模型均为非原位肿瘤，存在明显缺陷：(1)无法模拟口腔组织的原位微环境，进而可能导致人源型肿瘤在实验过程中相关生物学特征丢失；(2)由于组织来源和标本取材的差异导致pdx模型的成功率很大程度上取决于标本质量，模型建立成功率低且成本高昂。
6.另外，现有的原位口腔癌动物模型使用较多的是诱发性口腔癌模型，该模型虽然肿瘤生长位置与人体相似，但进行局部治疗性实验比较困难、动物意外死亡率高，不适合在肿瘤进展和治疗领域进行研究。同时，绝大多数研究仅局限于对完整实体肿瘤的治疗，而非肿瘤切除术后的辅助治疗研究，不符合口腔癌相关治疗的临床实际。此外，目前针对口腔癌术后治疗的研究尚无标准化动物模型，文献报道的相关研究均基于皮下肿瘤动物模型，且肿瘤切除方式和范围无明确标准，手术条件和相关器械的使用不规范，相关药品用量难以精确控制，与临床实际出入较大，无法满足研究需求。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种原位口腔癌动物模型的构建方法，由此构建的动物模型不仅在最大程度上接近口腔癌的生物学特性，符合口腔癌的临床治疗实际，而且操作方法简单可靠、可重复性及标准化程度高，采用专用器械进行肿瘤的标准化切除，适用于各类口腔癌术后辅助治疗的研究。
8.本发明的另一目的是提供通过上述构建方法得到的原位口腔癌动物模型在口腔癌术后辅助治疗实验研究中的应用。
9.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.本发明提供一种原位口腔癌动物模型的构建方法，包括以下步骤：
11.步骤1：选择4-6周龄的balb/c裸鼠，常规饲养；
12.步骤2：选择人源性/鼠源性口腔癌细胞系或取材于人体口腔癌组织分离出的肿瘤细胞，细胞培养传至第3-4代；
13.步骤3：使用胰酶对上述第3-4代的口腔癌细胞进行消化并收集，制备细胞密度为5
×
107～1
×
108/ml的pbs细胞悬液，置于冰盒内备用；
14.步骤4：腹腔注射氯胺酮麻醉剂对步骤1中小鼠进行麻醉，注射剂量为10-13mg/kg体重，仰卧位固定；
15.步骤5：使用1ml注射器吸取适量肿瘤细胞悬液，进针点位于小鼠颏部下方中线与舌骨上方2-4mm的交叉点，进针深度为3-6mm，到达舌根部肌肉组织内；
16.步骤6：确认回抽无血，注射肿瘤细胞悬液40-80μl，稳定后缓慢拔出针头；
17.步骤7：小鼠侧卧位放置，确认生命体征、呼吸及吞咽功能无异常；
18.步骤8：观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至40-60mm3时进行手术切除。
19.作为优选，步骤8中，所述观察肿瘤生长情况采用如下两种方法之一：
20.a：采用荧光素酶(luciferase)标记的肿瘤细胞进行动物模型构建，并使用活体成像仪记录肿瘤大小；
21.b：采用磁共振(mr)成像的方式记录肿瘤生长情况。
22.作为优选，步骤8中，所述手术切除采用基于原位肿瘤的标准化切除方式，包括如下步骤：
23.步骤a：腹腔注射氯胺酮麻醉剂对小鼠进行麻醉，注射剂量为10-13mg/kg体重，仰卧位固定于小鼠专用立体定位仪中，充分暴露小鼠颏部下方肿瘤区域；
24.步骤b：沿肿瘤下方边缘1-3mm处画弧形切口线，做一长度0.5-1.0cm切口，切开皮肤及皮下组织；
25.步骤c：分离切口上方皮肤组织瓣，充分暴露肿瘤区域，仔细分离肿瘤表面肌肉组织二腹肌、颏舌骨肌和部分下颌舌骨肌，暴露肿瘤；
26.步骤d：用活检穿孔器垂直插入肿瘤中心部位，深度为2-4mm，固位后缓慢旋转10-15s，切下肿瘤和/或部分舌体组织；
27.步骤e：取下活检穿孔器，用负压吸引器取下切除的肿瘤组织，吸净手术区域血液，并在切除的腔体中放置一块直径为2-4mm的明胶海绵止血；
28.步骤f：待手术区域出血稳定后，取下明胶海绵，在切除的腔体中放入药物或生物材料后，复位周围软组织并缝合皮肤创口；或在放置明胶海绵后直接复位周围软组织并缝
合创口。
29.作为优选，步骤d中，所述活检穿孔器的直径大小根据肿瘤大小确定。
30.本发明还提供一种原位口腔癌动物模型在口腔癌术后辅助治疗实验研究中的应用，所述口腔癌术后辅助治疗包括化疗、放疗或光疗。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
32.(1)建立一个稳定、可重复的原位口腔癌动物模型，操作简便，成瘤时间短，可重复性高，解决现有技术中缺乏原位口腔癌动物模型的问题，易于推广应用。
33.(2)构建原位口腔癌动物模型采用的肿瘤细胞来源灵活，既可以采用人源性/鼠源性肿瘤细胞系，也可以取材于人体口腔癌组织分离出的肿瘤细胞，依据pdx建模流程原位建立人源异种原位移植瘤细胞。
34.(3)肿瘤切除过程操作简单，无需昂贵设备或特殊器械，无复杂外科手术流程，有效规避术中切除界限不清或出血量过多的问题，学习掌握周期较短，术后效果稳定。
35.(4)该原位口腔癌模型切除后，在同一批次实验小鼠中切除肿瘤体积、术后腔体大小一致，适合精准定量给药或放置生物材料，最大程度降低实验小鼠术后治疗的个体间差异或组间差异。
36.(5)肿瘤切除后基本不影响小鼠进食及活动，降低意外死亡率。
37.(6)构建的原位口腔癌术后动物模型符合临床治疗流程、贴近临床实际，尤其适用于口腔癌术后相关辅助治疗的研究工作。
附图说明
38.图1是实施例中构建的原位口腔癌裸鼠动物模型；a：裸鼠成瘤前照片；b：裸鼠成瘤10日后照片；c：裸鼠荧光素酶肿瘤细胞成瘤后10日活体成像示意图。
39.图2是实施例中构建的原位口腔癌裸鼠动物模型；a：术前裸鼠固定于立体定位仪；b：肿瘤部位及手术切口示意图；c：沿切口皮肤翻瓣，暴露肿瘤。
40.图3是实施例中构建的原位口腔癌裸鼠动物模型；a：使用活体穿孔器切除大部分肿瘤组织；b：切除肿瘤后规则圆柱形立体空腔示意图。
41.图4是实施例中构建的原位口腔癌裸鼠动物模型；a：肿瘤切除后空腔内放置凝胶类治疗性材料示意图；b：创口缝合完毕示意图。
42.图5是实施例中构建的原位口腔癌裸鼠动物模型；a：纳米颗粒悬液注射后24小时于肿瘤部位富集(黑色部分)；b：肿瘤切除后，近红外激光照射肿瘤区域；c：热成像仪显示光照区域明显升温。
43.图6是实施例中构建的原位口腔癌裸鼠动物模型；a：肿瘤切除后在空腔内定量放置水凝胶粉末；b：粉末放置完成示意图；c：不同组别裸鼠2周后肿瘤复发情况示意图。
具体实施方式
44.下面结合具体实施例进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
45.实施例1
46.本实施例构建原位口腔癌裸鼠动物模型，步骤如下：
47.步骤1：选择4-6周龄的balb/c裸鼠，常规饲养；
48.步骤2：选择人源性/鼠源性口腔癌细胞系或取材于人体口腔癌组织分离出的肿瘤细胞，细胞培养传至第3-4代；
49.步骤3：使用胰酶对上述第3-4代的口腔癌细胞进行消化并收集，制备细胞密度为5
×
107～1
×
108/ml的pbs细胞悬液，置于冰盒内备用；
50.步骤4：腹腔注射氯胺酮麻醉剂对步骤1中小鼠进行麻醉，注射剂量为10-13mg/kg体重，仰卧位固定；
51.步骤5：使用1ml注射器吸取适量肿瘤细胞悬液，进针点位于小鼠颏部下方中线与舌骨上方2-4mm的交叉点，进针深度为3-6mm，到达舌根部肌肉组织内；
52.步骤6：确认回抽无血，注射肿瘤细胞悬液40-80μl，稳定后缓慢拔出针头；
53.步骤7：小鼠侧卧位放置，确认生命体征、呼吸及吞咽功能无异常；
54.步骤8：观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至40-60mm3时进行手术切除。
55.上述方法中，观察肿瘤生长情况采用如下两种方法之一：a：采用荧光素酶标记的肿瘤细胞进行动物模型构建，并使用活体成像仪记录肿瘤大小；b：采用磁共振成像的方式记录肿瘤生长情况。
56.上述方法中，手术切除肿瘤采用原位肿瘤标准化切除方式，步骤如下：
57.步骤a：腹腔注射氯胺酮麻醉剂对小鼠进行麻醉，注射剂量为10-13mg/kg体重，仰卧位固定于小鼠专用立体定位仪中，充分暴露小鼠颏部下方肿瘤区域；
58.步骤b：沿肿瘤下方边缘1-3mm处画弧形切口线，做一长度0.5-1.0cm切口，切开皮肤及皮下组织；
59.步骤c：分离切口上方皮肤组织瓣，充分暴露肿瘤区域，仔细分离肿瘤表面肌肉组织二腹肌、颏舌骨肌和部分下颌舌骨肌，暴露肿瘤；
60.步骤d：用活检穿孔器(直径大小根据肿瘤大小确定)垂直插入肿瘤中心部位，深度为2-4mm，固位后缓慢旋转10-15s，切下肿瘤和/或部分舌体组织；
61.步骤e：取下活检穿孔器，用负压吸引器取下切除的肿瘤组织，吸净手术区域血液，并在切除的腔体中放置一块直径为2-4mm的明胶海绵止血；
62.步骤f：待手术区域出血稳定，取下明胶海绵，在切除的腔体中放入特定药物或生物材料后，复位周围软组织并缝合皮肤创口，或在放置明胶海绵后直接复位周围软组织并缝合创口。
63.实施例1构建的原位口腔癌裸鼠动物模型如图1-4所示。
64.实施例2
65.本实施例通过构建原位口腔癌裸鼠动物模型验证靶向性纳米颗粒光热治疗方式防止口腔癌术后复发，步骤如下：
66.步骤1、按照实施例1构建原位口腔癌裸鼠动物模型20只，观察肿瘤生长情况1周；
67.步骤2、将实验动物分为四组(n＝5)，分别为：手术组、手术+纳米颗粒组、手术+激光光照组、手术+纳米颗粒+激光光照组；
68.步骤3、制备靶向性纳米颗粒材料并使用pbs液配制混悬液，术前24小时对纳米颗粒组和纳米颗粒+激光光照组的裸鼠进行尾静脉注射纳米颗粒混悬液；
69.步骤4、依据前述的原位肿瘤标准化切除方式对所有裸鼠进行标准化肿瘤切除，切
除腔体内置入明胶海绵，缝合创口；
70.步骤5、使用近红外激光器对肿瘤切除部位进行照射，观察升温情况。
71.对比四组裸鼠肿瘤复发情况，2周后处死裸鼠，解剖复发肿瘤组织并进行比较，结果如图5所示。
72.实施例3
73.本实施例通过构建原位口腔癌裸鼠动物模型验证高分子水凝胶材料缓释化疗药物防止口腔癌术后复发，步骤如下：
74.步骤1、按照实施例1构建原位口腔癌裸鼠动物模型20只，观察肿瘤生长情况1周；
75.步骤2、将实验动物分为四组(n＝5)，分别为：手术组、手术+化疗药物组、手术+空白水凝胶组、手术+化疗药物水凝胶组；
76.步骤3、制备高分子水凝胶冻干粉末，与化疗药物混合后备用；
77.步骤4、依据前述的原位肿瘤标准化切除方式对所有裸鼠进行标准化肿瘤切除，在不同组别裸鼠的切除腔体内分别置入明胶海绵、化疗药物、空白水凝胶粉末或化疗药物混合水凝胶粉末；
78.步骤5、缝合创口，对比四组裸鼠肿瘤复发情况，2周后处死裸鼠，解剖复发肿瘤组织并进行比较，结果如图6所示。
79.上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种原位口腔癌动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：选择4-6周龄的balb/c裸鼠，常规饲养；步骤2：选择人源性/鼠源性口腔癌细胞系或取材于人体口腔癌组织分离出的肿瘤细胞，细胞培养传至第3-4代；步骤3：使用胰酶对上述第3-4代的口腔癌细胞进行消化并收集，制备细胞密度为5
×
107～1
×
108/ml的pbs细胞悬液，置于冰盒内备用；步骤4：腹腔注射氯胺酮麻醉剂对步骤1中小鼠进行麻醉，注射剂量为10-13mg/kg体重，仰卧位固定；步骤5：使用1ml注射器吸取适量肿瘤细胞悬液，进针点位于小鼠颏部下方中线与舌骨上方2-4mm的交叉点，进针深度为3-6mm，到达舌根部肌肉组织内；步骤6：确认回抽无血，注射肿瘤细胞悬液40-80μl，稳定后缓慢拔出针头；步骤7：小鼠侧卧位放置，确认生命体征、呼吸及吞咽功能无异常；步骤8：观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至40-60mm3时进行手术切除。2.根据权利要求1所述原位口腔癌动物模型的构建方法，其特征在于，步骤8中，所述观察肿瘤生长情况采用如下两种方法之一：a：采用荧光素酶标记的肿瘤细胞进行动物模型构建，并使用活体成像仪记录肿瘤大小；b：采用磁共振成像的方式记录肿瘤生长情况。3.根据权利要求1所述原位口腔癌动物模型的构建方法，其特征在于，步骤8中，所述手术切除采用基于原位肿瘤的标准化切除方式，包括如下步骤：步骤a：腹腔注射氯胺酮麻醉剂对小鼠进行麻醉，注射剂量为10-13mg/kg体重，仰卧位固定于小鼠专用立体定位仪中，充分暴露小鼠颏部下方肿瘤区域；步骤b：沿肿瘤下方边缘1-3mm处画弧形切口线，做一长度0.5-1.0cm切口，切开皮肤及皮下组织；步骤c：分离切口上方皮肤组织瓣，充分暴露肿瘤区域，仔细分离肿瘤表面肌肉组织二腹肌、颏舌骨肌和部分下颌舌骨肌，暴露肿瘤；步骤d：用活检穿孔器垂直插入肿瘤中心部位，深度为2-4mm，固位后缓慢旋转10-15s，切下肿瘤和/或部分舌体组织；步骤e：取下活检穿孔器，用负压吸引器取下切除的肿瘤组织，吸净手术区域血液，并在切除的腔体中放置一块直径为2-4mm的明胶海绵止血；步骤f：待手术区域出血稳定后，取下明胶海绵，在切除的腔体中放入药物或生物材料后，复位周围软组织并缝合皮肤创口；或在放置明胶海绵后直接复位周围软组织并缝合创口。4.根据权利要求1所述原位口腔癌动物模型的构建方法，其特征在于，所述活检穿孔器的直径大小根据肿瘤大小确定。5.一种原位口腔癌动物模型在口腔癌术后辅助治疗实验研究中的应用，所述原位口腔癌动物模型通过权利要求1至4任一项所述原位口腔癌动物模型的构建方法得到。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口腔癌术后辅助治疗包括化疗、放疗或光疗。

技术总结
本发明公开了一种原位口腔癌动物模型的构建方法和应用，该构建方法包括：4-6周龄的Balb/c裸鼠常规饲养；人源性/鼠源性口腔癌细胞系或取材于人体口腔癌组织分离出的肿瘤细胞传至第3-4代；用胰酶对口腔癌细胞进行消化并收集，制备PBS细胞悬液备用；腹腔注射氯胺酮麻醉剂进行麻醉，仰卧位固定；注射肿瘤细胞悬液，稳定后缓慢拔出针头；小鼠侧卧位放置，确认生命体征、呼吸及吞咽功能无异常；待肿瘤生长至40-60mm3时手术切除。本发明构建的原位口腔癌动物模型最大程度接近口腔癌的生物学特性，符合口腔癌的临床治疗实际，操作简单可靠、可重复性及标准化程度高，适用于各类口腔癌术后辅助治疗研究。辅助治疗研究。辅助治疗研究。


技术研发人员：郑重阳 黄小娟 胡永杰
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属第九人民医院
技术研发日：2022.12.02
技术公布日：2023/9/22